專利名稱：紫貽貝c型溶菌酶及其制備方法
技術領域：
本發明涉及溶菌酶，具體涉及紫貽貝C型溶菌酶及其制備方法。
背景技術：
溶菌酶(Lysozyme，EC 3. 2. I. 17)是無脊椎動物體內非常重要的固有免疫因子之一，它主要通過切斷肽聚糖中N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰胞壁酸之間的P -1，4糖苷鍵之間的聯結，破壞肽聚糖支架，使細胞脹裂從而引起細菌裂解。溶菌酶在機體免疫應答過程中不僅能直接殺死細菌，還可誘導調節其他免疫因子的合成與分泌。溶菌酶按照其來源可分為六類C (chicken)型、G (goose)型、I (invertebrate)型、植物型、細菌型和T4卩遼菌體型溶菌酶。G型溶菌酶主要存在于哺乳動物、鳥類和魚類中，專利號為CN 2004100506518及2004100506522從扇貝中獲得了 G型溶菌酶，而I型溶菌酶只存在于無脊椎動物中，C型溶 菌酶大都來自于脊椎動物。由于C型溶菌酶對各種病原菌具有較好的抑制和滅殺作用，在較低溫度條件下活性較高且具有較強的熱穩定性，因此在作為水產飼料添加劑和水產品保鮮劑方面具有很好的應用前景。目前，針對C型溶菌酶已開展較多研究，發現其通常含有130個左右的氨基酸殘基，具有4對二硫鍵，三維結構呈較緊密的橢球。研究發現，Glu35、Asp52及Trp62殘基是C型溶菌酶活性的必需氨基酸殘基，Asp1'Arg114Jrpici8等殘基對“底物-酶復合物”的形成也發揮著重要作用(Muraki M,et al，1997)。近期研究發現，鮑魚、三疣梭子蟹等無脊椎動物也存在C型溶菌酶，并且該類型的C型溶菌酶具有較強的抑制革蘭氏陰性菌活性。迄今為止，尚未有關于紫貽貝C型溶菌酶及其抗菌活性的研究報道。

發明內容
本發明提供了紫貽貝C型溶菌酶及表達基因，該紫貽貝C型溶菌酶的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO. I所示，該紫貽貝C型溶菌酶對各種病原菌具有較好的抗菌作用。本發明還提供了紫貽貝C型溶菌酶的制備方法，該制備方法能得到純度較高的紫貽貝C型溶菌酶。本發明解決上述技術問題所采用的技術方案為紫貽貝C型溶菌酶，該紫貽貝C型溶菌酶的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO. I所示。表達該紫貽貝C型溶菌酶的C型溶菌酶基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO. 2所示。紫貽貝C型溶菌酶的制備方法，其步驟如下
1)總RNA提取用Trizol試劑從鰻弧菌感染的紫貽貝血淋巴中提取總RNA，存于_80°C備用；提取方法依Invitrogen公司的Trizol試劑說明書進行；
2)mRNA純化用OligotexmRNA純化試劑盒將上述總RNA純化得到mRNA ;純化方法依據QIAGENE公司的Oligotex mRNA純化試劑盒說明書進行；
3)cDNA模板制備用cDNASynthesis Kit試劑盒(購于Stratagene公司)將上述mRNA逆轉錄并酶切為酶切片段，具體操作方法依試劑盒說明書進行包括雙鏈cDNA經末端補平、EcoR I接頭連接、EcoR I末端磷酸化、Xho I內切酶酶切等，用QIAEX II Agarose GelExtraction Kit純化試劑盒(購于QIAGEN公司)對大于IOObp的酶切片段進行回收，回收的酶切片段與Uni-ZAP XR vector載體(購于Invetrogen公司)連接,得到cDNA質粒,用ZAP-cDNA Gigapack III Gold Cloning Kit 試劑盒(購于 Stratagene 公司)對 cDNA 質粒進行噬菌體包裝、滴度測定、噬菌體文庫擴增，擴增后的噬菌體文庫加入體積百分終濃度為7%的二甲基亞砜(DMSO)，得到含C型溶菌酶基因的cDNA模板溶液，存于_80°C ;具體包裝、測定和擴增方法依試劑盒說明書進行；測序該C型溶菌酶表達基因的序列，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO. 2所示；
