專利名稱：Idh2基因突變的快速檢測方法
技術領域：
本發明涉及生物技術和醫學領域，尤其是分子生物學，分子診斷，實時定量PCR技術。
背景技術：
異朽1檬酸脫氫酶(Isocitrate Dehydrogenase, IDH)在三羧酸循環中將異朽1檬酸轉化為α-酮戊二酸，從而為機體的能量代謝、生物合成以及抗氧化壓力等方面發揮起重要作用。人體內有兩種類型的IDH酶需要以NAD為輔酶的IDH酶(EC1. I. I. 41)，和需要 NADP的IDH酶(ECl. I. I. 42);兩者在不同亞細胞部位催化同一反應在胞液中以NADP+ 為輔酶，在線粒體內膜中則以NAD+為輔酶。
血清IDH酶含量測定，臨床上對診斷肝病有一定意義,尤其是惡性腫瘤病人血清 IDH酶升高，往往是肝臟轉移的信號。此外，人們發現急性髓系白血病(AML)患者存在的IDH 基因突變，可能是AML患者的不良預后因素，因此檢測IDH突變可能為白血病的分層治療提供依據。更進一步地，通過全基因組測序，還發現IDHl和IDH2突變存在于AML、急性淋巴細胞白血病(ALL)及骨髓增殖性疾病(MPD)中，但在慢性粒細胞白血病(CML)中尚未檢測到突變，有報道稱IDHl和IDH2突變在CN-AML患者中的發生率分別為5. 5-9. 6% [10-14]和 3-11%,并認為具有IDHl和IDH2突變的AML患者具有較低的CR，較高的RR和較短得OS。
除此之外，近年來也在神經膠質瘤中發現了 IDH基因的點突變，導致酶原有活性下降，同時獲得新的將α -酮戊二酸轉化為2-羥戊二酸的功能；發生突變的酶還產生 “2-羥基戊二酸”(2HG)，為一種潛在的致癌代謝物。IDH突變促進癌癥形成的機制多樣， 如產生2HG的IDH突變體能阻止組蛋白去甲基化而抑制細胞分化，有助于細胞積累突變而最終導致腫瘤發生；而人原始星細胞中的IDHl突變誘導DNA超甲基化，并對“甲基化組” (methylome)進行重塑，以模仿CMP表現型(神經膠質瘤和其他固體腫瘤的一個共同特征); 此外，2HG的(R) —對映體(而不是〈S〉-2HG)能刺激“ELN脯氨酰4-羥化酶”的活性，導致 “缺氧誘導因子”(HIF)水平下降，后者又能增強細胞增殖。這些研究成果為了解神經膠質瘤的形成建立了一個框架，同時也凸顯了人類癌癥中基因組變化與基因組以外的變化之間的相互作用。
高分辨率熔解曲線(HRM)是傳統的熔解曲線分析的延伸它要求特殊的熒光染料、高性能的熒光定量PCR與專門的分析算法。使我們可以不必測序直接篩查PCR擴增產物中是否存在遺傳學變異(SNPs, mutations)。
SYBRTM Green I 對 PCR (Polymerase Chain Reaction)即聚合酶鏈式反應擴增有毒性，因此必需使用低濃度的染料，又因為它是非飽和態結合，染料在熔解過程中可重新結合，使其無法適用于HRM。
羅氏開發了一種新的適用于HRM的染料ResoLight或LC Green,它有三個優點 飽和染料毒性低；高濃度可以使DNA達到飽和；降低了染料位置重組的可能。
而PCR (Polymerase Chain Reaction)即聚合酶鏈式反應產物的高分辨率熔解曲線HRM的要求包括
儀器高分辨率高均一性的儀器，確保結果差異僅受DNA模板的影響
試劑穩定可靠的PCR與HRM染料，確保獲取高分辨率熔解曲線
軟件高分辨率熔解曲線分析專用軟件
羅氏突光定量PCR系統LightCycler Nano System具有光源好、溫控好、檢測好、 加熱快的優點，完全能滿足檢測的要求，這臺儀器也于近期通過了國家藥監局的審批，適用于臨床診斷檢測。
LightCycler Nano System 是 LightCycler 480System 的縮小版，
ightCycler 480在HRM領域發表的文獻是當前發表文獻最多的實時定量PCR系統應用領域包括人類疾病、植物、微生物、病毒、藥理、毒理、生理、診斷等；影響因子10分以上 5 篇，包括 Nature, Nature Methods, NatureGenetics,影響因子 5 — 10 分 10 篇，5 分以上文章占總數的18%逐年上升趨勢明顯，已經成為當前qPCR擴展應用的熱點目前常常使用測序法來檢測是否存在突變，但是總結下來，現有的測序法有三個缺點
第一靈敏度不高，低比例突變(< 20%)無法檢測；
第二耗時長，一般需要2-3天；
第三成本高。
鑒于以上的問題，一種靈敏度高、耗時短、成本低、可操作性能更高的實IDH2基因突變的快速檢測方法的發明是勢在必行的。

發明內容
本發明要解決的技術問題主要是現有的測序法有三個缺點
第一靈敏度不高，低比例突變(< 20%)無法檢測；
第二耗時長，一般需要2-3天；
第三成本高。
為了解決以上問題，本發明提供了一種絲裂原活化蛋白激酶KMitogenACtivated protein Kinase Kinase I, IDH2/MAPKK1)基因突變的快速檢測方法,本發明技術在突變位點兩端設計一對野生型引物，并在突變位點上設計一對突變引物，兩者分別擴增出野生型模板和突變型模板，再用野生型引物對兩種模板進行PCR擴增，PCR產物的高分辨率熔解曲線基于HRM的基因分型(Tm的不同)PCR產物的Tm取決于GC含量.
