專利名稱：微生物發酵生產低溫木聚糖酶的方法
技術領域：
本發明涉及微生物學、酶工程、發酵工程、生物化學等領域，具體涉及一種低溫木聚糖酶微生物發酵生產方法。該發明生產的低溫木聚糖酶主要應用于造紙工業、食品飲料、飼料、功能性低聚糖的制備、以及其他木聚糖酶應用行業。可提高原料的利用率、轉化率和生產率，降低能耗和生產成本，改善并提高產品質量。
背景技術：
廣義的木聚糖酶是指能夠降解半纖維素木聚糖的一組酶的總稱(劉瑞田等，工業微生物，1998),包括內切3 -1,4-D-木聚糖酶(endo-3 -1,4_D_xyIanase) (EC3. 2. I. 8), P-D-木糖苷酶(3-D-xylosidases) (EC 3.2.1.37)，a-L-呋喃阿拉伯糖苷酶(a-L-arabinofuranosidases), a-D-葡萄糖醒酸苷酶(a-D-glucuronidases)(EC3. 2. 2. 39)。但通常所說的木聚糖酶僅限于內切0-1,4-D-木聚糖酶，是木聚糖降解酶系中最關鍵的酶(朱會芳等，菌物學報，2010)，其作用是降解木聚糖主鏈骨架。木聚糖酶作為生物酶制劑，已經廣泛應用于造紙工業、食品飲料、飼料、功能性低聚糖的制備等行業中(江正強，中國食品學報，2005)。目前國內外對微生物發酵生產木聚糖酶的研究已比較深入，主要包括菌種篩選、誘導產酶、酶的分離純化、酶學特性以及木聚糖酶基因的克隆與表達等研究(朱會芳等，應用與環境生物學報，2009)，但僅限于中、高溫木聚糖酶，；而微生物發酵生產低溫木聚糖酶的研究尚在起步階段，其產業化、規模化生產及應用還未見報道。低溫木聚糖酶與中、高溫木聚糖酶相比具有更松散、柔順的分子結構(陳秀蘭等，中國農業科技導報，2007)，使其在自然條件下具有更高酶活及催化效率，從而提高底物利用率，降低能耗，縮短處理過程的時間；低溫木聚糖酶對熱反應敏感的特點，可以通過溫和的熱處理使其變性失活，從而控制酶水解程度，使產品品質不受影響。鑒于微生物發酵生產的低溫木聚糖酶在降低生產成本及降低能耗方面的巨大優勢，可從根本上擺脫中、高溫酶的加熱、冷卻設備和工藝，這將為人類擺脫生存和發展中所面臨的諸如饑餓、資源、能源危機以及環境污染等困境提供現實的機遇。因此，微生物發酵生產的低溫木聚糖酶具有非常廣闊的開發潛力和應用前景。

發明內容
本發明的目的是提供一種微生物發酵生產低溫木聚糖酶的方法，該發明主要是微生物經過低溫馴化后，在10 16°C液體發酵生產低溫木聚糖酶的方法，這種生產方法獲得的低溫木聚糖酶活性可以達到200U/ml，如再經過分離和純化，可以得到不同濃度和純度的酶制劑。該酶制劑應用操作簡單、方便、快捷、成本低。可以從根本上避免中溫、高溫酶的加熱、冷卻設備和工藝。本發明所述的一種微生物發酵生產低溫木聚糖酶的方法具體包括以下步驟(I)將產生木聚糖酶的微生物逐級低溫馴化，馴化溫度由高到低，25°C— 22°C— 20°C— 18°C— 16°C— 14°C— 12°C— 10°C，使其在低溫環境中生長良好；
(2)按常規方法將低溫馴化后的木聚糖酶產生菌在10 16°C逐級擴大培養，制備成液體一級種子和二級種子；(3)將液體一級種子或二級種子，按發酵液體積的3 9%接種量接入液體發酵培養基中，在10 16°C培養72 144h時，即微生物發酵生產低溫木聚糖酶結束；(4)將(3)的發酵液在4，000 8，OOOrpm離心收集液體，收集到的液體即為粗酶液；(5)根據不同需要和使用對象不同，將(4)得到的粗酶液進一步濃縮、分離純化，制備成不同活性、純度和劑型的酶制劑。本發明中使用的菌種來源于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心 (CGMCC)，初期活化和生長條件按菌種保藏單位提供的說明進行。木聚糖酶產生菌(CGMCC編號I. 265或I. 518)先活化、定向馴化后，按本發明產酶條件發酵生產低溫木聚糖酶，低溫馴化后的菌株在4°C環境中可保存2個月，用10 25%甘油制成的菌懸液、在-80°C條件下可以長期保藏。
具體實施例方式實施例一(I)培養基制備①菌種活化培養基牛肉膏3. 0g，蛋白胨10. 0g，NaCl 5. 0g，蒸餾水I. 0L，pH
7.4 7. 6,121°C高壓蒸汽滅菌30min。②菌種低溫馴化培養基玉米芯2. 0 8. 0g，蛋白胨5. 0 15. Og, NaCl 2. 5