4)基因克隆以上述含C型溶菌酶基因的cDNA為模板進行PCR擴增，PCR擴增的引物如下正向引物 5'-TTACTTGTCT TGGTACTTGT G-3'，反向引物 5'- TTTGTATGCT ATTTTATTTTG-3' ;PCR產物經膠回收試劑盒純化回收，連接入pMD18-T載體(購于大連寶生物工程有限公司)得到克隆質粒，克隆質粒轉入大腸桿菌TOPlOF感受態細胞(購 于大連寶生物工程有限公司)中，挑選陽性克隆提取質粒，得到C型溶菌酶基因的克隆質粒；其中3’端PCR擴增的反應體系和反應條件為10 X PCR buffer 2. 5 U 1,25I. 0 u 1,2. 5 mM 的dNTP 2.0 u IUO UM的上述正向引物溶液I yl、10 uM的通用引物17溶液I yl、濃度為5 U/ ill的Taq DNA聚合酶0. 2 U 1，所述cDNA模板溶液I Ul，用PCR水定容到25U I ;反應在ABI Veriti (購于ABI公司)中進行，反應條件為首先94°C預變性5分鐘，然后進入下列循環94°C變性45秒，60 °C退火30秒，72°C延伸60秒，共進行35個循環，最后72°C延伸10分鐘；5’端PCR擴增反應體系和反應條件為10 X PCR反應緩沖液2. 5 U I,25 mM的MgCl2溶液1.0 u 1,2. 5 mM的dNTP溶液2.0 u IUOuM的上述反向引物溶液
IPlUOii M的通用引物T3溶液I yl、濃度為5 U/ill的Taq DNA聚合酶0. 2 yl，所述cDNA模板溶液I yl，用PCR水定容到25 U I,反應在ABI Veriti PCR儀中進行，反應條件為首先94°C預變性5分鐘，然后進入下列循環94°C變性45秒，60°C退火30秒，72°C延伸60秒，共進行35個循環，最后72°C延伸10分鐘；上述PCR buffer溶液、dNTP、PCR水、Taq DNA聚合酶均購自Promega公司，通用引物17、通用引物T3購自上海生工科技有限公司；
5)表達質粒構建對C型溶菌酶基因的克隆質粒進行擴增反應，擴增反應正向引物為含有Afco J酶切位點的下述核苷酸序列5'_ CCATGGCTAC AAAAACGAAG TGCCA _3'，反向引物為含IAo I酶切位點和6個His純化標簽的下述核苷酸序5'-CTCGAGTTAG TGGTGGTGGTGGTGGTGACA TGTGCTGTAA TCGT-3' ;將擴增片段純化回收，導入pMD18_T載體中，構建亞克隆質粒，轉入大腸桿菌T0P10F感受態細胞中，篩選陽性亞克隆質粒，提取陽性亞克隆質粒，用Nco I和通o I (均購于NEB公司)雙酶切亞克隆質粒；用膠回收純化試劑盒(大連寶生物工程有限公司)對酶切產生的目的片段純化回收，并將該片段導入經同樣雙酶切的表達載體pET-21a (+)(購于Novagen公司),構建得到C型溶菌酶的表達質粒；
6)表達質粒表達將上述表達質粒轉入表達宿主菌BL21(DE3)-plysS(北京全式金生物技術有限公司)，篩選陽性克隆并測序確認；挑取陽性克隆接種于LB培養基中，220rpm，37°C培養至0D600=0. 5-0. 7，加入異丙基-P -D-硫代半乳糖苷(IPTG)，使終濃度達到0. 6mM,繼續培養5小時，4°C，8000rpm離心10分鐘，收集菌液；
7)蛋白純化對上述菌液超聲破碎、離心獲得包涵體，并對包涵體進行洗滌、溶解、鎳柱親和層析純化。最后對重組蛋白進行透析復性得到具有抗菌活性的重組蛋白，即本發明的紫貽貝C型溶菌酶；經質譜測序鑒定，測得序列符合該重組蛋白的氨基酸序列如序列表SEQID NO. I 所示。
