專(zhuān)利名稱(chēng)：增加腺相關(guān)病毒靶向轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的重組腺相關(guān)病毒及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及重組腺相關(guān)病毒，尤其涉及增加腺相關(guān)病毒(adeno-associated virus)靶向轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的重組四質(zhì)粒腺相關(guān)病毒，本發(fā)明還涉及該重組四質(zhì)粒腺相關(guān)病毒在建立病毒投遞系統(tǒng)以及在組織工程學(xué)中的應(yīng)用，屬于重組腺相關(guān)病毒及其應(yīng)用領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
基因治療從基因角度是用正常有功能的基因置換或增補(bǔ)缺陷基因的方法，從治療方面是將新的遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移至某個(gè)體的細(xì)胞內(nèi)使其獲得治療效果?；蛑委熥鳛橹委熂膊〉囊环N新手段，正愈來(lái)愈受到人們的重視和關(guān)注。從二十世紀(jì)八十年代末，美國(guó)國(guó)家衛(wèi)生研究院的安德生(FrenchAnderson)、布里茲(Michael Blaese)、羅森堡(Steven Rosenberg) 等科學(xué)家共同提出基因治療的臨床實(shí)驗(yàn)申請(qǐng)。到今日，可用于主要包括單基因遺傳病、腫瘤、心血管疾病、神經(jīng)疾病和其他如傳染類(lèi)疾病的各期臨床治療階段，基因治療已取得巨大的成就，但是其本身仍存在缺乏高效傳遞系統(tǒng)，缺少持續(xù)穩(wěn)定的表達(dá)和宿主產(chǎn)生免疫反應(yīng)等問(wèn)題，針對(duì)與這些方面的策略改進(jìn)，成為近來(lái)的研究熱點(diǎn)。病毒具備高效轉(zhuǎn)導(dǎo)宿主細(xì)胞的能力，因而利用基因工程制備的重組病毒載體在針對(duì)多種疾病的基因治療，尤其是單基因酶缺陷型遺傳疾病的替代治療中，成為攜帶外源目的基因在靶向組織中高效表達(dá)的重要手段。目前用于基因治療的重組病毒載體主要包括腺病毒(adenovirus, Ad)、反轉(zhuǎn)錄病毒(retrovirus, RV)、慢病毒(lentivirus, LV)、腺相關(guān)病毒(adeno-associated virus, AAV)及單純皰疫病毒(herpes simplex-virus, HSV)等， 而其中的腺相關(guān)病毒因其無(wú)致病性、低免疫反應(yīng)性、感染宿主譜廣泛、轉(zhuǎn)基因表達(dá)長(zhǎng)效等優(yōu)勢(shì)，成為在基因治療成為應(yīng)用前景最好的載體之一。但AAV基因組存在包裝容量有限、對(duì)多數(shù)組織轉(zhuǎn)導(dǎo)率不盡如人意等主要缺點(diǎn)，成為困擾AAV在臨床應(yīng)用中的瓶頸問(wèn)題。應(yīng)用現(xiàn)代分子生物學(xué)的手段對(duì)AAV進(jìn)行改良，一直是主要的研究熱點(diǎn)。隨著AAV 不同血清型的發(fā)現(xiàn)以及不同亞型的表面結(jié)合受體和組織感染嗜性的相對(duì)特異性，為不同靶向組織的基因治療中尋求最佳的載體類(lèi)型與組合 ，以及基因重組技術(shù)對(duì)AAV衣殼蛋白的改造提供了新的思路和方向。組織工程是為達(dá)到組織重生用來(lái)創(chuàng)建人工器官的一種手段，它所涉及的領(lǐng)域從材料工程一直延伸到生命科學(xué)。一種優(yōu)良的支架材料必須具備以下優(yōu)點(diǎn)(I)有易于設(shè)計(jì)和修飾的基本單元。(2)良好的生物相容性，無(wú)毒，無(wú)抗原性和無(wú)致癌性。(3)適當(dāng)?shù)纳锝到庑?，降解產(chǎn)物可以被生理系統(tǒng)清除。(4)具有能特異促進(jìn)或抑制細(xì)胞-材料相互作用的特性。(5)材料的生產(chǎn)、純化和處理是容易的并可升級(jí)。(6)有與水溶液和生理?xiàng)l件的化學(xué)相容性。其中任何一點(diǎn)都會(huì)限制支架材料的潛在應(yīng)用。近年來(lái)，醫(yī)用生物性可吸收材料在臨床上得到廣泛的應(yīng)用。它主要包括天然材料和合成高分子材料兩大類(lèi)。天然材料包括膠原蛋白，纖維蛋白，殼聚糖，明膠等。高分子材料如聚乳酸類(lèi)，聚乙烯，聚氨酯等。這些材料雖然在臨床應(yīng)用廣泛，但是也具有如降解速度難以控制，吸收性差，與周?chē)M織相容性差等缺點(diǎn)。
針對(duì)這些缺點(diǎn)，研究人員提出了不同的研究策略。目前針對(duì)可吸收性材料的研究方向主要為對(duì)于組織工程支架的改性和復(fù)合，改善現(xiàn)有材料的不足。可以通過(guò)支架上復(fù)合蛋白，也可以將基因整合與支架上。目前多采用質(zhì)粒攜帶基因，但這種策略最大的弊端就是感染效率低下，局部作用特異性差，很難達(dá)到理想的治療效果。
