專利名稱：一種造血干/祖細胞的體外擴增體系的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種造血干/祖細胞的體外培養方法，尤其是一種血管內皮細胞靶向的Notch配體的可溶性融合蛋白hDlll-RGD體外擴增人臍血的造血干/祖細胞的體外擴增體系，屬于生物技術領域。
背景技術：
目前造血干細胞移植已經成為臨床治療血液病和惡性腫瘤的重要手段之一，由于臍血來源豐富、采集方便、免疫原性弱，較骨髓和外周血移植有更多優勢。但是，臍血中造血干/祖細胞含量較低，難以滿足成年及體重較大患者的需要，移植后造血重建延遲，很難收到滿意的療效，已嚴重限制其在臨床中的應用。如何高效率地通過體外擴增的方法獲取足量的造血干細胞以滿足臨床需要，已成為一個亟待解決的問題。既往研究顯示傳統的細胞因子組合的體外擴增體系在促進造血干/祖細胞增殖的同時，也加快了其分化成熟的進程，喪失了造血干/祖細胞的自我更新及造血重建的潛能，無法維持長期造血；隨著對造血微環境中調控造血干細胞增殖和自我更新的分子機制的認識為體外擴增造血干細胞提供了新的思路。在體內，造血微環境通過細胞間密切接觸以及各類造血調控因子維持造血干細胞自我更新和多系分化的潛能。因此，模擬造血干細胞生長的微環境，成為了提高體外擴增效率重要方法之一。大量研究表明，Notch信號途徑是調控干細胞增殖分化重要的信號通路之一，造血干細胞與造血微環境的基質細胞表面分別表達Notch受體和配體，激活Notch信號通路能夠促進HSC的自我更新，并抑制不分化。近年來有多個研究組先后表達了 Dlll的DSL結 構域片段，激活活性不佳，擴增效果非常有限，其主要原因是Notch受體和配體都是細胞表面蛋白，只有將Notch配體表達在細胞表面或固相化在培養介質表面上才能有效發揮刺激Notch受體的作用。自行研發的hDlll-RGD是帶血管內皮細胞靶向蛋白質基序RGD的可溶性融合蛋白，其中RGD是以精氨酸(R)-甘氨酸(G)-門冬氨酸(D)為核心的多肽，可以特異識別血管內皮細胞表面的整合素分子，從而將與之融合的蛋白分子錨定于血管內皮細胞表面。以HUVEC為支持細胞，不僅可以有效的激活Notch信號通路，而且模擬了臍血造血干/祖細胞生長微環境，具有最佳的擴增效率。目前未見此擴增體系的報道。

發明內容
本發明的目的是彌補現有技術的不足，提供一種造血干/祖細胞的培養方法，尤其是涉及一種可溶性融合蛋白Notch配體hDlll-RGD體外擴增人臍血的造血干/祖細胞的體外擴增體系。本發明采用的是以人臍靜脈內皮細胞作為培養體系的支持細胞，聯合應用外源性生長因子SCF、ΤΡ0、FL、IL-6、IL-3及自行研發的hDlll-RGD，與造血干/祖細胞共培養，為提高造血干/祖細胞體外擴增的效率提供一種新的方法。本發明的目的通過以下方案實現一種造血干/祖細胞的體外擴增體系，其特征是通過可溶性融合蛋白hDlll-RGD革巴向結合于臍靜脈內皮細胞Human umbilical veinendothelial cells, HUVEC表面,激活Notch受體,擴增人臍血造血干/祖細胞,包括下述步驟
1)臍靜脈內皮細胞融合90%后，經絲裂霉素C處理2.5h，洗滌；
2)將經步驟I)后的臍靜脈內皮細胞中加入無血清培養液；
3)往步驟2)的培養液中加入五 種外源性生長因子5GF及可溶性融合蛋白hDlll-R⑶，建立造血干/祖細胞的體外擴增體系；
4)從臍血中分離、純化造血干/祖細胞⑶34+，種植到步驟3)建立的擴增體系，37°C、5%C02全濕培養箱中培養7天；
5)采用N0D/SCID小鼠移植模型評估經擴增后的人臍血造血干/祖細胞；