本發明的引物由上海生物工程有限公司合成 。與現有技術相比，本發明的優點在于一種紫貽貝C型溶菌酶，該紫貽貝C型溶菌酶的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO. I所示，該紫貽貝C型溶菌酶的制備方法是通過對紫貽貝總RNA提取、mRNA純化、cDNA模板溶液制備、基因克隆、重組質粒構建、表達質粒表達和蛋白純化步驟得到該C型溶菌酶；該紫貽貝C型溶菌酶是一種新的C型溶菌酶，對多種革蘭氏陽性和陰性微生物具有較強的抑制活性，具有開發為食品保鮮劑和飼料添加劑等方面的應用價值。
具體實施例方式以下結合實施例對本發明作進一步詳細描述。
實施例一、用Trizol試劑從鰻弧菌感染的紫貽貝血淋巴中提取總RNA，提取方法依Invitrogen公司的Trizol試劑說明書進行取紫貽貝仔血淋巴50 ml, 2000 g離心10分鐘，棄上清，向沉淀細胞中加入20 ml的TRIZOL(Invitrogen),用高速分散器將細胞分散，室溫下劇烈震蕩10秒；加入4 ml氯仿，劇烈震蕩30秒；4°C 10，000 g高速離心10分鐘；吸取上清液于一個新離心管中，加入冰浴過的等體積異丙醇(約15ml)，置于-20°C靜置I小時以上；4°C 10,000 g高速離心10分鐘；小心棄去上清液，用5 ml 70%的乙醇清洗沉淀；4°C10, OOOg高速離心10分鐘,小心棄去上清液；真空干燥5分鐘,用約600 V- I RNase-freewater溶解RNA，待完全溶解后儲存于-80°C備用。二、用Oligotex mRNA純化試劑盒將上述總RNA純化得到mRNA,具體純化方法依QIAGENE公司的Oligotex mRNA純化試劑盒說明書進行包括在37°C水浴加熱OligotexSuspension,震蕩混勻，室溫放置；70°C水浴加熱OEB Buffer ;向500 U I總RNA溶液(RNA含量約為 2mg)中加入650 u I of OBB buffer, 135 u I of Oligotex Suspension,650U I of RNase-free water，70°C加熱體系3分鐘；取出反應體系后，室溫下放置10分鐘，
15,000g離心2分鐘,小心吸走上清液,用600 V- I 0W2重懸Oligotex-mRNA沉淀,劇烈震蕩。然后將懸池液移入放在I. 5 ml離心管中的spin column內，15，000 g離心I分鐘,將spin column轉移到一個新的I. 5 ml離心管中，加入600 u I 0W2,15, 000 g離心I分鐘，將spin column轉移到新I. 5 ml離心管中；向spin column中加入50 U I預熱到70°C的OEB buffer,輕輕混勻，15，000 g 離心 I 分鐘；向 spin column 再加入 50 u I OEB buffer,混勻后15，000 g離心I分鐘；回收離心管中的mRNA溶液約100 u I0三、用cDNA Synthesis Kit試劑盒將上述mRNA逆轉錄并酶切為酶切片段，具體操作依試劑盒說明書進行包括雙鏈cDNA末端補平、EcoR I接頭連接、EcoR I末端磷酸化、Xho I內切酶酶切等，用QIAEX II Agarose Gel Extraction Kit純化試劑盒對大于IOObp的酶切片段進行回收，回收的酶切片段與Uni-ZAP XR vector載體連接，得到cDNA質粒，用ZAP-cDNA Gigapack III Gold Cloning Kit試劑盒對cDNA質粒進行卩遼菌體包裝、滴度測定和噬菌體文庫擴增，具體方法參照說明書進行，擴增后的文庫加入終濃度為7%的DMSO溶液，得到含有核苷酸序列如序列表SEQ ID NO. 2所示的C型溶菌酶基因的cDNA模板溶液，存于_80°C備用。具體逆轉錄方法包括一鏈cDNA合成在RNase-free的200 U I離心管中依次加入試劑混勻，然后加入30 u I poly(A)引物+ RNA (5 U g)，混勻，室溫下放置10分鐘后，向體系中加入I. 