專利名稱：用于檢測BRCA1mRNA的核酸檢測試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明屬生命科學和生物技術領域，特別是ー種基因檢測試劑盒，采用探針實時熒光定量PCR技木，能夠對人類乳腺癌中的BRCAl表達水平進行檢測，可有效的節約檢測時間，提聞檢測精度。
背景技術：
乳腺癌作為女性的常見腫瘤，已成為癌癥死亡的第二大原因。其診斷主要建立在影像學檢查基礎上，缺乏實驗室特異性診斷指標，給早期診斷帶來困難，容易漏診或誤診，而手術切除又是乳腺癌首選治療方法，但是術后影響形態，美觀不佳，對患者造成較大困擾，更有部分患者因此產生的心理陰影，嚴重影響她們的生活質量。目前多認為乳腺癌應采取多種方法結合的綜合治療，原發病灶的徹底清理是乳腺癌治療的關鍵。另外早期診斷也顯得尤為重要，早發現是爭取其良好預后的關鍵。 乳腺癌I 號基因(breast cancel susceptibility genel, BRCAI)是世界上第一個被發現的家族性乳腺癌抑癌基因，定位于17號染色體長臂上，由包括22個編碼外顯子和2個非編碼外顯子。目前研究發現，DNA修復是鉬類化療耐藥性產生的主要機制之一。臨床運用表明鉬類藥物的療效存在顯著的個體差異，部分患者獲益，部分患者耐藥并出現毒副作用。大量臨床研究已經證實鉬類藥物的療效與腫瘤組織中BRCAl基因mRNA表達水平密切相關，即BRCAl基因表達水平低的患者對鉬類藥物敏感，反之表達水平高的患者表現耐藥。然而，抗微管類化療藥是作用于細胞微管，通過影響紡錘體形成，從而抑制細胞有絲分裂的。這類藥物時常出現治療有效率低和副作用大的問題，而且存在顯著的個體差異。大量的臨床研究顯示，抗微管藥物的療效與腫瘤組織中BRCAl基因的mRNA表達水平密切相關，即BRCAl基因表達水平高的患者對抗微管類藥物敏感，反之表達水平低的患者表現耐藥。因而，BRCAl表達水平對于后期的用藥有很重要的指導作用。在實際應用中，用于檢測BRCAl表達的方法主要為免疫組化，盡管該法較為直觀，但是試驗過程過于繁瑣，需要的試劑種類繁多，且試驗結果需要經驗豐富的專家來判讀，判讀結果存在較大的主觀性，一定程度上限制了該法的應用。正是因為免疫組化法存在這些問題，才促使我們探索新的方法來檢測BRCAl表達水平。實時熒光定量PCR法具有較高的靈敏度和特異性，而且能對PCR進行實時在線檢測，反應BRCAl在組織中的初始含量，試驗節約了大量的檢測時間，還避免了遺留污染的發生。常見的方法有SYBR GreenI染料法，雙探針雜交法以及Taqman技術等。其中SYBRGreenI由于是非飽和染料，特異性不如雙探針雜交法以及Taqman法，必須通過觀察溶解曲線來判斷其特異性；而雙探針法雜交法成本又較為昂貴。因此本發明采用實時熒光PCR技術結合Taqman探針法應用于BRCAl基因檢測。

發明內容
鑒于現有技術中檢測BRCAl的不足，本發明設計了檢測內參/目的基因用引物、探針序列，用熒光定量PCR技術檢測BRCAl基因。通過調整兩個基因的引物探針濃度及比例，優化PCR的反應體系和反應條件，開發了ー種用于檢測BRCAlmRNA的核酸檢測試劑盒。用于檢測BRCAlmRNA的核酸檢測試劑盒，包括紅細胞裂解液、RNA提取液、檢測體系PCR反應液、陽性對照品和陰性對照品；其特征在于檢測體系PCR反應液包括PCR緩沖液、d NTP、Mg2+、檢測用上下游引物BRCAl-F/BRCAl-R 和探針 BRCAl-Probe、參照用上下游引物 Actin_F/Actin-R 探針 Actin-Probe ;其中，BRCAl-F CAGCTACCCTTCCATCATAAGTGABRCAl-R GGCCATGTATATGCGAATCTTTTT BRCAl-Probe FAM-TTCTGCCCTTGAGGACCTGCGAAAT-TAMRA Actin-F TGAGCGAGGCTACAGCTTActin-R TCCTTGATGTCGCGCACGATTTActin-Probe FAM-ACCACCACGGCCGAGCGG-TAMRA 進ー步地，檢測用上下游引物和探針的比例優選為BRCAl-F BRCAl-R BRCAl-Probe 的摩爾比為 2 : 2 : I。參照用上下游引物和探針的比例優選為Actin_F : Actin-R : Actin-Probe的摩爾比為2:2:1。所述陽性對照品為含有BRCAl基因組的溶液；所述陰性對照品為無BRCAl基因組的溶液。RNA提取液可用商業產品QIAGEN RNeasy FFPE Kit石蠟RNA抽提試劑盒替代。使用本發明的試劑盒，將實時熒光PCR技術結合采用Tapman探針，可以對BRCAlmRNA進行檢測，檢測精度高，而且操作簡單，可降低檢測成本，節約檢測時間。利用雙標準曲線法，將檢測結果與正常人的表達水平(O. 75)相比，能衡量受測者體內BRCAl基因表達水平是否正常，該方法是ー種新型的用于評價患者BRCAl表達水平的方法，也有助于患者的后期治療方案的確定。由于引入了“正常人”替代了原有的單純個體檢測，不但能夠對受測者體內BRCAl基因表達量進行檢測，同時還能夠與正常水平進行比較，指導后期用藥，可用于輔助臨床上乳腺癌的早期診斷、早期預防及高危人群的篩選。


圖I是陽性檢測結果示意圖；圖2是陰性檢測結果示意圖。