6)通過造血干/祖細胞集落形成實驗評估經擴增后的人臍血造血干/祖細胞向多系分化的能力。步驟2)所述的無血清培養液是StemSpan 無血清培養液。步驟3)所述的外源性生長因子5GF包括SCF、TPO、FL、IL_6、IL-3，可溶性融合蛋白 hDlll-R⑶。步驟I)所述的臍靜脈內皮細胞的培養液為M199，20%胎牛血清，30 μ g/mL ECGS0步驟I)所述的絲裂霉素C的濃度10 μ g/mL。所述的外源性生長因子SCF、TP0、FL、IL-6、IL-3的濃度分別為120ng/ mL、20ng/mL、50ng/ mL、5ng/mL、5ng/mL,可溶性融合蛋白 hDlll-RGD 的濃度2· 5ug/mL。步驟5)所述的N0D/SCID小鼠移植模型評估造血干/祖細胞方法采用亞致死劑量照射N0D/SCID小鼠，4h內經尾靜脈注射擴增后的人臍血造血干/祖細胞，移植后第4w、8w檢測人源性造血細胞植入的能力。步驟6)所述的造血干/祖細胞集落形成實驗，采用經擴增后的人臍血造血干/祖細胞接種于甲基纖維素半固體培養基，于第14天倒置顯微鏡下計數集落形成單位，評估經擴增后的人臍血造血干/祖細胞向多系分化的能力。本發明的特點是通過模擬體內造血干/祖細胞生長的微環境，應用hDlll-R⑶可以靶向結合于臍靜脈內皮細胞表面，向造血干/祖細胞提供針對Notch受體的激活型刺激，從而達到理想的體外擴增造血干/祖細胞的效果，而且擴增后的造血細胞具有良好的造血重建能力，說明了擴增后的細胞仍然保持著造血干細胞的特性，具有廣闊的臨床應用前景。


為了便于理解，通過說明書附圖對本發明進行詳細描述
圖I :不同培養條件下擴增臍血CD34+總細胞數；
圖2 :不同培養條件下流式細胞儀檢測的擴增細胞中CD34+細胞的比例；
圖3 :流式細胞儀對hDlll-RGD擴增后細胞表面標志CD34進行檢測；
圖4 :不同培養條件下臍血CD34+細胞的擴增倍數；
圖5 :不同培養條件下擴增的細胞形成的造血集落擴增倍數；
圖6 N0D/SCID小鼠移植經不同條件培養的細胞后，第4周小鼠外周血人源性CD45+細胞的比例；圖7 NOD/SCID小鼠移植經不同條件培養的細胞后，第8周小鼠外周血人源性CD45+細胞的比例；
圖8、NOD/SCID小鼠移植經不同條件培養的細胞后，第8周流式細胞儀對小鼠外周血人源性⑶45+細胞進行檢測。
具體實施方式
實施例(一)實驗材料
(O人臍靜脈內皮細胞按下述方法培養
(2)臍帶血來源于第四軍醫大學唐都醫院婦產科
(3)試劑
M199、胎牛血清Gibco公司
StemSpan 無血清培養液、MethoCult GF H4434 :Stemcell 公司
內皮細胞生長添加劑 Endothelial Cell Growth Supplement (ECGS) : Sigma 公司
牛血清白蛋白 Bovine Serum Albumin (BSA) :Sigma 公司
II型膠原酶Sigma公司
絲裂霉素C =Sigma公司
CD34 MicroBead Kit Miltenyi 公司
分離 buffer PBS+2mM EDTA+0. 5% BSA
淋巴細胞分離液=TBD公司
PBSA PBS + 2mM EDTA
SCF (stem cell factor):重組人 SCF, Peprotech 公司 TPO (thrombopoietin):重組人 TPO, Peprotech 公司 FL (flt3 ligand):重組人 FL, Peprotech 公司 IL-6 (interleukin-6):重組人 IL-6, Peprotech 公司 IL-3 (interleukin-3):重組人 IL-3, Peprotech 公司 hDlll-RGD蛋白本研究室自行研發 FITC標記抗人⑶34單克隆抗體BD Biosciences公司 APC標記抗人0)45單克隆抗體BD Biosciences公司 FITC標記抗鼠CD45單克隆抗體BD Biosciences公司 N0D/SCID小鼠購于北京華阜康生物科技股份有限公司 (二)實驗方法 I、人臍靜脈內皮細胞的培養