5 ill的一鏈合成酶StrataScript RT (50 U/yl)，終體積達到50 u I,輕輕混勻反應體系,離心數秒,42°C溫育I小時。二鏈合成在冰上依次向含有一鏈cDNA的離心管中加入需用反應物反應，再向反應體系中加入2 u I RNase H(l. 5 U/U I),Ilul DNA polymerase 1(9.0 U/ii I),輕輕混勻反應體系,離心數秒，16 V放置2. 5小時后立即將反應體系置于冰上。補平cDNA末端向二鏈合成體系中加入需用反應物，快速震蕩反應體系離心后，于72°C反應30分鐘；加入200 u I酚一氯仿[1:1 (v/v)]，震蕩混勻體系，室溫下高速離心2分鐘，轉移上清至新的離心管中；加入等體積的氯仿，震蕩混勻，室溫下高速離心2分鐘，然后轉移上清至新管中；加入下列試劑使cDNA沉淀，并震蕩體系20 u I 3M sodium acetate,400 u I 100% (v/v) ethanol, - 2CTC沉淀過夜；4°C高速離心60分鐘，小心棄去上清，保留沉淀；加入500 u I的70%乙醇輕輕洗滌沉淀，室溫高速離心2分鐘；輕輕吸去乙醇，在真空離心機中干燥沉淀；用9 U I含有EcoR I adapters的溶液溶解沉淀并于4°C放置至少30分鐘。EcoR I接頭的連接向體系中加入下列成分1 U I10 X ligase buffer, I u I IOmM rATP, I u I T4 DNA ligase (4 U/u I),離心后 8°C放置過夜；70°C 30分鐘滅活連接酶。磷酸化EcoR I末端離心反應物2秒，室溫放置5分鐘冷卻，加入下列反應物用于磷酸化接頭1 V- I IOX ligase buffer, 2 u I IOmM rATP, 5 u Isterile water, 2 u I T4 polynucleotide kinase (5 U/u I), 37°C溫育 30 分鐘，7CTC 30分鐘滅活激酶，離心2秒后室溫放置5分鐘冷卻。Xho I內切酶酶切向體系中加入下列成分28 u I Xho I buffer supplement, 3 u I Xho I (40 U/u I), 37°C溫育 I. 5 小時，加入125 u I的100% (v/v)乙醇，_20°C放置過夜，4°C離心60分鐘，棄去上清，完全干燥沉淀，用 50 u I ddH20 溶解沉淀。cDNA 與載體(Uni-ZAP XR vector, Invetrogen)連接在干凈的 200 u I 離心管中依次加入下列試劑2. 5 u I resuspended cDNA (>100 ng), 0. 5 U I10 X ligase buffer, 0. 5 u I 10 mM rATP (pH7. 5), I. 0 u I Uni-ZAP XR vector (I Hg)，
0.5 u I T4 DNA ligase (4 U/u 1)0 12°C放置過夜。噬菌體文庫的包裝從_ 80°C冰箱中取出包裝蛋白，迅速用手握住融化，立即加入4 Ul重組cDNA，用微量移液器吸頭混勻體系(不要產生氣泡)，離心5秒，室溫(22°C)溫育2小時，加入500 u I的SM buff er和20 U I氯仿，輕輕混勻反應體系。快速離心數秒，沉淀蛋白碎片，轉移上清至新管中。包裝反應的滴度測定在含有氨芐青霉素的LB固體培養基(I升培養基含有氯化鈉10 g，胰蛋白胨10g，酵母提取物5 g，瓊脂粉15 g，pH7. 5)上將菌株XLl-Blue MRF’劃線培養，37 °C過夜培養；用LB液體培養基(I升培養基含有氯化鈉10 g，胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，pH7. 5)培養單克隆菌落，30 °C, 200 rpm搖床培養過夜；4°C，1000 g下離心10分鐘沉淀細菌。