專利名稱：微生物發酵生產低溫超氧化物歧化酶的方法
技術領域：
本發明涉及微生物學、酶工程、發酵工程、生物化學等領域，具體涉及一種微生物發酵生產SOD的方法。該方法生產的低溫SOD作為生物體內超氧陰離子自由基的清潔劑，主要應用于醫學、食品、化妝品等行業，尤其在防輻射、抗衰老、消炎、抑制腫瘤、癌癥和自身免疫治療等方面顯示出獨特的優越性。
背景技術：
超氧化物歧化酶(superoxidedismutase, ECl. 15. I. I,簡稱 S0D)是一類廣泛存在于生物體內的金屬酶，能夠催化超氧陰離子自由基和氫離子反應形成過氧化氫和分子氧，從而清除生物體內的氧自由基，起到保護生物體免受傷害作用(自俊青，大理師專學報，1998)。1969年Mccord和Fridovich發現該酶生物催化活性并命名為超氧化物歧化酶(林慶斌，化學世界，2006)。按其結合的金屬種類不同，可將其分為三類一類是藍綠色的Cu，Zn-SOD，相對分子量約32000，主要存在于真核細胞的胞液和葉綠體中，是目前研究最多、最深入的一類；第二類是紫紅色的Mn，Fe-SOD，相對分子量約40000，主要存在于原核生物細胞及線粒體的基質中；第三類是黃褐色的Fe-SOD，相對分子量約為38700，主要存在于原核細胞及一些植物中(陳惠芳，生命的化學，2003)。SOD作為生物酶制劑，醫療上主要用于輔助放療與化療，腎、肝、心臟等器官的保護和移植，消除輻射引起的副作用，以及作為某些疾病的探針等；食品工業作為添加劑應用于飲料和啤酒等。近年來SOD被廣泛用于治療氧中毒、老年性白內障、糖尿病、心血管疾病、各種炎癥等多種疾病(張博潤等，微生物學通報，1992)。幾十年來SOD—直是國內外研究熱點，起初階段多集中于從動物血液或組織中提取S0D，到中期階段微生物發酵生產SOD的研究開始起步并日漸增多，到目前為止微生物生產SOD已然成為研究的主體。但多為中、高溫SOD，最適作用溫度一般在45°C以上，而人體的生理溫度一般為36. 5 37°C，致使微生物發酵生產的中、高溫SOD不能充分發揮作用，出現治療效果差或沒有效果(曾胤新，微生物學雜志，2004)。低溫SOD最適作用溫度一般為35 40°C，比較接近人體的生理溫度，應用于治療效果比較明顯。但低溫SOD產業化、規?；a及應用還未見報道(吳江等，中國醫藥工業雜志，1997)。鑒于動物血液來源困難及微生物發酵生產的中、高溫SOD最適作用溫度的局限性，利用微生物發酵生產的低溫SOD具有很大的應用優勢。低溫SOD在自然環境溫度下具有高酶活力及高催化效率，且對熱敏感，經過溫和的熱處理即可使低溫酶的活力喪失，如果將SOD應用于食品工業從而大大縮短處理過程的時間并省卻昂貴的加熱或冷卻費用，且不影響產品品質(鄭洲等，極地研究，2007)，這將有助于低溫SOD的推廣和使用。可從根本上擺脫繁瑣的提取工藝及中、高溫酶的加熱、冷卻設備和流程，在提高得率及酶活性的同 時降低能耗及生產成本。鑒于低溫SOD在自然和生理條件下的優勢，低溫SOD在醫療保健、食品、化妝品等方面擁有更加廣泛的應用前景和開發潛力
發明內容
本發明是提供一種微生物發酵生產低溫SOD的方法，該方法主要是微生物經過低溫馴化后，在10 16°C液體發酵生產低溫SOD的方法，這種生產方法獲得的低溫SOD酶活性可以達到203. 68U/ml，如再經過分離和純化，可以得到不同濃度和純度的酶制劑。該酶制劑應用操作簡單、方便、快捷、成本低?？梢詮母旧媳苊庵袦?、高溫酶的加熱、冷卻設備和工藝。本發明所述的一種微生物發酵生產低溫SOD的方法具體包括以下步驟(I)將產生SOD的微生物逐級低溫馴化，馴化溫度由高到低，25°C— 22°C— 20°C— 18°C— 16°C— 14°C— 12°C— 10°C，使其在低溫環境中生長良好；(2)按常規方法將低溫馴化后的SOD產生菌10 16°C逐級擴大培養，制備成液體一級種子和二級種子；