取人臍帶靜脈，分離、培養出臍靜脈內皮細胞；臍靜脈內皮細胞培養液為M199，20%胎牛血清，30 μ g/mL ECGS。具體操作是在無菌條件下，取健康產婦分娩后2h內的臍帶，長約20 cm,剪去臍帶兩端鉗夾處。于臍靜脈一端插入針頭，用PBSA完全沖洗至無血跡后，止血鉗夾緊臍靜脈遠端，用O. 2%膠原酶溶液IOmL充滿靜脈，37°C孵育20min后，輕輕按摩臍帶，將消化液收集入離心管，用30mL PBSA沖洗臍靜脈2次，將沖洗液一同收集入離心管，1500rpm離心lOmin，棄上清液，加入臍靜脈內皮細胞完全培養液重懸細胞，計數后，以IX 105/mL細胞接種到24孔板中，每孔加入完全培養液，24h除去未貼壁的細胞，每3天更換新鮮培養液，直至細胞生長至約90 %融合，進行細胞傳代，取第Γ5代臍靜脈內皮細胞作為支持細胞，進行后續實驗。2、臍血⑶34+細胞分離純化
肝素抗凝的臍血用PBSA按1:1比例稀釋，將稀釋的臍血緩慢加入淋巴細胞分離液上，20° C、1500rpm離心15分鐘，在淋巴細胞分離液液面上明顯可見環狀乳白色細胞層，小心吸取細胞層細胞，PBSA洗滌2次，PBS懸浮細胞計數。每IO8單個核細胞用300 μ L分離buffer重懸，細胞懸液分別加入FcR阻斷劑、⑶34磁珠各100 μ L、充分混勻、4° C冰箱孵育30分鐘,分離buffer洗漆,棄上清。用500 μ L分離buffer懸浮細胞。將MS分離柱固定于MACS分離儀的磁場內，用500 μ L分離buffer濕潤分離柱，將細胞懸液緩慢貼壁加入分離柱，使未結合的細胞通過分離柱。用分離buffer將未結合的細胞洗去(500 μ LX 3次)， 將分離柱移出磁場，用ImL分離buffer加壓洗脫，PBSA洗滌CD34+細胞，并計數備用。3、臍血造血干/祖細胞的體外擴增
用M199培養液(含20%FBS、30 μ g/mL ECGS)培養的人臍靜脈內皮細胞，種入24孔板，融合約90%后，經絲裂霉素C處理2. 5h，PBS洗滌3次后加入StemSpan 無血清培養液，然后往培養體系內加入SCF、TPO、FL、IL-6、IL-3、可溶性融合蛋白hDlll-RGD (濃度分別為120ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、5ng/mL、5ng/mL、2. 5ug/mL),建立新的造血干 / 祖細胞的培養體系備用。將分離純化的CD34+細胞，種植到上述含臍靜脈內皮細胞支持的無血清培養體系，置37°C、5%C02全濕培養箱中培養7天。離心收集培養體系中的懸浮細胞，臺盼藍染色計算活細胞數，流式細胞儀檢測CD34+細胞的比例，計算CD34+細胞的擴增倍數，接種人集落形成實驗的培養基中，并準備移植給NOD/SCID小鼠。4、造血干/祖細胞的檢測
離心收集培養體系中的懸浮細胞，用PBS洗滌2次，并配成I X IOVmL細胞濃度，取50 μ L細胞懸液離心，然后加入O. 5 μ L FITC標記抗人⑶34單克隆抗體，避光，4°C孵育30min，然后加入ImL流式液(含5%胎牛血清，O. 2% NaN3的？85)將細胞懸起，離心1300rpm，5min,重復洗漆一遍。上流式細胞儀FACScalibur進行檢測，以Cellquest軟件進行獲取和分析。5、造血干/祖細胞集落形成實驗
