專利名稱：檢測耳聾相關基因gjb3基因突變的試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明屬生命科學和生物技術領域，特別是一種檢測耳聾相關基因GJB3基因突變的試劑盒。
背景技術：
在中國，聽障人群超過2千萬，兒童患者約80萬，且每年新發耳聾患兒8萬名。這些患者大都患有嚴重影響交流且治療困難的感音神經性耳聾，其中遺傳因素所致耳聾占50%以上。按照不同的遺傳方式可將遺傳性耳聾分為1，常染色體顯性遺傳性聾；2，常染色體隱性遺傳性聾；3，線粒體基因突變引起的耳聾；4，伴性遺傳性聾。一般認為，耳聾患者中50%是由遺傳物質發生改變導致的。在我國除GJB2、SLC26A4和mtDNA12s rRNA (線粒體XLT)基因突變導致的耳聾外，GJB3也是導致耳聾的原因之一。GJB3基因定位于人類染色體lp33- p35，其完整的編碼序列包含由813個核苷酸組成的開放閱讀框、位于啟始密碼子ATG上游25個核苷酸處的剪切點、以及3’端非翻譯區。編碼有270個氨基酸的縫隙連接蛋Connex-in31，全長3617bP，Cx31分子量為30. 8kD。蛋白質結構分析確定其為P-縫隙連接蛋白。每個胞外環包含3個保守的半胱氨酸殘基。編碼ConneX-in31的基因(GJB3)。縫隙連接分布廣泛，幾乎存在于所有的動物細胞中。縫隙連接是由連接蛋白形成的、連接相鄰細胞的親水性跨膜通道，介導細胞間通訊。內耳中的縫隙連接主要存在于非感覺上皮細胞各亞群間。其中包括耳蝸內的支持細胞和連接組織細胞如螺旋韌帶中的纖維細胞、血管紋的基底細胞及中間細胞等。縫隙連接蛋白基因突變影響鉀離子循環途徑，從而影響內淋巴電位，最終導致毛細胞功能異
堂
巾oGJB3基因突變可以引起常染色體顯性或者隱性遺傳非綜合征耳聾。如第547位堿基G — A突變，導致第183號氨基酸有谷氨酸變成賴氨酸；第538位堿基的C — T突變，導致第180號氨基酸變為終止密碼子；第423位堿基A — G的突變，導致第141號氨基酸由異亮氨酸變成纈氨酸。

發明內容
本發明的目的在于，提供一種檢測耳聾相關基因GJB3基因突變的試劑盒，可用于檢測GJB3基因突變位點。檢測耳聾相關基因GJB3基因突變的試劑盒，其特征在于，包括
(i)PCR擴增反應試劑；
(ii)用于擴增樣本DNA中GJB3基因的PCR引物JB3上游引物序列GGTCGTTGTGAGTATTGAAC ；GJB3 下游引物序列AGGTCCTACAGGGGCTG AGTGACCC。進一步地，所述試劑盒的使用方法包括如下步驟
(i)采集待測血液樣本，提取DNA ；
(ii)以該DNA為模板，用所述用于擴增樣本DNA中GJB3基因的PCR引物進行PCR擴增，得到PCR反應產物；
(iii )對PCR反應產物測序，與GJB3正常基因序列進行比較，確定是否存在第547個堿基G — A突變位點、第538堿基C — T突變位點、第423-425堿基ATT缺失位點或第423堿基A —G突變位點。步驟(ii)的PCR反應按以下條件進行擴增94 V 2 min ；98 V IOs,66 V30s,68 °C 40s、16 個循環；98 V 10s,60 V 30s,68 V 40s、20 個循環；68 V 6min。由于中國人GJB3基因中547 G —A、538 C — T突變導致染色體顯性非綜合征耳聾；423 A —G導致隱性非綜合征耳聾。因此可以通過同野生型樣品的GJB3基因中上述位 點進行比對，設計合適的正反向引物對GJB3基因進行擴增，并對擴增產物進行直接測序。可用于判斷是否存在547 G —A、538 C — T、423 A —G突變。本發明試劑盒中用于擴增GJB3基因的PCR引物，其中正向引物GJB3的3’末端位于如序列SEQ ID NO: I所示的GJB3基因編碼區上游約138bp處，反向引物GJB3的3’端位于該編碼區的下游約906bp處，正反相引物大小分別為20bp，25bp，并能完全擴增GJB3基因編碼區。SEQ ID NO: I給出了 GJB3編碼區的基因序列。上述引物通過如下的方案進行設計使用Primer 6. Or軟件協助設計引物，通過PCR擴增，將GJB3編碼區完全擴增，然后進行直接測序，通過測序檢測547 G —A、538C — T、423 A-G位點是否發生突變。GJB3 上游引物序列GGTCGTTGTGAGTATTGAAC GJB3 下游引物序列AGGTCCTACAGGGGCTGAGTGACCC