(3)將液體一級種子或二級種子，按發酵液體積的3 9%接種量接入液體發酵培養基中，在10 16°C培養68 96h時，即微生物發酵生產低溫SOD結束；(4)將(3)的發酵液4，000 8，OOOrpm離心收集菌體，用蒸餾水洗滌數次之后離心收集沉淀；(5)將沉淀懸浮于緩沖液中，加石英砂研磨破碎，10，000 14，OOOrpm離心，收集的上清為SOD粗酶液；(6)根據不同需要和使用對象不同，將(5)得到的粗酶液進一步濃縮、分離純化，制備成不同活性、純度和劑型的酶制劑。本發明中使用的菌種來源于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，初期活化和生長條件按菌種保藏單位提供的說明進行。SOD產生菌(CGMCC編號
I.119或I. 551)先活化、低溫馴化后，按本發明產酶條件發酵生產低溫S0D，低溫馴化后的菌株在4°C可保存2個月，用10 25%甘油制成的菌懸液、在_80°C條件下可長期保藏。
具體實施例方式實施例一(I)培養基制備①菌種活化培養基葡萄糖lO.Og，牛肉膏14.(^，蛋白胨7.(^，酵母粉4.(^，瓊脂20. Og, pH 7. 0,蒸懼水I. 0L, pH值自然，121°C高壓蒸汽滅菌30min。②菌種低溫馴化培養基葡萄糖8. 0 16. 0g，牛肉膏10. 0 25. Og,蛋白胨3. 0 12. 0g，酵母粉2.0 9. 0g，瓊脂10.0 30. 0g，蒸餾水I. 0L，pH值自然，121°C高壓蒸汽滅菌 30min。③液體種子培養基葡萄糖5. 0 15. Og,牛肉膏8. 0 20. Og,蛋白胨5. 0 15. 0g，酵母粉2.0 10. Og,自來水1.01，？11值自然，1211高壓蒸汽滅菌30min。④發酵產酶培養基葡萄糖10. 0 30. 0g, (NH4) 2S043. 0 10. 0g，玉米漿5. 0 15. 0g，酵母粉 2.0 8. 0g, CaCO3LO 6. 0g, MgSO4O. I 0. 9g，自來水 I. 0L, pH 值自然，121°C高壓蒸汽滅菌30min。(2)將產生SOD的菌種，按中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)提供的菌株說明進行初始活化；(3)將⑵活化好的菌種逐級低溫馴化，馴化溫度由高到低，25°C— 22°C— 20°C— 18°C— 16°C— 14°C— 12°C— 10°C，使其在低溫環境中生長良好；(4)按常規方法將低溫馴化后的SOD產生菌在10 16°C培養24 36h而后按5 8%的接種量進行逐級擴大培養，制備成液體一級種子和二級種子；(5)將(4)制備的二級種子按發酵液體積3 5%的接種量接入IOL的產酶培養基中，在10 12°C培養120 144h時，即微生物發酵生產低溫SOD結束；(6)將(5)的發酵液4，000 8，OOOrpm離心收集菌體，用蒸餾水洗滌數次之后離心收集沉淀；(7)將沉淀懸浮于緩沖液中 加石英砂研磨破碎，10，000 14，OOOrpm離心，收集到的上清為SOD粗酶液；(8)根據不同需要和使用對象不同，將(7)得到的粗酶液進一步濃縮、分離純化，制備成不同活性、純度和劑型的低溫SOD制劑。實施例二 (I)培養基制備①菌種活化培養基葡萄糖10. 0g，牛肉膏14.(^，蛋白胨7.(^，酵母粉4.(^，瓊脂20. Og, pH 7. 0,蒸懼水I. 0L, pH值自然，121°C高壓蒸汽滅菌30min。②菌種低溫馴化培養基葡萄糖8. 0 16. 0g，牛肉膏10. 0 25. Og,蛋白胨3. 0