綜上所述，構(gòu)建一株能夠有效增加腺相關(guān)病毒靶向轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的重組腺相關(guān)病毒對(duì)于基因治療的臨床應(yīng)用以及組織工程材料的制備等方面將具有重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是提供一株有效增加腺相關(guān)病毒靶向轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的重組四質(zhì)粒腺相關(guān)病毒；本發(fā)明的目的之二是提供一種構(gòu)建所述增加腺相關(guān)病毒靶向轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的重組四質(zhì)粒腺相關(guān)病毒的方法；本發(fā)明目的之三是將所構(gòu)建的重組四質(zhì)粒腺相關(guān)病毒應(yīng)用于構(gòu)建病毒投遞系統(tǒng)及組織工程學(xué)支架材料等方面。本發(fā)明的上述目的是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的一株增加腺相關(guān)病毒靶向轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的重組四質(zhì)粒腺相關(guān)病毒(FLAG-AAV. Luc)，該重組四質(zhì)粒腺相關(guān)病毒含有經(jīng)過(guò)改造的腺相關(guān)病毒VP2蛋白以及腺相關(guān)病毒原始的VPl蛋白、VP2蛋白和VP3蛋白；其中，所述的經(jīng)過(guò)改造的腺相關(guān)病毒VP2蛋白是腺相關(guān)病毒原始的VP2衣殼蛋白的N末端插入一段FLAG標(biāo)簽序列；所述的編碼腺相關(guān)病毒原始的VP2衣殼蛋白的核苷酸序列為SEQ ID No. I所示；所述的FLAG標(biāo)簽序列的核苷酸序列為SEQ ID No. 2所示。本發(fā)明將所構(gòu)建的重組四質(zhì)粒腺相關(guān)病毒(FLAG-AAV. Luc)提交到專(zhuān)利認(rèn)可的保藏機(jī)構(gòu)進(jìn)行保藏，其微生物保藏號(hào)是=CGMCC No. 5827 ;分類(lèi)命名是重組四質(zhì)粒腺相關(guān)病毒；保藏時(shí)間是2012年3月5日；保藏單位是中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心；保藏地址是北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所。本發(fā)明首先在腺相關(guān)病毒VP2衣殼蛋白的N末端插入一段FLAG標(biāo)簽并構(gòu)建到一個(gè)質(zhì)粒表達(dá)載體中，然后應(yīng)用鑲嵌型衣殼的改良策略在AAV生產(chǎn)體系中同時(shí)提供改造后的 VP2蛋白和三種原始的Cap蛋白(VP1，VP2，VP3)共同參與衣殼的組裝，最終構(gòu)建獲得衣殼上帶有FLAG標(biāo)簽的重組四質(zhì)粒腺相關(guān)病毒。本發(fā)明通過(guò)Western Blot對(duì)重組四質(zhì)粒腺相關(guān)病毒進(jìn)行鑒定，檢測(cè)結(jié)果可見(jiàn)除了能檢測(cè)到VP1，VP2，VP3三種衣殼蛋白外，F(xiàn)LAG-VP2蛋白也可以被檢測(cè)到，實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明本發(fā)明所構(gòu)建的FLAG-AAV. Luc病毒由于含有FLAG-VP2融合蛋白帶有所設(shè)計(jì)的FLAG表位，可以有效感染靶向細(xì)胞并增強(qiáng)轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。本發(fā)明目的之二是提供一種構(gòu)建所述重組四質(zhì)粒腺相關(guān)病毒的方法，包括以下步驟(I)構(gòu)建表達(dá)FLAG-VP2融合蛋白的表達(dá)載體，其中FLAG標(biāo)簽位于VP2衣殼蛋白的N末端；(2)將所構(gòu)建的表達(dá)FLAG-VP2融合蛋白的表達(dá)載體與pHelper、pAAV-RC和含有報(bào)告基因的pAAV載體質(zhì)粒混勻，得到混合液；(3)將混合液感染細(xì)胞，培養(yǎng)細(xì)胞，收集病毒，即得。其中，上述方法中步驟⑵所述的含有報(bào)告基因的pAAV載體質(zhì)粒可選自 pAAV-GFP、pAAV-Luc 或 pAAV-LacZ。