8.5g，K2HPO4O. I 0. 8g，MgSO4. 7H20 0. I 0. 8g，蒸餾水 I. 0L, pH 自然，121°C高壓蒸汽滅菌 30min。③液體種子培養基牛肉膏I. 0 8. 0g，蛋白胨5. 0 15. 0g，NaCl 2. 5 10. 5g，自來水I. 0L, pH自然，121°C滅菌30min。④發酵產酶培養基麩皮5. 0 15. 0g，蛋白胨8. 0 16. 0g，酵母粉2. 0 8. Og,NaCl 5. 0 16. 0g, MgSO4O. I 0. 9g,吐溫-800. 05 0. Ig,自來水 I. 0L, pH 自然，121。。高壓蒸汽滅菌30min。(培養基添加3-4種成分)(2)將產生木聚糖酶的菌種，按中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)提供的菌株說明進行初始活化；(3)將⑵活化好的菌種逐級低溫馴化，馴化溫度由高到低，25°C— 22°C— 20°C— 18°C— 16°C— 14°C— 12°C— 10°C，使其在低溫環境中生長良好；(4)按常規方法將低溫馴化后的木聚糖酶產生菌在10 16°C培養24 36h而后按5 8%的接種量進行逐級擴大培養，制備成液體一級種子和二級種子；(5)將(4)制備的二級種子按發酵液體積3 5%的接種量接入10L的產酶培養基中，在10 12°C培養120 144h時，即微生物發酵生產低溫木聚糖酶結束；(6)將(5)的發酵液在4，000 8，OOOrpm離心收集液體，收集到的液體即為粗酶液；(7)根據不同需要和使用對象不同，將(6)得到的粗酶液進一步濃縮、分離純化，制備成不同活性、純度和劑型的低溫木聚糖酶制劑。
實施例二 (I)培養基制備①菌種活化培養基牛肉膏3. 0g，蛋白胨10. 0g，NaCl 5. 0g，蒸餾水I. 0L，pH
7.4 7. 6,121°C高壓蒸汽滅菌30min。②菌種低溫馴化培養基玉米芯2. 0 8. 0g，蛋白胨5. 0 15. Og, NaCl 2. 5
8.5g，K2HPO4O. I 0. 8g，MgSO4. 7H20 0. I 0. 8g，蒸餾水 I. 0L, pH 自然，121°C高壓蒸汽滅菌 30min。 ③液體種子培養基牛肉膏I. 0 8. 0g，蛋白胨5. 0 15. 0g，NaCl 2. 5 10. 5g，自來水I. 0L, pH自然，121°C滅菌30min。④發酵產酶培養基麩皮5. 0 15. 0g，蛋白胨8. 0 16. Og,酵母粉2. 0 8. Og,NaCl 5. 0 16. 0g, MgSO4O. I 0. 9g,吐溫-800. 05 0. Ig,自來水 I. 0L, pH 自然，121。。高壓蒸汽滅菌30min。(培養基添加3-4種成分)(2)將產生木聚糖酶的菌種，按中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)提供的菌株說明進行初始活化；(3)將⑵活化好的菌種逐級低溫馴化，馴化溫度由高到低，25°C— 22°C— 20°C— 18°C— 16°C— 14°C— 12°C— 10°C，使其在低溫環境中生長良好；(4)按常規方法將低溫馴化后的木聚糖酶產生菌在10 6°C培養24 36h而后按5 8%的接種量進行逐級擴大培養，制備成液體一級種子和二級種子；(5)將(4)制備的二級種子按發酵液體積5 7%的接種量接入50L的產酶培養基中，在12 14°C培養96 120h時，即微生物發酵生產低溫木聚糖酶結束；(6)將(5)的發酵液在4，000 8，OOOrpm離心收集液體，收集到的液體即為粗酶液；(7)根據不同需要和使用對象不同，將(6)得到的粗酶液進一步濃縮、分離純化，制備成不同活性、純度和劑型的低溫木聚糖酶制劑。實施例三(I)培養基制備①菌種活化培養基牛肉膏3. 0g，蛋白胨10. 0g，NaCl 5. 0g，蒸餾水I. 0L，pH
7.4 7. 6,121°C高壓蒸汽滅菌30min。②菌種低溫馴化培養基玉米芯2. 0 8. 0g，蛋白胨5. 0 15. 0g, NaCl 2. 5