收集離心培養體系中懸浮細胞，PBS洗兩次，以103/mL懸于I. ImL甲基纖維素半固體培養基H4434種于直徑35mm培養皿中，每個標本作I個復孔。培養時將2個相同標本的小培養皿,與I個僅加無菌水且無蓋的小培養皿，同置于I個直徑IOcm的大培養皿中。置于37°C、5%C02全濕培養箱培養14天后于倒置顯微鏡下觀察，大于50個細胞的細胞團被計為I個集落形成單位(Colony-forming unit, CFU)。于第14天倒置顯微鏡下計數CFU (爆式紅系集落形成單位BFU-E、粒系集落形成單位CFU-GM、混合系集落形成單位CFU_Mix)。6、NOD/SCID小鼠移植模型
N0D/SCID小鼠，雌性，6-8W，飼養于無菌籠中，飼以高壓無菌的飲食，移植前300cGy亞致死劑量放射線全身照射，4小時內經尾靜脈注射進行移植實驗。實驗分組1、5GF組移植經以人臍靜脈內皮細胞作為支持細胞，聯合應用五種生長因子培養7天的細胞，平均每只小鼠移植2X IO7 ;2、hDlll-RGD組移植經以人臍靜脈內皮細胞作為支持細胞，聯合應用五種生長因子及hDlll-R⑶的無血清共培養體系培養7天的細胞，平均每只小鼠移植2X107，每組8只小鼠。移植后觀察小鼠人源性CD45+細胞的植入的情況。移植后第4周，剪小鼠尾尖取血，流式細胞儀檢測小鼠外周血人源性CD45+細胞的比例。移植后第8周，摘眼球取外周血，頸椎脫白法處死小鼠，取小鼠骨髓細胞，接種人集落形成實驗的培養基中，檢測人源性造血細胞集落形成能力。
(I )、N0D/SCID小鼠外周血人源性⑶45+細胞檢測
于移植后第4w、8w采集小鼠外周血經肝素抗凝血，取50 μ L全血，紅細胞裂解后，用PBS洗滌2次，并配成I X IOVmL細胞濃度，取50 μ L細胞懸液離心，然后加入O. 5 μ L FITC標記抗人⑶45單克隆抗體和O. 5 μ L APC標記抗鼠⑶45單克隆抗體，避光，4°C孵育30min，然后加入ImL流式液(含5%胎牛血清,O. 2% NaN3的PBS)將細胞懸起,離心1300rpm, 5min。重復洗漆一遍。上流式細胞儀FACScalibur進行檢測，以Cellquest軟件進行獲取和分析，以人源性⑶45+細胞> 1%為移植成功。(2)、N0D/SCID小鼠人源性造血細胞集落形成實驗
于移植后第8周，頸椎脫臼法處死小鼠，取小鼠骨髓細胞，紅細胞裂解后，用PBS洗滌2次，以IXlOVmL懸于I. ImL甲基纖維素半固體培養基H4434種于直徑35mm培養皿中，每個標本作I個復孔。培養時將2個相同標本的小培養皿,與I個僅加無菌水且無蓋的小培養皿，同置于I個直徑IOcm的大培養皿中。置于37°C、5%C02全濕培養箱培養14天后于倒置顯微鏡下觀察，大于50個細胞的細胞團被計為I個集落形成單位(Colony-forming unit,CFU)。于第14天倒置顯微鏡下計數CFU (爆式紅系集落形成單位BFU-E、粒系集落形成單位CFU-GM、混合系集落形成單位CFU-Mix)。實驗數據以平均值土標準差(X 土 s)表示，采用SPSS17. O軟件進行統計分析，兩組間比較采用t檢驗，組間差異采用方差分析，P < O. 05認為有統計學意義。本發明的效果通過以下檢測和驗證方法進行進一步說明
I、擴增體系下造血干/祖細胞⑶34+的擴增
從臍血中分離純化⑶34+，以2X IOVmL種于各組不同擴增體系進行培養，于第7天收集離心懸浮細胞，進行細胞計數，CD34+細胞的擴增效果參見表1，各組CD34+細胞獲得大量擴增，并以hDlll-RGD組擴增效果最佳(見圖I, Χθ. 01)，CD34.擴增約67. 50±3. 03倍(見圖4廣/X0. 01)。而且以hDlll-R⑶組保持造血干細胞特性效果較其他組有明顯優勢，約66. 12%依舊保持⑶34+的表型(見圖2、圖3)。5GF組為單用五種生長因子進行擴增；HUVEC組為以HUVEC作為支持細胞，加用五種生長因子進行擴增；hDlll-RGD組為以HUVEC作為支持細胞，同時加用五種生長因子和hDlll-RGD進行擴增)。
