專利名稱：一種快速雙向多位點基因突變的方法
技術領域：
本發明屬于生物工程技術領域，具體涉及ー種快速高效的基因突變方法。本方法以改進的重疊延伸PCR方法為基礎，利用帶有突變位點的特異性引物，通過兩輪PCR擴增和DNA片段連接實現DNA雙向多位點基因突變。
背景技術：
隨著分子生物學研究的不斷發展，基因定點突變技術成為ー種常用的改造和優化基因的方法，在基因合成，基因表達及蛋白質結構與功能之間的關系等方面的研究中得到廣泛的應用。PCR介導的點突變是使用最為普遍的基因定點突變技術。PCR誘導定點突變包括重疊延伸突變及一歩快速突變等，具有準確、高效的特點，其中重疊延伸突變PCR可以在DNA區段的任何位置實現定點突變，但耗時長且突變位點有限。本發明對傳統重疊延伸PCR法進行定點突變的實驗方法進行了改進，可以在同管內實現雙向多位點快速基因突變。
發明內容
本發明的目的在于提供ー種基因多位點突變方法，采用此方法可以快速、準確地實現雙向多位點基因突變和新目的基因片段合成。所述快速雙向多位點基因突變方法包括以下步驟
O 根據目的基因待突變位點及其上下游序列特點，確定上中下三個DNA片段，根據上述三個DNA片段的序列特點和待突變位點，設計三對特異性引物，分別表示為FlF和F1RT，F2FT和F2RT,以及F3FT和F3R，其中Fi (i=l，2和3)表示3個DNA片段，F表示上游引物，R表示下游引物，T表示延伸序列；
2)進行第一輪PCR，以目的基因為模板，利用步驟I)中的三對特異性引物分別擴增得Fl，F2和F3三個DNA片段；
3)進行第二輪PCR，分離純化步驟2)所得的擴增產物Fl，F2和F3，并將其作為擴增模板，采用重疊延伸PCR方法，利用三個片段間重疊部分的片段作為鉸鏈，將含有突變序列的三個片段相連接，以FlF和F3R為引物進行擴增，即可擴增得到雙向多位點突變的基因產物；
4)在步驟I)中，Fl片段的下游引物FlRT和F2片段的上游引物F2FT含有相同待突變片段和部分重疊序列，F2片段的下游引物F2RT和F3片段的上游引物F3FT亦含有相同待突變片段和部分重疊序列；
5)在步驟2)中，第一輪PCR擴增產物Fl片段的3’端和F2片段的5’端部分序列相同并含有相同的突變序列，F2片段的3’端序列和F3片段的5’端部分序列相同并含有相同的另一段突變序列。
圖I基因雙向多位點突變原理示意圖。以目的基因為模板，利用三對引物進行第ー輪PCR擴增，得Fl、F2和F3三個片段；再以上述三個DNA片段為模版，以FlF和F3R為引物進行第二輪PCR擴增，即獲得雙向多位點突變基因。圖2 PCR產物電泳圖。圖A、B分別為第一、ニ輪PCR擴增產物的電泳圖。
具體實施例方式實施例I :長度為324 bp,含有兩個突變DNA片段的獲得 一、引物的設計 根據所選DNA片段(見序列表SEQ ID No. I)的擬突變位點及其序列特征，設計三對特異性引物，分別用于擴增選定的DNA片段和其相鄰上下游片段(Fl :上游片段，F2 :靶序列，F3 :下游片段)。所設計的引物序列如表I所示，其中劃線部分為延伸序列，即重疊部分。表I引物序列
權利要求
1.ー種快速雙向多位點基因突變的方法，其特征在于以下步驟 1)在需突變基因的序列范圍及其上下游選定三個DNA片段，設計三對引物，引物分別表示為FlF和F1R，F2F和F2R，以及F3F和F3R (Fi (i=l，2和3)表示3個DNA片段，F表示上游引物，R表示下游引物)，其中F1R，F2F，F2R和F3F含有突變序列； 2)進行第一輪PCR，以待突變基因為模板，利用上述三對引物擴增，得到含有突變序列的DNA片段產物F1，F2和F3，其序列特點為Fl片段的3’端和F2片段的5’端部分序列相同并含有相同的突變序列，F2片段的3’端序列和F3片段的5’端部分序列相同并含有相同的另一段突變序列； 3)以F1，F2和F3三個片段作為擴增模板，采用重疊延伸PCR方法，利用三個片段間重疊部分的片段作為鉸鏈，將含有突變序列的三個片段相連接并以FlT和F3R為引物進行第ニ輪PCR，擴增即可得到目的基因產物。
2.按照權利要求I所述的基因雙向多位點突變的方法，其特征在于運用兩輪PCR，且第二輪PCR利用了重疊延伸的方法。
3.根據權利要求I和2所述的基因雙向多位點突變方法，其特征為確定含有待突變序列的DNA片段F2和其上游片段Fl和下游片段F3。
4.根據權利要求1，2和3所述的基因雙向多位點突變方法，其特征是所用的部分特異性引物含有待突變序列和重疊序列。
5.根據權利要求1，2，3和4所述的基因雙向多位點突變方法，其特征是所用的源模板是通過基因修飾方法獲得的含有突變基因的DNA序列。
6.根據權利要求5所述和基因雙向多位點突變方法，其特征是采用改進的重疊延伸PCR方法連接多個含有突變基因序列的片段。
7.根據權利要求5和6所述和基因雙向多位點突變方法，其特征是采用改進的重疊延伸PCR方法快速合成含有突變基因序列的片段。
全文摘要
本專利涉及一種快速雙向多位點基因突變的方法。本方法以改進的重疊延伸PCR方法為基礎，利用帶有突變位點的序列特異性引物，通過兩輪PCR擴增和DNA片段連接實現DNA雙向多位點基因突變。本方法可廣泛用于目的基因定點突變，基因合成，蛋白結構-功能研究、蛋白質表達優化和目的基因包裝。本方法按照需要實現突變的DNA片段序列特點，設計出三個DNA片段和三對相應特異性擴增引物。通過兩步PCR擴增和特定的擴增程序設定，得到引入所需突變位點的目的基因片段。
文檔編號C12N15/10GK102690807SQ20121014000
公開日2012年9月26日 申請日期2012年5月8日 優先權日2012年5月8日
發明者徐峰, 王書崎, 隗慧林 申請人:王書崎