用25 ml 10 mM MgS04 重懸細菌；用 10 mM MgSO4 重懸 XLl-Blue MRF’ 細胞，使濃度達到 OD6tltl=0. 5 ;將包裝產物按下列比例與宿主菌混合(I) I u I包裝產物+ 200 u I XLl-BlueMRF，(OD600 = 0 . 5) ; (2) 0. I U I 包裝產物 + 200 u I XLl-Blue MRF，(OD600 = 0 . 5);將混合體系置于37 °C溫育15分鐘使噬菌體充分附著在宿主細胞表面；加入3 ml融化狀態下約48 1的NYZ上層培養基(I升培養基含有氯化鈉5 g，MgSO4 7H20 2 g，NZ胺10 g，酵母提取物5 g，瓊脂糖7 g，pH7. 5);迅速鋪在干燥預熱過的NYZ瓊脂培養基(I升培養基、含有氯化鈉5 g，MgSO4 7H20 2 g，NZ胺10 g，酵母提取物5 g，瓊脂粉15 g，pH7. 5)上，靜置10分鐘后，倒置于37°C過夜培養；8小時后可見噬菌斑；分別計數兩個平板的噬菌斑數目，計算其滴度(每毫升生長的噬菌斑數目，pfu/ml)。30°C 200 rpm條件下，用LB液體培養基過夜培養XLl-Blue MRF’細胞50 ml ； IOOOg離心宿主細胞10分鐘；用25 ml 10 mMMgSO4重懸細胞，測定600納米可見光下菌液吸光度，然后用10 mM MgSO4將菌液稀釋至濃度為OD6tltl = 0. 5 ;將含有大約5 X IO4 pfu噬菌體顆粒的懸濁液與600 U I濃度為OD6tltl =
0.5的XLl-Blue MRF’細胞混合，置于Falcon2059聚丙烯管中，37°C溫育混合液15分鐘，使噬菌體充分附著在宿主菌表面；將混合液加入約48°C的6. 5 ml液態NZY上層培養基中，混勻后倒入新鮮的150 mm NZY瓊脂糖培養基平板上，靜置平板十分鐘，倒轉平板置于37°C約8小時(噬菌斑直徑不超過2 mm);在每塊平板上倒入大約10 ml SM緩沖液(I升緩沖液中含有 5. 8 g NaCl, 2. 0 g MgSO4.7H20，50. 0 ml IM Tris-HC l [pH 7. 5]，5. 0 ml 2%[w/v]白明膠)，4°C放置過夜；將所有平板上的SM緩沖液回收入新的聚丙烯管中，每塊平板再用2ml SM緩沖液清洗一次并回收上清液；向回收液中加入終濃度為5% (v/v)的氯仿，室溫下放置15分鐘，混勻，500 g離心10分鐘去除細胞碎片，將上清液轉移至新聚丙烯管中，并重復步驟8、9至上清液澄清，加入終濃度為7% (v/v) DMS0，儲存于-80°C。測定擴增文庫滴度(方法同前)。cDNA模板溶液中溶菌酶基因的確認用Exassist Helper Phage和SOLR菌株(均購于Stratagene公司)從Uni-ZAPXR Vector上體外切割，pBluescript卩遼菌粒進行體外切割；然后質粒cDNA的大規模提取和測序分析獲得目的EST序列，對上述EST測序結果，用BLASTn和BLASTx程序分析，根據相似性分析結果尋找出如序列表SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列的溶菌酶基因片段。 四、對上述含溶菌酶基因的cDNA模板溶液進行PCR擴增得到PCR產物，PCR擴增的正向引物序列5' - TTACTTGTCTTGGTACTTGTG - 3'，反向引物的核苷酸序列為5' -TTTGTATGCTATTTTATTTTG - 3', PCR產物經膠回收試劑盒純化后，與pMD18_T載體連接獲得克隆質粒，克隆質粒轉入大腸桿菌T0P10F感受態細胞中，挑選陽性克隆提取質粒，得到溶菌酶基因的克隆質粒；3'端PCR擴增的反應體系和反應條件為10 X PCR buffer 2.5ii 1、25 mM 的 MgCl2 I. 0 y 1、2. 5 mM 的 dNTP 2. 0 u 1,10 U M 的正向引物 I y I、IOy M 的通用引物 T7 I ii I、濃度為 5 U/ ii I 的 Taq DNA polymerase 0. 2 U I, cDNA 模板(文庫)