權利要求
1.一種造血干/祖細胞的體外擴增體系，其特征是通過可溶性融合蛋白hDlll-RGD革巴向結合于胳靜脈內皮細胞Human umbilical vein endothelial cells,HUVEC表面,激活Notch受體，擴增人臍血造血干/祖細胞，包括下述步驟 1)臍靜脈內皮細胞融合90%后，經絲裂霉素C處理2.5h，洗滌； 2)將經步驟I)后的臍靜脈內皮細胞中加入無血清培養液； 3)往步驟2)的培養液中加入五種外源性生長因子5GF及可溶性融合蛋白hDlll-R⑶，建立造血干/祖細胞的體外擴增體系； 4)從臍血中分離、純化造血干/祖細胞⑶34+，種植到步驟3)建立的擴增體系，37°C、5%C02全濕培養箱中培養7天； 5)采用N0D/SCID小鼠移植模型評估經擴增后的人臍血造血干/祖細胞； 6)通過造血干/祖細胞集落形成實驗評估經擴增后的人臍血造血干/祖細胞向多系分化的能力。
2.根據權利要求I所述的造血干/祖細胞的體外擴增體系，其特征是步驟2)所述的無血清培養液是StemSpan 無血清培養液。
3.根據權利要求I所述的造血干/祖細胞的體外擴增體系，其特征是步驟3)所述的外源性生長因子5GF包括SCF、TPO、FL、IL_6、IL-3，可溶性融合蛋白hDlll-R⑶。
4.根據權利要求I所述的造血干/祖細胞的體外擴增體系，其特征是步驟I)所述的臍靜脈內皮細胞的培養液為M199，20%胎牛血清，30 μ g/mL ECGS0
5.根據權利要求I所述的造血干/祖細胞的體外擴增體系，其特征是步驟I)所述的絲裂霉素C的濃度10 μ g/mL。
6.根據權利要求3所述的造血干/祖細胞的體外擴增體系，其特征是所述的外源性生長因子 SCF、TP0、FL、IL-6、IL-3 的濃度分別為120ng/ mL、20ng/mL、50ng/ mL、5ng/mL、5ng/mL,可溶性融合蛋白hDlll-RGD的濃度2. 5ug/mL。
7.根據權利要求I所述的造血干/祖細胞的體外擴增體系，其特征是步驟5)所述的N0D/SCID小鼠移植模型評估造血干/祖細胞方法采用亞致死劑量照射N0D/SCID小鼠，4h內經尾靜脈注射擴增后的人臍血造血干/祖細胞，移植后第4w、8w檢測人源性造血細胞植入的能力。
8.根據權利要求I所述的造血干/祖細胞的體外擴增體系，其特征是步驟6)所述的造血干/祖細胞集落形成實驗，采用經擴增后的人臍血造血干/祖細胞接種于甲基纖維素半固體培養基，于第14天倒置顯微鏡下計數集落形成單位，評估經擴增后的人臍血造血干/祖細胞向多系分化的能力。
全文摘要
本發明提供一種血管內皮細胞靶向的Notch配體的可溶性融合蛋白人Dll1-RGD(hDll1-RGD)體外擴增人臍血的造血干/祖細胞的體外擴增體系，是以人臍靜脈內皮細胞作為培養體系的支持細胞，聯合應用外源性生長因子SCF、TPO、FL、IL-6、IL-3及自行研發的hDll1-RGD，與造血干/祖細胞共培養，構成了一種體外擴增的有效體系。在本發明中通過hDll1-RGD靶向結合于臍靜脈內皮細胞表面，向造血干細胞提供針對Notch受體的激活型刺激，維持造血干細胞的自我更新和增殖，從而獲得了滿意的擴增效果及良好的植入能力。
文檔編號C12N5/0789GK102643784SQ20121008722
公開日2012年8月22日 申請日期2012年3月29日 優先權日2012年3月29日
發明者梁英民, 田登梅, 韓驊 申請人:中國人民解放軍第四軍醫大學