8.5g，K2HPO4O. I 0. 8g，MgSO4. 7H20 0. I 0. 8g，蒸餾水 I. 0L, pH 自然，121°C高壓蒸汽滅菌 30min。③液體種子培養基牛肉膏I. 0 8. 0g，蛋白胨5. 0 15. 0g，NaCl 2. 5 10. 5g，自來水I. 0L, pH自然，121°C滅菌30min。④發酵產酶培養基麩皮5. 0 15. 0g，蛋白胨8. 0 16. Og,酵母粉2. 0 8. Og,NaCl 5. 0 16. 0g, MgSO4O. I 0. 9g,吐溫-800. 05 0. Ig,自來水 I. 0L, pH 自然，121。。高壓蒸汽滅菌30min。(培養基添加3-4種成分)(2)將產生木聚糖酶的菌種，按中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)提供的菌株說明進行初始活化；(3)將⑵活化好的菌種逐級低溫馴化，馴化溫度由高到低，25°C— 22°C— 20°C— 18°C— 16°C— 14°C— 12°C— 10°C，使其在低溫環境中生長良好；(4)按常規方法將低溫馴化后的木聚糖酶產生菌在10 16°C培養24 36h而后按5 8%的接種量進行逐級擴大培養，制備成液體一級種子和二級種子；(5)將(4)制備的二級種子按發酵液體積7 9%的接種量接入100L的產酶培養基中，在14 16°C培養72 96h時，即微生物發酵生產低溫木聚糖酶結束；(6)將(5)的發酵液在4，000 8，OOOrpm離心收集液體，收集到的液體即為粗酶液； (7)根據不同需要和使用對象不同，將(6)得到的粗酶液進一步濃縮、分離純化，制備成不同活性、純度和劑型的低溫木聚糖酶制劑。
權利要求
1.一種微生物發酵生產低溫木聚糖酶的方法，其包括以下步驟 (1)將產生木聚糖酶的微生物逐級低溫馴化，馴化溫度由高到低，25°C— 22°C— 20°C— 18°C— 16°C— 14°C— 12°C— 10°C，使其在低溫環境中生長良好； (2)按常規方法將低溫馴化后的木聚糖酶產生菌在10 16°C逐級擴大培養，制備成液體一級種子和二級種子； (3)將液體一級種子或二級種子，按發酵液體積的3 9%接種量接入液體發酵培養基中，在10 16°C培養72 144h時，即微生物發酵生產低溫木聚糖酶結束； (4)將(3)的發酵液在4，000 8，OOOrpm離心收集液體；收集到的液體即為粗酶液； (5)根據不同需要和使用對象不同，將(4)得到的粗酶液進一步濃縮、分離純化，制備成不同活性、純度和劑型的酶制劑。
2.根據權利要求I所述的方法，在步驟(5)之后進一步包括將步驟(5)得到的粗酶液進一步濃縮、分離純化，制備成不同活性、純度和劑型的酶制劑。
3.根據權利要求I或2所述的方法，其中菌種低溫馴化培養基、液體種子培養基、發酵產酶培養基分別為 (1)菌種低溫馴化培養基:玉米芯2.0 8.0g，蛋白胨5.0 15. 0g，NaCl 2. 5 8. 5g，K2HPO4O. I 0.8g，MgSO4. 7H20 0. I 0. 8g，蒸餾水 I. 0L, pH 值自然，121°C 高壓蒸汽滅菌30mino (2)液體種子培養基牛肉膏I.0 8. 0g，蛋白胨5.0 15. OgjNaCl 2. 5 10. 5g,自來水1.01，？11值自然，1211滅菌30min。
(3)發酵產酶培養基麩皮5.0 15. 0g，蛋白胨8. 0 16. Og,酵母粉2. 0 8. Og, NaCl.5.0 16. Og, MgSO4O. I 0. 9g，吐溫-800. 05 0. Ig,自來水 I. 0L，pH 值自然，121°C高壓蒸汽滅菌30min。
全文摘要
本發明所述的一種微生物發酵生產低溫木聚糖酶的方法是將產生低溫木聚糖酶的微生物逐級低溫馴化，使其在低溫環境中生長良好；將低溫馴化后的木聚糖酶產生菌在10～16℃逐級擴大培養，按發酵液體積的3～9％接種量接入液體發酵培養基中，在10～16℃培養72～144h時，即微生物發酵生產低溫木聚糖酶結束；發酵液在4,000～8,000rpm離心收集液體，收集的液體即為粗酶液；根據不同需要和使用對象不同，可以將粗酶液進一步濃縮、分離純化，制備成不同活性、純度和劑型的酶制劑。
文檔編號C12N9/42GK102653748SQ201210106590
公開日2012年9月5日 申請日期2012年4月12日 優先權日2012年4月12日
發明者于爽, 張慶芳, 王曉輝, 竇少華, 遲乃玉, 馬莉 申請人:大連大學