專利名稱：一種tmc1耳聾基因突變篩查方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種基因突變篩查方法，具體涉及一種TMCl耳聾基因突變篩查方法。
背景技術(shù)：
研究表明，60%耳聾由遺傳因素導(dǎo)致，另外40%與環(huán)境因素有關(guān)。以往由于人們?nèi)狈?duì)耳聾遺傳病因?qū)W的深入認(rèn)識(shí)以及診斷技術(shù)，無(wú)法明確耳聾分子病因，更無(wú)法預(yù)防其發(fā)生。近30年來(lái)，伴隨耳聾遺傳病因?qū)W及分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，至今已有84個(gè)耳聾基因被克隆，一些常見(jiàn)基因得到了深入的認(rèn)識(shí)，耳聾分子病因?qū)W診斷成為可能。雖然歐美自上世紀(jì)末開(kāi)展了耳聾基因診斷工作，但因缺乏對(duì)中國(guó)耳聾人群致聾遺傳因素的系統(tǒng)性研究，并缺乏符合中國(guó)國(guó)情及遺傳背景的耳聾基因篩查及診斷工具，我國(guó)臨床耳聾基因診斷工作受到嚴(yán)重限制而遠(yuǎn)遠(yuǎn)滯后。TMCl基因突變可以引起常染色體顯性及隱性耳聾。如“耳聾相關(guān)基因TMC1”(《國(guó)際耳鼻喉頭頸外科雜志》，2008年第05期)中報(bào)道，TMCl基因突變具有常染色體隱性遺傳和顯性遺傳兩種遺傳方式，相對(duì)應(yīng)出現(xiàn)兩種截然不同的聽(tīng)力表型特征，正逐漸為聽(tīng)力學(xué)家、遺傳學(xué)家和耳科學(xué)臨床工作者所關(guān)注。研究表明:TMClc.1714G>A(p.D572N)是引起常染色體顯性遺傳性耳聾的熱點(diǎn)突變，近期的研究也在中國(guó)發(fā)現(xiàn)了攜帶該突變的耳聾家庭。由于該突變區(qū)域缺乏酶切位點(diǎn)，不能進(jìn)行酶切反應(yīng)，因此目前國(guó)際上檢測(cè)該突變主要是采用Sanger測(cè)序法。此方法成本較高，限制了該突變的大規(guī)模人群篩查。發(fā)明目的有鑒于此，為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種TMCl耳聾基因突變篩查方法，該方法簡(jiǎn)單、快速、經(jīng)濟(jì)，解決了 TMClc.1714G > A(p.D572N)熱點(diǎn)難以進(jìn)行人群大規(guī)模篩查的難題。本發(fā)明提供的一種TMCl耳聾突變基因篩查方法，所述方法包括(I)提取外周血白細(xì)胞DNA; (2)以外周血白細(xì)胞DNA為模板，以上游引物:TCCTCTAGCCTTCATACACCGAAGTC下游引物:AACCTGGGAGGCTITTCTGT進(jìn)行PCR擴(kuò)增，(3)以限制性內(nèi)切酶Sal I酶切所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，得到160bp，130bp，30bp三條帶即為TMCl耳聾基因陽(yáng)性突變樣本。進(jìn)一步，酶切所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的反應(yīng)條件為:37°C，4小時(shí)。進(jìn)一步，所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物酶切后以2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。進(jìn)一步，所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物酶切后以8%聚丙烯凝膠電泳鑒定。本發(fā)明的有益效果在于:(1)易于實(shí)現(xiàn):本發(fā)明技術(shù)方法不需要特殊昂貴設(shè)備，且能較快定購(gòu)到實(shí)驗(yàn)所需試劑，實(shí)驗(yàn)前期準(zhǔn)備時(shí)間短；(2)操作簡(jiǎn)單:按照分子生物學(xué)試驗(yàn)室的程序化操作即可完成。(3)成本低:所引入的限制性內(nèi)切酶Sal I是普通常用酶，價(jià)格低廉(500U/80元)，每例樣品檢測(cè)需1U,加上凝膠、電泳液、酶切體系的配制,酶切反應(yīng)成本約為3元/例，而傳統(tǒng)的Sanger測(cè)序法成本為25元/例。(4)準(zhǔn)確率高:檢測(cè)結(jié)果與Sanger測(cè)序法結(jié)果完全吻合，無(wú)假陰性、假陽(yáng)性。