Iyl，用PCR水定容到25 u I ;反應在ABI Veriti PCR儀中進行，反應條件為首先94°C預變性5分鐘，然后進入下列循環94°C變性45秒，60°C退火30秒，72°C延伸60秒，共進行35個循環，最后72°C延伸10分鐘；5’端PCR擴增反應體系和反應條件為10 X PCRbuffer 溶液 2.5 U 1,25 mM 的 MgCl2 溶液 I. 0 u 1,2. 5 mM 的 dNTP 溶液 2.0 u 1,10 u M的反向引物溶液1.0 u IUO PM的通用引物T3溶液I Pi、濃度為I U/ill的Taq DNApolymerase 0. 2 yl，所述cDNA模板溶液I yl，用PCR水定容到25 U I,反應在ABIVeritiTMPCR儀中進行，反應條件為首先94°C預變性5分鐘，然后進入下列循環94°C變性45秒，60°C退火30秒，72°C延伸60秒，共進行35個循環，最后72 °C延伸10分鐘；
五、對C型溶菌酶基因的克隆質粒進行PCR擴增反應，擴增反應正向引物為含有Afco I酶切位點的核苷酸序列5' - CCATGGCTACAAAMCGAAGTGCCA -3'，反向引物為含ZAo I酶切位點和 6 個 His 純化標簽的核苷酸序列 5'- CTCGAGTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGACATGTGCTGTAATCGT -3' ;將擴增片段純化回收，導入PMD18-T載體，構建亞克隆質粒，轉入大腸桿菌T0P10F感受態細胞中，篩選陽性亞克隆質粒，提取陽性亞克隆質粒，用Afco I和ZAo I (均購于NEB公司)雙酶切亞克隆質粒；用膠回收純化試劑盒(大連寶生物工程有限公司)對酶切產生的目的片段純化回收，并將該片段導入經同樣雙酶切的表達載體pET_21a (+)(購于Novagen公司)，構建C型溶菌酶基因的表達質粒；測序該C型溶菌酶的表達質粒確認；
六、將上述的表達質粒轉入表達宿主菌BL21(DE3) plysS中，篩選陽性克隆并經測序確認，挑取陽性克隆接種于LB液體培養基中，220 rpm，37°C培養至0D_=0. 5-0. 7，加入IPTG使終濃度達到 0. 6 mM，繼續培養5 h，4°C，8000 rpm離心10分鐘，收集菌液；
七、對上述菌液超聲破碎、離心獲得包涵體，并對包涵體進行洗滌、溶解、鎳柱親和層析純化；最后對重組蛋白進行透析復性得到具有抗菌活性的重組蛋白，即本發明的紫貽貝C型溶菌酶，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO. I所示。具體方法為在收集的菌體沉淀中，加入適量的菌體裂解液(0. 5 M NaCl, 10 mM Tris-HCl,0. 5% Triton X-IOO pH
8.5)重懸沉淀，超聲波處理條件為300 W，處理200次，每次5秒，間隔10秒；菌體裂解液在41下100，00 rpm離心20分鐘收集包涵體；包涵體沉淀分別用洗液I (0.5 M NaCl,10 mM Tris-HCl,0. 5% Triton X-100,2 M 尿素 pH 8.5 )和洗液 II (0.5 M NaCl, 10 mMTris-HCl,0. 5% Triton X-100，2% 脫氧膽酸鈉 pH 8. 5)洗滌一次，用 8 M 尿素溶液(20 mMPBS,0. 5 M NaCl,8 M尿素，20 mM咪唑pH 7. 4)溶解；經鎳柱親和層析純化后的重組蛋白采用逐漸降低尿素濃度的方法進行透析復性，透析緩沖液成分如下100 mM Tris-HCl，50 mM NaCl，I mM EDTA, 2 mM還原型谷胱甘肽，0.02 mM氧化型谷胱甘肽，10%甘油，1%甘氨酸，尿素(6 M，4 M，3 M，2 M，0 M)，pH 9.0。