用上述設計的引物對送檢樣本進行PCR擴增，并對PCR產物進行正反向測學反應擴增、純化后變性、直接測序可以精確的檢測到全編碼的突變位點。利用直接測序的方法，對GJB3基因進行全編碼區突變檢測，這樣遺傳性耳聾也可以通過基因檢測技術提前干預，父母在孕前就可了解到子女出現遺傳性耳聾的幾率，并在孕中對胎兒進行檢測，看其是否存在遺傳性耳聾。對出生就重度耳聾或全聾的新生兒，可以明確病因，如確定遺傳引起的，就可以盡早配助聽器或電子耳蝸，使患兒聾而不啞，與人正常交流溝通。真正做到“早發現”、“早預防”、“早干預”。


圖I是GJB3基因擴增后，經I. 5%瓊脂糖凝膠電泳后的電泳圖。如圖所示，目的片段約為lOOObp。其中，從左至右泳道1-3為受檢樣本，泳道4為TAKARA 2000的Marker。圖2A樣本經GJB3引物擴增后，第423堿基的測序結果。由圖可知，未發現樣本第423堿基A — G突變。圖2B樣本經GJB3引物擴增后，第423堿基的測序結果。由圖可知，發現樣本第423堿基A —G雜合突變。圖3A樣本經GJB3引物擴增后，第538堿基的測序結果。由圖可知，未發現樣本第538堿基C — T突變。圖3B樣本經GJB3引物擴增后，第538堿基的測序結果。由圖可知，發現樣本第538堿基C — T純合突變。
圖4A樣本經GJB3引物擴增后，第547堿基的測序結果。由圖可知，未發現樣本第547堿基G —A突變。圖4B樣本經GJB3引物擴增后，第547堿基的測序結果。由圖可知，發現樣本第547堿基G —A純合突變。
具體實施方式
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應當注意的是，實施例中未說明的常規條件和方法，通常按照所屬領域實驗人員常規采用方法譬如，奧斯柏和金斯頓主編的《精編分子生物學實驗指南》第四版，或者按照制造廠商所建議的步驟和條件。實施例I
檢測耳聾相關基因GJB3基因突變的試劑盒，包括
(i)PCR擴增反應試劑；包括dNTP、10*PCR緩沖液、Mg2+、雙蒸水、Tag酶等。(ii)用于擴增樣本DNA中GJB3基因的PCR引物JB3上游引物序列GGTCGTTGTGAGTATTGAAC ；GJB3 下游引物序列AGGTCCTACAGGGGCTG AGTGACCC。所述試劑盒的使用方法包括如下步驟
(i)采集待測血液樣本，提取DNA ；
(ii)以該DNA為模板，用所述用于擴增樣本DNA中GJB3基因的PCR引物進行PCR擴增，得到PCR反應產物；
(iii )對PCR反應產物測序，與GJB3正常基因序列進行比較，確定是否存在第547個堿基G — A突變位點、第538堿基C — T突變位點、第423堿基A — G突變位點。通過幾百例臨床受檢樣本用所設計的GJB3引物對GJB3基因進行擴增。發現該引物具有較高的擴增穩定性、特異性；同時作為測序引物，無論是正向還是反向均一次性讀完GJB3 ORF和側翼序列。實施例2 I)樣本抽提
I.I抽取300uL血液加入900uL紅細胞裂解液，顛倒混勻，室溫放置5分鐘，期間再顛倒混勻幾次。IOOOOrpm離心I分鐘(若離心機最高轉速不允許,可3000rpm離心5min),吸去上清，留下白細胞沉淀，加200uL緩沖液GA，振蕩至徹底混勻。I. 2加入20 U I蛋白酶K溶液，混勻。1.3加入200 U I緩沖液GB，充分顛倒混勻，70°C放置10分鐘，溶液應變清亮，