(4)解決了難題:鑒于以上優(yōu)點(diǎn)，該技術(shù)可在基層單位廣泛開(kāi)展，解決了TMClc.1714G > A(p.D572N)熱點(diǎn)難以進(jìn)行人群大規(guī)模篩查的難題。本發(fā)明通過(guò)在引物設(shè)計(jì)中對(duì)突變位點(diǎn)上游第三位堿基進(jìn)行修改，引入了 Sal I酶切位點(diǎn)，修飾了上游引物，采用修改后的引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，擴(kuò)增產(chǎn)物可采用酶切法對(duì)突變進(jìn)行鑒定，大大降低了檢測(cè)成本。野生型樣本(即非突變樣本)酶切后為兩條帶130bp，30bp，雜合突變型樣本(即陽(yáng)性突變樣本)為三條帶160bp，130bp，30bp，易于對(duì)比鑒定。


:圖1:2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定酶切擴(kuò)增產(chǎn)物。凝膠電泳結(jié)果，Iane1，21 為 PCR 產(chǎn)物；Iane 2，3，4，6，7，8，9，10，11，12，14，16，17，18，19，20，22，23，24 為野生型；lane 5，13，15 為突變型圖2:野生型和突變型酶切后的樣本瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果判讀示意圖。圖3:野生型和突變型酶切后的樣本Sanger測(cè)序驗(yàn)證。
具體實(shí)施方式
:實(shí)施例11、模板DNA:提取自外周血白細(xì)胞中DNA，2、PCR反應(yīng)體系
權(quán)利要求
1.一種TMCl耳聾基因突變篩查方法，其特征在于:所述方法包括(I)提取外周血白細(xì)胞DNA; (2)以外周血白細(xì)胞DNA為模板，以 上游引物:TCCTCTAGCCTTCATACACCGAAGTC 下游引物:AACCTGGGAGGCTITTCTGT 進(jìn)行PCR擴(kuò)增，(3)以限制性內(nèi)切酶Sal I酶切所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，得到160bp，130bp，30bp三條帶即為TMCl耳聾基因陽(yáng)性突變樣本。
2.按照權(quán)利要求1所述的TMCl耳聾基因突變篩查方法，其特征在于:酶切所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的反應(yīng)條件為:37°C，4小時(shí)。
3.按照權(quán)利要求1所述的TMCl耳聾基因突變篩查方法，其特征在于:所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物酶切后以2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。
4.按照權(quán)利要求1所述的TMCl耳聾基因突變篩查方法，其特征在于:所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物酶切后以8%聚 丙烯凝膠電泳鑒定。
全文摘要
本發(fā)明提供一種TMC1耳聾突變基因篩查方法，所述方法包括(1)提取外周血白細(xì)胞DNA；(2)以外周血白細(xì)胞DNA為模板，以上游引物TCCTCTAGCCTTCATACACCGAAGTC下游引物AACCTGGGAGGCTTTTCTGT進(jìn)行PCR擴(kuò)增，(3)以限制性內(nèi)切酶Sal 1酶切所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，得到160bp，130bp，30bp三條帶即為TMC1耳聾基因陽(yáng)性突變樣本。本發(fā)明的有益效果在于，易于實(shí)現(xiàn)，操作簡(jiǎn)單，成本低，準(zhǔn)確率高，解決了TMC1c.1714G＞A熱點(diǎn)難以進(jìn)行人群大規(guī)模篩查的難題。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK103103257SQ201210579480
公開(kāi)日2013年5月15日 申請(qǐng)日期2012年12月28日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月28日
發(fā)明者高雪, 戴樸 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院