透析緩沖液依次降低尿素的濃度，每次于4°C透析12小時，最后在TBS緩沖液(50 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl,pH 9.0)中透析兩次。重組蛋白濃度測定采用BCA蛋白濃度測定試劑盒(碧云天生物公司)。具體操作依試劑盒說明書進行根據樣品數量，按50體積BCA試劑A加I體積BCA試劑B (50:1)配制適量BCA工作液，充分混勻；完全溶解蛋白標準品，取10 ill用PBS稀釋至100 u 1，使終濃度為0. 5mg/ml ;將標準品按0，1,2,4,8,12，16，20 U I加到96孔板的標準品孔中，用PBS溶液補足到20 ill ;加適當體積樣品到96孔板的樣品孔中并用PBS補足到20 u I ;各孔加入200U I BCA工作液，37°C放置30分鐘；測定A562，根據標準曲線計算出蛋白濃度。應用例
將紫貽貝C型溶菌酶加入試管中制成濃度為0. 42 mg/mL作用液，分別接種產氣腸桿菌、奇異變形桿菌、藤黃微球菌、金黃色葡萄球菌、惡臭假單胞菌以及鰻弧菌各5 u 1，使每管最終菌液濃度約為5X IO5 CFU/ml，培養24小時后，利用酶標儀測定600 nm的光吸收值，確定MIC值，得到如表I所示的結果。表I :紫貽貝C型溶菌酶的抗菌譜
硬i式菌株|MIC值(UM)~
備黃色葡萄球f 6. 95-13. 89 gl微球菌I. 74-3. 47 —
^!弧菌3. 47-6. 95
惡頁假單胞菌 I. 74-3. 47 —
奇異變形桿菌 1 47-6.95 '
尹氣腸桿菌 |3. 47-6. 95
從表I中可以看出，紫貽貝C型溶菌酶對上述革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌都有抑制活性，說明本發明的紫貽貝C型溶菌酶具有廣譜抗菌活性，且效果較好。其中產氣腸桿菌、奇異變形桿菌、藤黃微球菌以及金黃色葡萄球菌37°C培養；惡臭假單胞菌以及鰻弧菌28°C培養；具體步驟調節各菌至OD6tltl為I后，稀釋1000倍備用；在96孔板中每孔中加入100Ul LB液體培養基，再在每一行第一個孔中加入100 Ul C型溶菌酶，混勻后從第一個孔中吸出100 U I加到第二個孔中，混勻后吸出100 U I加到第三個孔中，依此類推,第10個 孔中吸出的100 u I不再加到第11孔中。每行1-11孔中都接種稀釋好的相應菌種5 u I,第12孔為只含培養基的對照。培養24h以上，測定吸光值并計算相應的MIC。結果發現，紫貽貝C型溶菌酶對各供試菌株均表現出一定的抑制作用，其中對藤黃微球菌和惡臭假單胞菌的抑制效果最為顯著，最小抑菌濃度均為I. 74-3. 47 u moL/L。
權利要求
1.紫貽貝C型溶菌酶，其特征在于該紫貽貝C型溶菌酶的氨基酸序列如序列表SEQIDNO. I所示。
2.權利要求I所述的紫貽貝C型溶菌酶，其特征在于表達所述的紫貽貝C型溶菌酶的C型溶菌酶基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO. 2所示。
3.權利要求I所述的紫貽貝C型溶菌酶的制備方法，其特征在于其步驟如下 1)紫貽貝總RNA的提取用Trizol試劑從鰻弧菌感染的紫貽貝血淋巴中提取總RNA，存于-80 °C備用； 2)紫貽貝mRNA純化用OligotexmRNA純化試劑盒將上述總RNA純化得到mRNA ； 3)紫貽貝cDNA模板制備用cDNASynthesis Kit試劑盒將上述mRNA逆轉錄并酶切為酶切片段，用QIAEX II Agarose Gel Extraction Kit純化試劑盒對大于100 bp的酶切片段進行回收，回收的酶切片段與Uni-ZAP XR vector載體連接，得到cDNA質粒，用ZAP-cDNAGigapack III Gold Cloning Kit試劑盒對cDNA質粒進行噬菌體包裝、滴度測定、噬菌體文庫擴增，擴增后的噬菌體文庫加入體積百分終濃度為7%的二甲基亞砜，得到含核苷酸序列如序列表SEQ ID NO. 2所示的C型溶菌酶基因的cDNA模板溶液，存于_80°C ； 4)基因克隆對上述含C型溶菌酶基因的cDNA模板溶液進行PCR擴增，PCR擴增的引物如下正向引物序列TTACTTGTCT TGGTACTTGT G，反向引物序列TTTGTATGCT ATTTTATTTTG，3’端PCR擴增的反應體系和反應條件為10 X PCR buffer 2.5 U 1,25 mM的MgCl2溶液1.0 iil、2. 