具體實施例方式實施例I本發明的用于檢測BRCAlmRNA的核酸檢測試劑盒，包括紅細胞裂解液；RNA 提取液QIAGEN RNeasy FFPE Kit。檢測體系PCR 反應液:THraDERBIRD Probe qPCR Mix (2 X)(包括 PCR 緩沖液、d NTP、Mg2+)、BRCAl 引物各 O. 8uM、BRCAトprobe (探針)0. 4uM ；Actin 引物各 0. 8uM、Actin-probe (探針)0. 4uM ;其中，BRCAl-F CAGCTACCCTTCCATCATAAGTGA,BRCAl-R GGCCATGTATATGCGAATCTTTTT,BRCAl-Probe FAM-TTCTGCCCTTGAGGACCTGCGAAAT-TAMRA,Actin-F TGAGCGAGGCTACAGCTT,Actin-R TCCTTGATGTCGCGCACGATTT,Actin-Probe FAM-ACCACCACGGCCGAGCGG-TAMRA ；陽性對照品含BRCAI基因組溶液；陰性對照品不含BRCAl基因組溶液。實施例2本發明試劑盒的使用方法(I)抽提石蠟切片中的組織RNA :切去組織或者石蠟片樣本于I. 5ml離心管中(刮拭)；加入Iml組織透明液,振蕩混勻后13000rpm離心Imin ;去除上清加入500ml組織透明液振蕩混勻后13000rpm離心Imin ;去除上清,加入Iml無水こ醇振蕩混勻后13000rpm離心Imin ;去除上清后至于37度金屬浴IOmin (開蓋)，直至液體干燥 ，參考QIAGEN RNeasyFFPE Kit石蠟RNA抽提試劑盒說明書，提取樣本RNA。(2)參考Τ0Υ0Β0公司的Rever Tra Ace qPCR RT Kit試劑盒說明書，將RNA反轉為 cDNA。(3)試劑配置按檢測人份數配置檢測體系PCR反應液各X ul，每人份23ul分裝X = 23ul反應液X (8份內參(標準曲線)+8份目的基因(標準曲線)+η份標本+1份陽性對照+1份陰性對照+1份空白對照)。(4)加樣加入檢測體系PCR反應液中2ulcDNA ;陽性對照和陰性對照直接加2ul陽性對照品和陰性對照品；空白對照加2ul生理鹽水或不加任何物質。(5)檢測檢測在實時熒光PCR儀上進行，可用儀器包括ABI7300，7500(美國Applied Biosystems 公司)等。反應條件95°C 預變性 Imin ;95°C 15s, 58°C 35sec 40 個循環，突光信號于58°C 35sec時米集。(6)結果判斷將閾值線調整至背景信號及陰性擴增線以上，系統根據標準曲線和CT值自動計算出拷貝數。按照以下公式進行計算
權利要求
1.用于檢測BRCAlmRNA的核酸檢測試劑盒，包括紅細胞裂解液、RNA提取液、檢測體系PCR反應液、陽性對照品和陰性對照品；其特征在于 檢測體系PCR反應液包括PCR緩沖液、d NTP、Mg2+、檢測用上下游引物BRCAl-F /BRCAl-R 和探針 BRCAl-Probe、參照用上下游引物 Actin-F/ Actin-R 探針 Actin-Probe ;其中，BRCAI-F CAGCTACCCTTCCATCATAAGTGABRCAI-R GGCCATGTATATGCGAATCTTTTTBRCAl-Probe FAM-TTCTGCCCTTGAGGACCTGCGAAAT-TAMRAActin-F TGAGCGAGGCTACAGCTTActin-R TCCTTGATGTCGCGCACGATTTActin-Probe FAM-ACCACCACGGCCGAGCGG-TAMRA
2.如權利要求I所述的核酸檢測試劑盒，其特征在于BRCAl-F BRCAl-R BRCAl-Probe 的摩爾比為 2 : 2 : I。
3.如權利要求I所述的核酸檢測試劑盒，其特征在于Actin-F: Actin-R :Actin-Probe 的摩爾比為 2 : 2 : I。
4.如權利要求I所述的核酸檢測試劑盒，其特征在于所述陽性對照品為含有BRCAl基因組的溶液；所述陰性對照品為無BRCAl基因組的溶液。
全文摘要
本發明公開了用于檢測BRCA1mRNA的核酸檢測試劑盒，包括紅細胞裂解液、RNA提取液、檢測體系PCR反應液、陽性對照品和陰性對照品；其特征在于，檢測體系PCR反應液包括PCR緩沖液、dNTP、Mg2+、檢測用上下游引物BRCA1-F/BRCA1-R和探針BRCA1-Probe、參照用上下游引物Actin-F/Actin-R探針Actin-Probe；其中，BRCA1-FCAGCTACCCTTCCATCATAAGTGA；BRCA1-RGGCCATGTATATGCGAATCTTTTT；BRCA1-ProbeFAM-TTCTGCCCTTGAGGACCTGCGAAAT-TAMRA；Actin-FTGAGCGAGGCTACAGCTT；Actin-RTCCTTGATGTCGCGCACGATTT；Actin-ProbeFAM-ACCACCACGGCCGAGCGG-TAMRA。
文檔編號C12Q1/68GK102676663SQ20121013010
公開日2012年9月19日 申請日期2012年4月27日 優先權日2012年4月27日
發明者周曉犢, 方國偉, 王淑一 申請人:杭州艾迪康醫學檢驗中心有限公司