高Tm G : C>A : T>G G>G T=G A > T:T=A A>T:C>A OC C 低 Tm
將純合子樣品的擴增產物進行熔解曲線分析，得到相似峰形的熔解曲線；當然，包括野生型純合子或突變純合子。
將雜合子樣品的擴增產物進行熔解曲線分析，得到不同峰形的熔解曲線.
S卩，為解決上述技術問題，本發明提供了一種IDH2基因突變的快速檢測方法，其包括如下實現步驟
一種IDH2基因突變的快速檢測方法，其包括如下實現步驟
在IDH2基因突變位點兩端設計一對野生型引物，并在突變位點上設計一對突變引物；
分別設計了 IDH2的野生型引物和突變型，引物分別擴增出野生型模板和突變型模板，再用野生型引物對兩種模板進行PCR擴增，分別擴增對應的野生型目的片段和突變型目的片段；
不同比例混合這兩種片段，用HRM方法進行區分。
所述PCR產物的高分辨率熔解曲線基于HRM的基因分型-Tm的不同，PCR產物的 Tm取決于GC含量。
所述純合子包括野生型純合子或突變純合子樣品的擴增產物進行熔解曲線，得到相似峰形的熔解曲線；雜合子樣品的擴增產物進行熔解曲線，得到不同峰形的熔解曲線.
所述不同比例混合這兩種片段，使突變型目的片段的含量為1/10、1/100、1/1000 和0，最后用HRM方法進行區分。
一種IDH2基因突變的快速檢測方法，其包括如下步驟
樣本處理取外周血2ml于EDTA抗凝管中，輕柔地顛倒混勻，4°C保存；DNA提取 取200 μ L抗凝血用試劑盒提取DNA，采用電泳凝膠成像對DNA純度和濃度作檢測；
qPCR-HRM檢測，包括對照孔的設立和檢測重復孔；10 μ L反應體系構成；在八連管中依照次序加入各試劑，混合均勻；所有樣本混合完后，將八連管置于羅氏熒光定量PCR 系統儀器中進行程序性檢測；
結果分析及判定在高分辨率熔解曲線分析方法中，以陽性對照孔為分界線，樣本孔與基線差異大于陽性對照孔的判定為突變型，差異小于陽性對照孔的判定為野生型。
所述qPCR-HRM檢測的程序包括95°C變性10分鐘；95°C變性10秒鐘；退火采用探底式，設置探底退火溫度為55-65 °C，每個循環降低1°C，時間為10秒鐘；72°C延伸30秒鐘；重復第2步到第四步45個循環；95°C變性60秒鐘；40°C
變性60秒鐘；設置高分辨率熔解溫度從60 V到95 °C，緩變率是O. 05 °C /s )。
所述IDH2突變型目的片段的獲取包括
利用帶有突變位點的突變引物IDH2F，IDH2MR ；IDH2M, IDH2R獲得突變位點前后兩段突變片段；
將這兩段突變片段連接起來，構成IDH2突變型目的片段。
所述IDH2突變型目的片段的獲取包括
突變第一步PCR 以稀釋后的野生型目的片段為模板，分別以IDH2F，IDH2MR;以及 IDH2M, IDH2R為引物進行兩組實驗，獲得兩個條帶單一的片段；
突變第一步產物稀釋將突變第一步獲得的兩段PCR產物稀釋I萬-10萬倍，終濃度約為IOng/ μ L ；
突變第二步PCR :以稀釋后的第一步兩段產物為模板，以IDH2F+IDH2R為引物進行第二步PCR，獲得條帶單一的片段；
突變第二步產物稀釋將突變第二步獲得的PCR產物稀釋I萬-10萬倍，終濃度約為 10-20ng/μ L。
所述M/W = 1%陽性對照模板的獲取混合99 μ L野生型模板和I μ L突變型模板， 配制100 μ L突變型/野生型(M/W) =1 %的混合模板，作為檢測用I %陽性對照模板。所述野生型目的片段的獲取包括以已知未突變基因組為模板、IDH2F+IDH2R為引物進行實驗， 獲得條帶單一的特異性IDH2野生型目的片段；將目的片段稀釋至I萬-10萬倍，終濃度約為10-20ng/y L，作為檢測野生型陰性對照模板用。6
本發明的有益效果是本發明分別設計了 IDH2的野生型引物和突變型引物，分別擴增對應的野生型目的片段和突變型目的片段，不同比例混合這兩種片段，最后用HRM方法進行區分，采用了高分辨率熔解曲線法(HRM法)；與其它方法相比，本發明的HRM法能檢出O. 1%的突變、檢測時間只需要I小時、每樣品試劑耗材成本〈Y7. 00，即，本發明方法具有高特異性、高靈敏度與方便快捷的優點；而且通量更高，單次成本更低。


圖I為本發明IDH2基因HRM檢測分析結果示意圖。
具體實施例方式