步驟(3)中所述的細(xì)胞優(yōu)選是293T細(xì)胞。為驗(yàn)證Anti-FLAG抗體是否可以有效捕獲本發(fā)明所構(gòu)建的帶有FLAG標(biāo)簽的四質(zhì)粒重組腺相關(guān)病毒，本發(fā)明建立了 AAV的病毒投遞系統(tǒng)；具體的，以固相表面為支持物，通過(guò)膠原覆蓋，交聯(lián)劑活化與特異性抗體交聯(lián)，評(píng)估抗體捕捉效率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，本發(fā)明所構(gòu)建的帶有FLAG標(biāo)簽的四質(zhì)粒重組腺相關(guān)病毒在該投遞體系中比傳統(tǒng)病毒具有更高的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率與靶向性。本發(fā)明以生物性可吸收支架材料為依托，通過(guò)所構(gòu)建的帶有FLAG標(biāo)簽的重組四粒腺相關(guān)病毒可以被特異性抗體有效捕獲這一特性，構(gòu)建得到一種新的AAV的藥物投遞系統(tǒng)，結(jié)果顯示以Anti-FLAG抗體交聯(lián)膠原蛋白包被的多種組織工程材料能夠在有效接種細(xì)胞的前提下顯著提高新型FLAG表位AAV病毒的感染效率。將該投遞系統(tǒng)應(yīng)用與生物可吸收性支架材料，從而有效增加病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因的靶向性和轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，顯示出此系統(tǒng)在組織工程學(xué)研究中具有很好的應(yīng)用前景。


圖I p3XFLAG-CMV-VP2質(zhì)粒的PCR擴(kuò)增后反應(yīng)產(chǎn)物的1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定； 目的條帶為引入Bgl II和Not I酶切位點(diǎn)的VP2片段，大小約為I. 8kbp，DNA序列經(jīng)測(cè)序證實(shí)完全正確。M A -DNA經(jīng)Hind III水解后的Marker ；1 :為無(wú)模板對(duì)照；2和3分別為 pAAV-RC和p3XFLAG-CMV-VP2質(zhì)粒的擴(kuò)增產(chǎn)物。圖2 p3XFLAG-CMV-VP2 質(zhì)粒圖譜。圖3 FLAG-AAV. Luc病毒的Western blot鑒定結(jié)果；紅色為Anti-FLAG抗體雜交信號(hào)，綠色為-BI抗AAV衣殼蛋白抗體雜交信號(hào)；M :蛋白質(zhì)分子量Marker ；1 =FLAG-AAV. Luc 病毒；2 :空白非雜交Loading對(duì)照；3 :傳統(tǒng)三質(zhì)粒AAV. Luc病毒。圖4四質(zhì)粒重組病毒的投遞系統(tǒng)的建立以及感染效率的鑒定結(jié)果。圖5四質(zhì)粒重組病毒的投遞系統(tǒng)的建立以及感染效率的鑒定結(jié)果。圖6有FLAG標(biāo)簽的四質(zhì)粒重組病毒在可吸收材料中的應(yīng)用效果實(shí)驗(yàn)結(jié)果(以 PLGA為固相材料)。圖7有FLAG標(biāo)簽的四質(zhì)粒重組病毒在可吸收材料中的應(yīng)用效果(以明膠海綿為支架材料所進(jìn)行的平行實(shí)驗(yàn))。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而更為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。I.實(shí)驗(yàn)材料I. I 細(xì)胞293T細(xì)胞，HeLa細(xì)胞均為本發(fā)明人實(shí)驗(yàn)室留存。其中293T細(xì)胞源自HEK-293細(xì)胞株，反式表達(dá)腺病毒El基因，當(dāng)共轉(zhuǎn)染三個(gè)AAV制備質(zhì)粒(一個(gè)包含ITR及外源基因的載體質(zhì)粒，一個(gè)含有編碼Rep和Cap蛋白的pAAV-RC，另外一個(gè)含有腺病毒來(lái)源輔助基因的pHelper)時(shí)，可以產(chǎn)生高滴度、有感染活力的腺相關(guān)病毒顆粒I. 2質(zhì)粒及載體p3XFLAG-CMV-10表達(dá)載體購(gòu)自SIGMA公司。包裝病毒所需質(zhì)粒pHelper、pAAV_RC 和含報(bào)告基因的載體質(zhì)粒pAAV-GFP，pAAV-Luc和pAAV-LacZ均購(gòu)自Stratagene公司。I. 3 引物VP2基因引物上下游引物由GENtle軟件設(shè)計(jì)。2.實(shí)驗(yàn)試劑Taq DNA高保真聚合酶大連TaKaRa公司dNTP 大連 TaKaRa 公司Not I Bgl II EcoR V BamH I大連 TaKaRa 公司等限制性?xún)?nèi)切酶HEPES(羥乙基哌嗪乙磺酸)北京博大泰克生物基因技術(shù)有限公司細(xì)菌培養(yǎng)用胰蛋白胨英國(guó)OXFOID公司細(xì)菌培養(yǎng)用酵母提取物英國(guó)OXFOID公司Luciferase細(xì)胞裂解液和底美國(guó)Promega公司物蛋白上樣緩沖液北京博大泰克生物基因技術(shù)有限公司氯化銫MERCKDNaseI MERCK異丙醇北京現(xiàn)代東方精細(xì)化學(xué)品有限公司SDS (十二烷基硫酸鈉)上海生工生物工程有限公司EDTA(乙二胺四乙酸)上海生工生物工程有限公司氯化鉀上海生工生物工程有限公司磷酸二氫鉀上海生工生物工程有限公司磷酸氫二鈉北京益利精細(xì)化學(xué)品有限公司磷酸二氫鈉上海生工生物工程有限公司甘氨酸北京益利精細(xì)化學(xué)品有限公司Tween20 美國(guó) Sigma 公司預(yù)染蛋白Maker 美國(guó)NEB公司Anti-AAV Capsids Clone BI美國(guó) PROGEN 公司antibody Anti-FLAG antibody 美國(guó) Sigma 公司APS (過(guò)硫酸銨):北京欣經(jīng)科生物技術(shù)有限責(zé)任公司Triton X-100 美國(guó) Sigma 公司脫脂奶粉北京欣經(jīng)科生物技術(shù)有限責(zé)任公司丙烯酰胺甲叉丙烯酰胺(29 I)北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限責(zé)任公司0. 