5 mM的dNTP溶液2. 0 u IUO U M的上述正向引物溶液I iU、10 y M的通用引物17溶液I ii I、濃度為5 U/ ill的Taq DNA聚合酶0. 2 U 1，所述cDNA模板溶液I yl，用PCR水定容到25 u 1，反應條件為94°C預變性5分鐘，然后進入下列循環94°C變性45秒，60 °C退火30秒，72°C延伸60秒，共進行35個循環，最后72°C延伸10分鐘；5’端PCR擴增反應體系和反應條件為10 X PCR反應緩沖液2. 5 u 1,25 mM的MgCl2溶液1.0iil、2. 5 mM的dNTP溶液2. 0 yl、10 y M的上述反向引物溶液I ylUOiiM的通用引物T3溶液I ii I、濃度為5 U/ ill的Taq DNA聚合酶0. 2 U I,所述cDNA模板溶液I Ul，用PCR水定容到25 u 1，反應條件為94°C預變性5分鐘，然后進入下列循環94°C變性45秒，60 V退火30秒，72°C延伸60秒，共進行35個循環，最后72°C延伸10分鐘；PCR產物經膠回收試劑盒純化，與PMD18-T載體連接得到克隆質粒，轉入大腸桿菌T0P10F感受態細胞中，挑選陽性克隆提取質粒，得到C型溶菌酶基因的克隆質粒； 5)表達質粒構建以上述C型溶菌酶基因的克隆質粒為模板進行PCR擴增反應，擴增反應的正向引物為含有Afco I酶切位點的核苷酸序列CCATGGCTAC AAAAACGAAG TGCCA,反向引物為含通0 I酶切位點和6個His純化標簽的核苷酸序列CTCGAGTTAG TGGTGGTGGTGGTGGTGACA TGTGCTGTAA TCGT ;將擴增片段純化回收，導入pMD18_T載體，構建亞克隆質粒，轉入大腸桿菌T0P10F感受態細胞中，篩選陽性亞克隆質粒，提取陽性亞克隆質粒，用Afco I和ZAo I雙酶切亞克隆質粒；用膠回收純化試劑盒對酶切產生的目的片段純化回收,并將該片段導入經同樣雙酶切的表達載體pET-21a (+)中，構建得到C型溶菌酶的表達質粒； 6)表達質粒表達將上述表達質粒轉入表達宿主菌BL21(DE3) plysS，篩選陽性克隆并經測序確認，將陽性克隆接種于LB培養基中，220rpm，37°C培養至0D_=0. 5-0. 7，加入異丙基-0 -D-硫代半乳糖苷，使其終濃度達到0. 6 mM,繼續培養5 h，然后8000rpm離心10分鐘收集菌體；7)蛋白純化對上述菌液超聲破碎、離心獲得包涵體，并對包涵體進行洗滌和溶解，然后采用鎳柱親和層析純化，最后對純化產物進行透析、復性得到氨基酸序列如序列表SEQID NO. I所示的紫貽貝C型溶菌酶
全文摘要
本發明公開了一種紫貽貝C型溶菌酶及制備方法，該紫貽貝C型溶菌酶的氨基酸序列如序列表SEQIDNO.1所示，該紫貽貝C型溶菌酶的制備方法是通過對紫貽貝總RNA提取、mRNA純化、cDNA模板溶液制備、基因克隆、重組質粒構建、表達質粒表達和蛋白純化步驟得到該C型溶菌酶；該紫貽貝C型溶菌酶是一種新的C型溶菌酶，對多種革蘭氏陽性和陰性微生物具有較強的抑制活性，具有開發為食品保鮮劑和飼料添加劑等方面的應用價值。
文檔編號C12R1/19GK102643787SQ20121010010
公開日2012年8月22日 申請日期2012年4月9日 優先權日2012年4月9日
發明者宋微微, 李榮華, 母昌考, 王春琳, 王春艷 申請人:寧波大學