12.0g，酵母粉2.0 9. 0g，瓊脂10.0 30. 0g，蒸餾水I. 0L，pH值自然，121°C高壓蒸汽滅菌 30min。③液體種子培養基葡萄糖5. 0 15. 0g，牛肉膏8. 0 20. Og,蛋白胨5. 0 15. 0g，酵母粉2.0 10. Og,自來水1.01，？11值自然，1211高壓蒸汽滅菌30min。④發酵產酶培養基葡萄糖10. 0 30. 0g, (NH4) 2S043. 0 10. 0g，玉米漿5. 0 15. 0g，酵母粉 2.0 8. 0g, CaCO3LO 6. 0g, MgSO4O. I 0. 9g，自來水 I. 0L, pH 值自然，121°C高壓蒸汽滅菌30min。(2)將產生SOD的菌種，按中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)提供的菌株說明進行初始活化；(3)將⑵活化好的菌種逐級低溫馴化，馴化溫度由高到低，25°C— 22°C— 20°C— 18°C— 16°C— 14°C— 12°C— 10°C，使其在低溫環境中生長良好；(4)按常規方法將低溫馴化后的SOD產生菌在10 16°C培養24 36h，而后按5 8%的接種量進行逐級擴大培養，制備成液體一級種子和二級種子；(5)將(4)制備的二級種子按發酵液體積5 7%的接種量接入50L的產酶培養基中，在12 14°C培養96 120h時，即微生物發酵生產低溫SOD結束；(6)將(5)的發酵液4，000 8，OOOrpm離心收集菌體，用蒸餾水洗滌數次之后離心收集沉淀；(7)將沉淀懸浮于緩沖液中，加石英砂研磨破碎，10，000 14，OOOrpm離心，收集到的上清為SOD粗酶液；(8)根據不同需要和使用對象不同，將(7)得到的粗酶液進一步濃縮、分離純化，制備成不同活性、純度和劑型的低溫SOD制劑。實施例三(I)培養基制備
①菌種活化培養基葡萄糖lO.Og，牛肉膏14.(^，蛋白胨7.(^，酵母粉4.(^，瓊脂
20.Og, pH 7. 0,蒸懼水I. 0L, pH值自然，121°C高壓蒸汽滅菌30min。②菌種低溫馴化培養基葡萄糖8. 0 16. 0g，牛肉膏10. 0 25. Og,蛋白胨3. 0 12. 0g，酵母粉2.0 9. 0g，瓊脂10.0 30. 0g，蒸餾水I. 0L，pH值自然，121°C高壓蒸汽滅菌 30min。③液體種子培養基葡萄糖5. 0 15. 0g，牛肉膏8. 0 20. Og,蛋白胨5. 0
15.0g，酵母粉2.0 10. Og,自來水1.01，？11值自然，1211高壓蒸汽滅菌30min。④發酵產酶培養基葡萄糖10. 0 30. 0g, (NH4) 2S043. 0 10. Og,玉米漿5. 0 15. 0g，酵母粉 2.0 8. 0g, CaCO3LO 6. 0g, MgSO4O. I 0. 9g，自來水 I. 0L, pH 值自然，121°C高壓蒸汽滅菌30min。