22um硝酸纖維素膜美國(guó)Millipore公司超速離心管Beckman Coulter公司Slide-A-Lyzer 透析卡Thermo
脫氧膽酸(deoxycholate，DOC) 北京欣經(jīng)科生物技術(shù)有限責(zé)任公司rAAV病毒本元正陽(yáng)生物技術(shù)有限責(zé)任公司質(zhì)粒小量快速提取試劑盒北京博大泰克生物基因技術(shù)有限公司DNA片段回收純化試劑盒北京博大泰克生物基因技術(shù)有限公司質(zhì)粒大量快速提取試劑盒美國(guó)QIAGEN公司QPCR試劑盒大連TaKaRa公司TEMED(N,N,N/ , N/ -四甲基乙二北京欣經(jīng)科生物技術(shù)有限責(zé)任公司胺)DMEM 美國(guó) HyClone 公司新生牛血清中國(guó)杭州四季青公司胎牛血清中國(guó)杭州四季青公司胰蛋白酶美國(guó)HyClone公司青/鏈霉素北京欣經(jīng)科生物技術(shù)有限責(zé)任公司EDAC(I-乙基_3_(3_ 二甲基胺丙美國(guó)sigma公司基)碳化二亞胺鹽酸鹽)SPDP (3- (2-吡啶二巰基)丙酸 ThermoN-羥基琥珀酰亞胺酯)3.所有主要試劑的配制3. I質(zhì)粒提取常用試劑LB培養(yǎng)液稱(chēng)取細(xì)菌培養(yǎng)用胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl IOg溶于950ml去離子水中， 調(diào)PH值至7.0，再加水定容至1000ml，高壓滅菌，4°C保存。氨芐青霉素以及卡那霉素均配制成濃度為100mg/ml的貯液，通過(guò)0. 22 ii m濾器除菌，分裝。使用時(shí)每100ml LB培養(yǎng)液加 A IOOu I氨芐青霉素或者卡那霉素。LB固體培養(yǎng)基稱(chēng)取1. 5g瓊脂粉溶于100ml LB中，高壓滅菌，待溫度降至50°C時(shí)，在超凈工作臺(tái)中，根據(jù)需要加入氨芐青霉素或卡那霉素，鋪于培養(yǎng)皿中，自然冷卻。封口膜封口，于4°C倒直儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?. 2DNA電泳常用試劑50xTAE 稱(chēng)取Tris 鹽 242g、冰乙酸 57. lml.O. 5mol/L EDTA(pH 8. 0) 100ml，用去離子水定容至1000ml，使用時(shí)，稀釋到I X TAE。6x凝膠加樣緩沖液溴酚藍(lán)0. 25%、二甲苯氰FF0. 25%，蔗糖水溶液40% (w/v)，4°C保存。溴化乙錠溶液稱(chēng)取溴化乙錠lg，加IOOml去離子水，于室溫保存在棕色瓶中。使用終濃度為 0.5 u g/mlo3. 3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染常用試劑0. 25M CaCL 溶液稱(chēng)取27. 75g無(wú)水CaCl2溶于IOOml去離子水中，用0. 2 y m濾膜過(guò)濾分裝，保存在-20°C冰箱待用。2xHBS 溶液稱(chēng)取NaCl 16. 36g、Na2HPO4 Iffi2O 0. 54g、HEPES 11. 92g 溶于 1000ml 去離子水， IM NaOH調(diào)節(jié)pH值到7. I。IM NaOH 稱(chēng)取4g NaOH溶解至80ml去離子水中，溶解后定容至100ml。IM HCl 先用量筒量取8. 36ml濃鹽酸(或直接用天平稱(chēng)9. 86g)，倒入已經(jīng)裝有大約 50-70ml蒸餾水的燒杯中，要不斷攪拌，待冷卻后轉(zhuǎn)移到容量瓶中定容至100ml。3. 4 CsCl密度梯度離心液IM Tris-HCKpH 8.0)稱(chēng)取Tris鹽12. lg，調(diào)PH值至8. 0，定容至100ml，高壓滅菌，4°C保存。0. 5M EDTA (pH 8. 0)稱(chēng)取18. 6g EDTA溶解至80ml去離子水中，溶解后定容至100ml。DNase I buffer 含40mM Tris 鹽、ImM CaCl2UOmM MgSO4，調(diào) PH 值至 8. 0，定容至 200ml，高壓滅菌，
4°C保存。HNE buffer 含50mM Hepes,0. 15M NaCl 和 25mM EDTA 定容至 200ml，高壓滅菌，4°C保存。I. 25r/ih1 CsCl 稱(chēng)取5g CsCl溶解至18ml HNE buffer中，溶解后定容至20ml,高壓滅菌。I. 50/ml CsCl 稱(chēng)取IOg CsCl溶解至18ml HNE buffer中，溶解后定容至20ml,高壓滅菌。誘析液:含NaCl 2mM、HEPES 10mM，用NaOH調(diào)PH值至7. 8，用去離子水定容至1000ml，高