簡短離心以去除管蓋內壁的水珠。1.4加人200 U I無水乙醇，充分振蕩混勻15秒，此時可能會出現絮狀沉淀，簡
短離心以去除管蓋內壁的水珠。I. 5將上一步所得溶液和絮狀沉淀都加入一個吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12，OOOrpm (13，400 Xg)離心30秒，倒掉廢液，將吸附柱CB3放回收集管中。I. 6向吸附柱CB3中加入500 U I緩沖液⑶(使用前請先檢查是否已加入無水乙醇)，12，OOOrpm (13, 400Xg)離心30秒，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中。1.7向吸附柱CB3中加入700 U I漂洗液PW (使用前請先檢查是否已加入無水乙醇)，12，OOOrpm (13, 400Xg)離心30秒，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中。
1.8 向吸附柱 CB3 中加入 500 U I 漂洗液 PW，12，000 rpm (13, 400 Xg)離心 30
秒，倒掉廢液。I. 9將吸附柱CB3放回收集管中，12，000 rpm(13，400Xg)離心2分鐘，倒掉廢液。將吸附柱CB3置于室溫放置數分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液。I. 10將吸附柱CB3轉入一個干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加IOOu I洗脫緩沖液TE，室溫放置2-5分鐘，12，000 rpm (13，400Xg)離心2分鐘，將溶液收集到離心管中。2)實驗過程
2. I按樣品數n (樣品數=待測樣本數+陰性對照I個+陽性對照I個)取預混PCR反應液每管20ul分裝于反應管中。2. 2將上述處理好的待測樣本和陰性、陽性對照各取2ul分別加入反應管中，混勻，低速離心數秒，進行PCR擴增，具體反應體系如下
權利要求
1.檢測耳聾相關基因GJB3基因突變的試劑盒，其特征在于，包括 (i)PCR擴增反應試劑； (ii)用于擴增樣本DNA中GJB3基因的PCR引物JB3上游引物序列GGTCGTTGTGAGTATTGAAC ；GJB3 下游引物序列AGGTCCTACAGGGGCTG AGTGACCC。
2.如權利要求I所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒的使用方法包括如下步驟(i)采集待測血液樣本，提取DNA ； (ii)以該DNA為模板，用所述用于擴增樣本DNA中GJB3基因的PCR引物進行PCR擴增，得到PCR反應產物； (iii )對PCR反應產物測序，與GJB3正常基因序列進行比較，確定是否存在第547個堿基G — A突變位點、第538堿基C — T突變位點、423堿基A — G突變位點。
3.如權利要求2所述的試劑盒，其特征在于，步驟(ii)的PCR反應按以下條件進行擴增94 0C 2 min ；98 °C IOs,66 °C 30s,68 °C 40s、16 個循環；98 °C 10s,60 °C30s,68 °C 40s、20 個循環；68 °C 6 min。
全文摘要
本發明公開了檢測耳聾相關基因GJB3基因突變的試劑盒，其特征在于，包括(i)PCR擴增反應試劑；(ii)用于擴增樣本DNA中GJB3基因的PCR引物JB3上游引物序列GGTCGTTGTGAGTATTGAAC；GJB3下游引物序列AGGTCCTACAGGGGCTGAGTGACCC。
文檔編號C12Q1/68GK102634579SQ201210087148
公開日2012年8月15日 申請日期2012年3月28日 優先權日2012年3月28日
發明者宋坤, 徐建成, 方國偉 申請人:上海艾迪康醫學檢驗所有限公司