(2)將產生SOD的菌種，按中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)提供的菌株說明進行初始活化；(3)將⑵活化好的菌種逐級低溫馴化，馴化溫度由高到低，25°C— 22°C— 20°C— 18°C— 16°C— 14°C— 12°C— 10°C，使其在低溫環境中生長良好；(4)按常規方法將低溫馴化后的SOD產生菌在10 16°C培養24 36h而后按5 8%的接種量進行逐級擴大培養，制備成液體一級種子和二級種子；(5)將(4)制備的二級種子按發酵液體積7 9%的接種量接入100L的產酶培養基中，在14 16°C培養72 96h時，即微生物發酵生產低溫SOD結束；(6)將(5)的發酵液4，000 8，OOOrpm離心收集菌體，用蒸餾水洗滌數次之后離心收集沉淀；(7)將沉淀懸浮于緩沖液中，加石英砂研磨破碎，10，000 14，OOOrpm離心，收集到的上清為SOD粗酶液； (8)根據不同需要和使用對象不同，將(7)得到的粗酶液進一步濃縮、分離純化，制備成不同活性、純度和劑型的低溫SOD制劑。
權利要求
1.一種微生物發酵生產低溫超氧化物歧化酶的方法，包括以下步驟 (1)將產生超氧化物歧化酶的微生物逐級低溫馴化，馴化溫度由高到低，25°C— 22°C— 20°C— 18°C— 16°C— 14°C— 12°C— 10°C，使其在低溫環境下生長良好； (2)按常規方法將低溫馴化后的超氧化物歧化酶產生菌在10 16°C逐級擴大培養，制備成液體一級種子和二級種子； (3)將液體一級種子或二級種子，按發酵液體積的3 9%接種量接入液體發酵培養基中，在10 16°C培養72 144h時，即微生物發酵生產低溫超氧化物歧化酶結束； (4)將(3)的發酵液4，000 8，OOOrpm離心收集菌體，用蒸餾水洗滌數次之后離心收集沉淀； (5)將沉淀懸浮于緩沖液中，加石英砂研磨破碎，10,000 14，OOOrpm離心,收集到的上清為超氧化物歧化酶粗酶液； (6)根據不同需要和使用對象不同，還可以將(5)得到的粗酶液進一步濃縮、分離純化，制備成不同活性、純度和劑型的酶制劑。
2.根據權利要求I所述的方法，在步驟(6)之后進一步包括將步驟(6)得到的粗酶液進一步濃縮、分離純化，制備成不同活性、純度和劑型的酶制劑。
3.根據權利要求I或2所述的方法，其中菌種低溫馴化培養基、液體種子培養基、產酶培養基分別為 (1)菌種低溫馴化培養基葡萄糖8.0 16.0g，牛肉膏10.0 25. 0g，蛋白胨3.0 ·12. 0g，酵母粉2.0 9. 0g，瓊脂10.0 30. 0g，蒸餾水I. 0L，pH值自然，121°C高壓蒸汽滅菌 30min。
(2)液體種子培養基葡萄糖5.0 15.0g，牛肉膏8.0 20. 0g，蛋白胨5. 0 15. Og,酵母粉2.0 10. Og,自來水1.01，？11值自然，1211高壓蒸汽滅菌30min。
(3)發酵產酶培養基葡萄糖10.0 30.0g，(NH4)2S043.0 ~ 10. 0g，玉米漿5. 0 ·15. 0g，酵母粉 2.0 8. 0g, CaCO3LO 6. 0g, MgSO4O. I 0. 9g，自來水 I. 0L, pH 值自然，·121°C高壓蒸汽滅菌30min。
全文摘要
本發明所述的一種微生物發酵生產低溫超氧化物歧化酶的方法是將產生超氧化物歧化酶的微生物逐級低溫馴化，使其在低溫環境中生長良好；將低溫馴化后的超氧化物歧化酶產生菌在10～16℃逐級擴大培養，按發酵液體積的3～9％接種量接入液體發酵培養基中，在10～16℃培養72～144h時，即微生物發酵生產低溫超氧化物歧化酶結束；發酵液在4,000～8,000rpm離心收集菌體，數次洗滌后收集沉淀，懸浮于緩沖液中，并加石英砂研磨，10,000～14,000rpm離心收集上清即為粗酶液；根據不同需要和使用對象不同，可以將粗酶液進一步濃縮、分離純化，制備成不同活性、純度和劑型的酶制劑。
文檔編號C12N9/02GK102653733SQ20121010674
公開日2012年9月5日 申請日期2012年4月12日 優先權日2012年4月12日
發明者張慶芳, 遲乃玉, 馬莉 申請人:大連大學