壓滅菌。20 X AAV病毒儲(chǔ)存液:稱(chēng)取I. 015g MgCl2 6H20,加入25ml甘油用透析液溶解并定容至50ml,高壓滅菌，
4°C保存。3. 5SDS-PAGE 電泳10% APS 稱(chēng)取0. Ig過(guò)硫酸銨，去離子水溶解并定容至lml，4°C保存，I周內(nèi)使用。10% SDS 稱(chēng)取5g SDS，去離子水溶解并定容至40ml加熱至68°C助溶，加濃HCl調(diào)pH至7. 2， 加去離水定容至50ml。L 5M Tris HCl (pH8. 8)
稱(chēng)取45.43g Tris鹽，去離子水溶解后，用濃HCl調(diào)節(jié)pH值至8. 8，最后用去離子水定容至250ml，4°C保存。L OM Tris HCl (pH6. 8)
稱(chēng)取30. 29g Tris鹽，去離子水溶解后，用濃HCl調(diào)節(jié)pH至6. 8，最后用去離子水定容至250ml。4°C保存。IOX電泳緩沖液(使用時(shí)稀釋至IX):稱(chēng)取30. 5g Tris鹽、144. 8g 甘氨酸、IOg SDS去離子水定容至IOOOml。3. 6細(xì)胞培養(yǎng)常用試劑DMEM 培養(yǎng)液:購(gòu)買(mǎi)的DMEM培養(yǎng)液根據(jù)需要加入不同比例的血清，4°C保存。0. 25%胰酶消化液:稱(chēng)取胰酶0. 25g溶于100ml D-HankJ s液中，0. 22 y m微孔濾膜過(guò)濾除菌。IxPBS (0. 05M, pH 7. 4)稱(chēng)取Na2HPO4 12H20 3. 58g、KH2PO4 2H20 0. 24g、NaCl 8g、KCl 0. 2g 溶于 1000ml
去離子水，IM HCl調(diào)節(jié)pH值至7. 4，高壓滅菌后超凈臺(tái)內(nèi)放置，冷卻后保存于4°C。青霉素-鏈霉素雙抗:400萬(wàn)單位青霉素和400萬(wàn)硫酸鏈霉素共同加入40ml生理鹽水中，混勻，經(jīng)
0.2iim濾膜過(guò)濾，分裝保存在-20°C冰箱待用，應(yīng)用時(shí)以I : 1000加入新鮮培養(yǎng)基中。3. 7交聯(lián)用試劑的配制膠原:取Img膠原，溶解于0. IM乙酸溶液，室溫放置1-3小時(shí)，使其充分溶解。4°C保存。SPDP 取2mgSPDP 溶解于 320 u 1DMS0,終濃度為 20mM。EDAC 取IOOmgEDAC溶于Iml的去離子水，終濃度為0. lmg/ml。實(shí)施例重組四質(zhì)粒腺相關(guān)病毒(FLAG-AAV. Luc)的構(gòu)建及鑒定I.重組表達(dá)質(zhì)粒p3XFLAG-CMV-VP2的構(gòu)建及鑒定I. I以pAAV-RC為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增VP2序列，弓丨物分別為表I引物序列
I __
VP2 上游弓ITCG ATA GAT ClGATATCG GCT CCG GGA AAA
物AAGAGG (SEQIDNo.3)
VP2 下游弓ICG GGATCCT TAC AGA TTA CGA GTC A (SEQ ID
物No.4)兩斜體字部分分別為人工加入的EcoR V和BamH I酶切位點(diǎn)。I. 2用EcoR V和BamH I分別雙酶切空載體p3XFLAG-CMV_10和PCR擴(kuò)增的VP2 序列，將VP2序列以正確讀碼框與p3XFLAG-CMV-10載體連接，獲得表達(dá)FLAG與VP2融合蛋白的質(zhì)粒 p3 X FLAG-CMV-VP2。I. 3獲得的重組質(zhì)粒載體的鑒定。通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得AAV病毒的VP2序列(圖I)，圖I中箭頭所指處為相應(yīng)序列的目的條帶，切膠將PCR產(chǎn)物用膠回收試劑盒回收，然后再通過(guò)酶切，連接，轉(zhuǎn)化，篩選等一系列分子克隆技術(shù)，獲得P3 X FLAG-CMV-VP2質(zhì)粒，根據(jù)測(cè)序結(jié)果分別繪制質(zhì)粒圖譜(圖2)，鑒定結(jié)果表明本發(fā)明所構(gòu)建的P3XFLAG-CMV-VP2融合蛋白的真核表達(dá)載體成功，并且可用于后續(xù)的病毒包裝。
2. FLAG-AAV. Luc重組病毒的構(gòu)建與鑒定2. I. rAAV 的制備2. I. I磷酸鈣轉(zhuǎn)染(I).待293T細(xì)胞生長(zhǎng)至70%融合度時(shí)進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染前4小時(shí)換10%血清
的新鮮培養(yǎng)基。(2).在一個(gè)無(wú)菌離心管，加入適量2 X HBS (pH 7. 05)溶液。(3).在另一個(gè)無(wú)菌離心管中加入適量0. 25M CaCl2溶液。并按照所需濃度向CaCl2 溶液中分別加入 pHe lper、pAAV-RC 和 pAAV 載體質(zhì)粒(pAAV-GFP 或 pAAV-Luc 或 pAAV-LacZ), 以及第四質(zhì)粒p3 X FLAG-CMV-VP2混勻待用。(4).用無(wú)菌滴管吸取CaCl2和質(zhì)粒混和液，逐滴滴入HBS溶液中，并同時(shí)低速晃動(dòng)離心管避免產(chǎn)生大的Ca3(PO4)2沉淀。(5).加液完畢，可見(jiàn)呈白色透明的云霧狀混懸液，即含三種質(zhì)?；蛩姆N質(zhì)粒的 Ca3 (PO4) 2沉淀液。取出293T細(xì)胞，加入混懸液，混勻。(6).放入37°C 5% CO2孵箱培養(yǎng)過(guò)夜。第二天，吸棄舊培養(yǎng)基，換含2%血清的新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。72h后收集細(xì)胞，處理后進(jìn)行病毒顆粒CsCl密度梯度離心純化。2. I. 2 CsCl密度梯度離心(I).利用移液管直接吹散細(xì)胞，收集細(xì)胞及培養(yǎng)基于干凈的50ml大離心管中， 3000rpm,離心15min,棄上清。(2).每管加入IOmM Tris-HCl (pH 8. 0) 3ml重懸沉淀,將沉淀轉(zhuǎn)移至15ml離心管， 37°C水浴和_80°C反復(fù)凍融3次。(3).超聲 130w，80% AMP，超聲 IOs 暫停 10s，共 6 個(gè)循環(huán)。(4).加入適量 DNase I 2000u/ml 和加入 10 脫氧膽酸(deoxycholate, DOC) 500 u 1，37°C水浴孵育I小時(shí)。(5).在加入 0. 05% Trypsin-EDTA，37°C水浴中作用 0. 5h。(6). 4 °C 7000rpm，離心lOmin，吸取上清液即細(xì)胞裂解液。將細(xì)胞裂解液加入超速離心管中，然后從離心管底部依次加入I. 25g/mlCsCl和
I.50g/ml CsCl,超速離心機(jī)內(nèi) 65000rpm,4°C離心 3h。用注射器的針頭從距離心管底部0. 5cm處扎破管壁，分段收集并編號(hào)。2. I. 3病毒收集液的熒光素酶活性檢測(cè)及透析(I).分別取適量不同編號(hào)的病毒收集液感染24孔板中的293細(xì)胞，感染24h后， 棄上清，每孔加入200 u I熒光素酶細(xì)胞裂解液,充分裂解細(xì)胞后取50 u I加入到15 ii I熒光素酶底物中，置入熒光素酶檢測(cè)儀中檢測(cè)熒光素酶的活性。(2).將熒光素酶活性高的收集液合并后，用注射器將其加入到透析卡中，3h換一次透析液，共換三次，最后一次透析過(guò)夜。(3).第二天，收病毒分裝于1.5ml EP管中，加入20 X AAV病毒儲(chǔ)存液，-20°C保存待用。2. 2.本發(fā)明重組病毒FLAG-AAV. Luc的鑒定為檢測(cè)制備的FLAG-AAV. Luc病毒中是否攜帶改造后的VP2衣殼蛋白，病毒加熱變性后做Western Blot檢測(cè)。分別用Anti-FLAG抗體以及AAV衣殼蛋白的特異性抗體(Clone BI)鑒定病毒衣殼蛋白以及FLAG標(biāo)簽蛋白的表達(dá)情況。2. 2. I傳統(tǒng)三質(zhì)粒病毒與四質(zhì)粒包裝病毒感染情況傳統(tǒng)的三質(zhì)粒包裝病毒(pHelper、pAAV-RC和pAAV載體質(zhì)粒)與本發(fā)明所構(gòu)建的四質(zhì)粒包裝病毒經(jīng)氯化銫密度梯度離心，取少量分段收集液感染293T細(xì)胞24小時(shí)后檢測(cè) Luc蛋白表達(dá)情況，可見(jiàn)采用四質(zhì)粒包裝系統(tǒng)可以生產(chǎn)出有感染活性的病毒顆粒，所測(cè)熒光值最高的收集液是病毒顆粒富集區(qū)。2. 2. 2病毒鑒定結(jié)果 本發(fā)明所構(gòu)建的四質(zhì)粒包裝病毒熱變性后，進(jìn)行8% SDS-PAGE，然后將樣本轉(zhuǎn)于 NC膜上，首先加入FLAG抗體和IRDye 700標(biāo)記的二抗(紅色)用Odyssey紅外成像儀成像，病毒中都能檢測(cè)到單一的一條目的條帶，分別為FLAG-VP2蛋白。然后在同一張NC膜上再次加入AAV衣殼蛋白的特異性抗體(Clone BI)和IRDye800CW標(biāo)記的二抗(綠色)，可見(jiàn)除VP1，VP2，VP3三種衣殼蛋白外，F(xiàn)LAG-VP2蛋白也可以被檢測(cè)到(圖3)。試驗(yàn)結(jié)果表明本發(fā)明所構(gòu)建的FLAG-AAV. Luc病毒由于含有FLAG-VP2融合蛋白，帶有所設(shè)計(jì)的FLAG表位，可以有效感染靶向細(xì)胞(圖3)。試驗(yàn)例I帶有FLAG標(biāo)簽的四質(zhì)粒重組病毒的投遞系統(tǒng)的建立以及感染效率的鑒定I.抗體交聯(lián)系統(tǒng)的建立與優(yōu)化實(shí)驗(yàn)方法首先，對(duì)抗體交聯(lián)系統(tǒng)可行性進(jìn)行評(píng)估。初步驗(yàn)證該系統(tǒng)是否可以攜帶足夠數(shù)量的抗體以及該系統(tǒng)的穩(wěn)定性。以酶標(biāo)板表面為固相支持物，經(jīng)膠原蛋白鋪板后， 用交聯(lián)劑SPDP進(jìn)行活化，然后與辣根過(guò)氧化物酶二抗進(jìn)行交聯(lián)。此后分別用PBS沖洗1-3 次，用DAB辣根過(guò)氧化物酶顯色試劑盒顯色，檢測(cè)吸光度值。2.抗體交聯(lián)體系的初步建立為驗(yàn)證Anti-FLAG抗體是否可以有效捕獲本發(fā)明所構(gòu)建的帶有FLAG標(biāo)簽的四質(zhì)粒病毒，本發(fā)明以康寧48孔板表面為基礎(chǔ)，通過(guò)膠原進(jìn)行包被，然后用交聯(lián)劑SPDP抗體交聯(lián)至表面，然后再進(jìn)行病毒的孵育，制備初步病毒投遞系統(tǒng)雛形。實(shí)驗(yàn)方法I膠原預(yù)處理每Img膠原加入0. ImgEDAC. 37°C IOmins,然后再用膠原包被48孔板。2每孔加入IOul膠原溶于90ul PBS (IOOul的體系足夠覆蓋整個(gè)孔，這樣會(huì)使膠原分布均勻)。紫外下室溫過(guò)夜。3膠原活化每孔加入50ul20mM的SPDP室溫孵育4小時(shí)。4每孔500ulPBS洗I次，每次10分鐘。51% BSA封閉室溫下2小時(shí)。6孵育一抗每孔5mg —抗溶于IOOul PBS中。4°C孵育過(guò)夜。7每孔500ul PBS洗I次，每次10分鐘。
81ul 病毒(10~8-10~9vg)溶于 IOOul PBS 室溫孵育 4 小時(shí)。9每孔500ul PBS洗I次，每次10分鐘。10以Hela細(xì)胞為代表，每孔鋪入大約10~6個(gè)細(xì)胞左右。48小時(shí)后，比較病毒感
染效率。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果通過(guò)以上的技術(shù)路線對(duì)48孔板進(jìn)行包被，實(shí)驗(yàn)組的設(shè)計(jì)分別是未加入一抗的空白對(duì)照組,加入非特異性IgG組和加入Anti-FLAG抗體組。每孔鋪入相同數(shù)量的細(xì)胞48小時(shí)后，用50iU細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，測(cè)定熒光素酶的活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，通過(guò)特異性單抗Anti-FLAG建立的AAV的病毒投遞系統(tǒng)能有效的增加病毒的感染效率。結(jié)果可見(jiàn)交聯(lián)反應(yīng)對(duì)AAV的基礎(chǔ)感染活性無(wú)顯著影響，而經(jīng) Anti-FLAG抗體固相化的AAV感染策略可在一定程度上增加其對(duì)感染靶細(xì)胞的效率。并且在加載FLAG-AAV. Luc病毒2小時(shí)后，接種HeLa細(xì)胞，48小時(shí)后檢測(cè)報(bào)告基因熒光素酶的活性。結(jié)果顯示，經(jīng)抗體固化的新型AAV可增加感染效率3倍以上，并且該效應(yīng)依賴(lài)于特異性的抗原抗體反應(yīng)(圖4-5)。實(shí)驗(yàn)例2本發(fā)明帶有FLAG標(biāo)簽的四質(zhì)粒重組病毒在可吸收材料中的應(yīng)用I. PLGA實(shí)驗(yàn)方法以聚乳酸-輕基乙酸共聚物(poly (lactic-co-glycolicacid), PLGA)(購(gòu)于山東省醫(yī)療器械廠)為固相材料，用EDAC活化lmg/ml膠原包被，室溫下干燥。20mM的SPDP室溫孵育4小時(shí)，PBS沖洗后進(jìn)行抗體固定化。用非特異性抗體IgG(50mg/ml)為陰性對(duì)照組， Anti-FLAG單抗(50mg/ml)為陽(yáng)性對(duì)照組，4°C孵育過(guò)夜。PBS沖洗后分別室溫下孵育AAV. LacZ和FLAG-AAV. LacZ2小時(shí)。PBS沖洗后，加入Hela細(xì)胞懸液，附著2小時(shí)后，加入10% FBS培養(yǎng)48小時(shí)后，用P -半乳糖苷酶原位染色試劑盒染色，顯微鏡下采圖。具體實(shí)驗(yàn)組別見(jiàn)表2。表2
~圖6A~圖6B~圖6C~圖6D
IgGAnti-FLAG 單抗 IgGAnti-FLAG 單抗
AAV. LacZAAV. LacZFLAG-AAV. LacZFLAG-AAV. LacZ以活化的PLGA為固相表面，分別孵育交聯(lián)Anti-FLAG特異性抗體和非特異性混合 IgG抗體，并分別加載FLAG-AAV. LacZ或傳統(tǒng)的AAV. LacZ。接種Hela細(xì)胞48小時(shí)后，進(jìn)行 LacZ染色比較轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的差異。實(shí)驗(yàn)結(jié)果病毒感染48小時(shí)后，進(jìn)行￠-半乳糖苷酶染色。光鏡下采圖顯示，與非特異性抗體組比較，Anti-FLAG單抗組能有效捕捉本發(fā)明所構(gòu)建的含有FLAG標(biāo)簽的四質(zhì)粒病毒(圖 6)。結(jié)果顯示組織工程材料經(jīng)特異性的抗體交聯(lián)修飾后能夠富集和固化FLAG-AAV. LacZ病毒，且有效提聞對(duì)如脂肪細(xì)胞等接種細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。2明膠海綿
實(shí)驗(yàn)方法以可吸收性明膠海綿為固相材料，用EDAC活化lmg/ml膠原包被，室溫下干燥。20mM的SPDP室溫孵育4小時(shí)，PBS沖洗后進(jìn)行抗體固定化。用非特異性抗體IgG(50mg/ml)為陰性對(duì)照組，Anti-FLAG單抗(50mg/ml)為陽(yáng)性對(duì)照組，4°C孵育過(guò)夜。PBS沖洗后分別室溫下孵育AAV. LacZ和FLAG-AAV. LacZ2小時(shí)。PBS沖洗后，加入Hela細(xì)胞懸液，附著2小時(shí)后，加入10% FBS培養(yǎng)48小時(shí)后，用￠-半乳糖苷酶原位染色試劑盒染色，顯微鏡下采圖。具體實(shí)驗(yàn)組別見(jiàn)表3。表權(quán)利要求
1.增加腺相關(guān)病毒靶向轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的重組四質(zhì)粒腺相關(guān)病毒，其特征在于含有經(jīng)過(guò)改造的腺相關(guān)病毒VP2蛋白以及腺相關(guān)病毒原始的VPl蛋白、VP2蛋白和VP3蛋白；其中，所述經(jīng)過(guò)改造的腺相關(guān)病毒VP2蛋白是腺相關(guān)病毒VP2衣殼蛋白的N末端插入一段FLAG標(biāo)簽序列；所述編碼腺相關(guān)病毒VP2衣殼蛋白基因的核昔酸序列為SEQ ID No. I所不；所述的 FLAG標(biāo)簽序列的核苷酸序列為SEQ ID No. 2所示。
2.按照權(quán)利要求I所述的重組四質(zhì)粒腺相關(guān)病毒，其特征在于其微生物保藏號(hào)是 CGMCC No. 5827。
3.一種構(gòu)建權(quán)利要求I或2所述重組四質(zhì)粒腺相關(guān)病毒的方法，包括以下步驟(1)構(gòu)建表達(dá)FLAG-VP2融合蛋白的表達(dá)載體，其中FLAG標(biāo)簽位于VP2衣殼蛋白的N末端；(2)將所構(gòu)建的表達(dá)FLAG-VP2融合蛋白的表達(dá)載體與pHelper、pAAV-RC和含有報(bào)告基因的pAAV 載體質(zhì)?；靹蚬哺腥炯?xì)胞，培養(yǎng)細(xì)胞，收集病毒，即得。
4.按照權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于步驟(2)中所述的含有報(bào)告基因的pAAV 載體質(zhì)粒包括 pAAV-GFP、pAAV-Luc 或 pAAV_LacZ。
5.按照權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于步驟(2)中所述的細(xì)胞是293T細(xì)胞。
6.權(quán)利要求I或2所述重組四質(zhì)粒腺相關(guān)病毒在制備基因治療藥物中的用途。
7.權(quán)利要求I或2所述重組四質(zhì)粒腺相關(guān)病毒在制備組織工程支架材料中的用途。
8.一種病毒投遞系統(tǒng)或載體，其特征在于含有權(quán)利要求I或2所述的重組四質(zhì)粒腺相關(guān)病毒。
9.一種基因治療投遞系統(tǒng)或載體，其特征在于含有權(quán)利要求I或2所述的重組四質(zhì)粒腺相關(guān)病毒。
10.一種組織工程材料或支架，其特征在于含有權(quán)利要求I或2所述的重組四質(zhì)粒腺相關(guān)病毒。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了增加腺相關(guān)病毒靶向轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的重組腺相關(guān)病毒及其應(yīng)用。所述重組腺相關(guān)病毒含有經(jīng)過(guò)改造的腺相關(guān)病毒VP2蛋白以及腺相關(guān)病毒原始的VP1蛋白、VP2蛋白和VP3蛋白；其中，所述經(jīng)過(guò)改造的腺相關(guān)病毒VP2蛋白是VP2衣殼蛋白的N末端插入一段FLAG標(biāo)簽序列。本發(fā)明進(jìn)一步公開(kāi)了所述重組腺相關(guān)病毒的構(gòu)建方法及其在基因治療和制備組織工程支架材料中的應(yīng)用。本發(fā)明所構(gòu)建的重組腺相關(guān)病毒含有FLAG表位，可有效感染靶向細(xì)胞并增強(qiáng)轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。本發(fā)明重組腺相關(guān)病毒比現(xiàn)有的病毒載體具有更高的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率與靶向性，能夠應(yīng)用于基因治療、建立病毒投遞系統(tǒng)及制備組織工程支架材料等方面。
文檔編號(hào)C12N15/34GK102618507SQ201210080140
公開(kāi)日2012年8月1日 申請(qǐng)日期2012年3月23日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月23日
發(fā)明者丁衛(wèi), 吳巍, 牛靜, 石文潔, 鄭少鵬 申請(qǐng)人:首都醫(yī)科大學(xué)