本發明應用于生物技術和醫學領域，尤其是分子生物學，分子診斷，實時定量PCR 技術。
如圖I所示，我們分別設計了 IDH2的野生型引物和突變型引物，分別擴增對應的野生型目的片段和突變型目的片段，不同比例混合這兩種片段，使突變型目的片段的含量為1/100，最后用HRM方法進行區分。下面以IDH2為例，說明具體的操作。
I樣本處理取外周血2ml于EDTA抗凝管中，輕柔地顛倒混勻,4°C保存。
2DNA 提取取 200 μ L 抗凝血用 QIAmp DNA Blood Mini Kit 試劑盒提取 DNA。采用電泳凝膠成像對DNA純度和濃度作檢測。
3、qPCR-HRM 檢測的體系
I)對照的設立和檢測重復孔
2)每個樣本的檢測必須同時設有對照實驗，包括野生型陰性對照和m/w (突變/野生=1%)陽性對照。對照和樣本均采用復孔。
3) 10 μ L反應體系構成(引物序列見附表)如下(以4管反應為例)
4) A先按下表配制MasterMix,混勻后短暫離心，然后吸取4. 5 μ L加至每管8聯管中，計4管
權利要求
1.一種IDH2基因突變的快速檢測方法，其特征在于，其包括如下實現步驟在IDH2基因突變位點兩端設計一對野生型引物，并在突變位點上設計一對突變引物； 分別設計了 IDH2的野生型引物和突變型，引物分別擴增出野生型模板和突變型模板，再用野生型引物對兩種模板進行PCR擴增，分別擴增對應的野生型目的片段和突變型目的片段； 不同比例混合這兩種片段，用HRM方法進行區分。
2.根據權利要求I所述的方法，其特征在于所述PCR產物的高分辨率熔解曲線基于HRM的基因分型-Tm的不同，PCR產物的Tm取決于GC含量。
3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于所述純合子包括野生型純合子或突變純合子樣品的擴增產物進行熔解曲線，得到相似峰形的熔解曲線；雜合子樣品的擴增產物進行熔解曲線，得到不同峰形的熔解曲線。
4.根據權利要求I所述的方法，其特征在于所述不同比例混合這兩種片段，使突變型目的片段的含量為1/10、1/100、1/1000和0，最后用HRM方法進行區分。
5.根據權利要求I所述的一種IDH2基因突變的快速檢測方法，其特征在于，其包括如下步驟 樣本處理取外周血2ml于EDTA抗凝管中，輕柔地顛倒混勻，4°C保存；DNA提取取200 μ L抗凝血用試劑盒提取DNA，采用電泳凝膠成像對DNA純度和濃度作檢測； qPCR-HRM檢測，包括對照孔的設立和檢測重復孔；10μ L反應體系構成；在八連管中依照次序加入各試劑，混合均勻；所有樣本混合完后，將八連管置于羅氏熒光定量PCR系統儀器中進行程序性檢測； 結果分析及判定在高分辨率熔解曲線分析方法中，以陽性對照孔為分界線，樣本孔與基線差異大于陽性對照孔的判定為突變型，差異小于陽性對照孔的判定為野生型。
6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于所述qPCR-HRM檢測的程序包括95°C變性10分鐘；95°C變性10秒鐘；退火采用探底式，設置探底退火溫度為55-65°C，每個循環降低1°C，時間為10秒鐘；72°C延伸30秒鐘；重復第2步到第四步45個循環;95°C變性60秒鐘；40°C變性60秒鐘；設置高分辨率熔解溫度從60°C到95°C，緩變率是O. 05°C /s)。
7.根據權利要求I或5任一所述的方法，其特征在于所述IDH2突變型目的片段的獲取包括 利用帶有突變位點的突變引物IDH2F，IDH2MR ；IDH2M, IDH2R獲得突變位點前后兩段突變片段； 將這兩段突變片段連接起來，構成IDH2突變型目的片段。
8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于所述IDH2突變型目的片段的獲取包括 突變第一步PCR 以稀釋后的野生型目的片段為模板，分別以IDH2F，IDH2MR;以及IDH2M, IDH2R為引物進行兩組實驗，獲得兩個條帶單一的片段； 突變第一步產物稀釋將突變第一步獲得的兩段PCR產物稀釋I萬-10萬倍，終濃度約為 IOng/μ L ； 突變第二步PCR :以稀釋后的第一步兩段產物為模板，以IDH2F+IDH2R為引物進行第二步PCR，獲得條帶單一的片段； 突變第二步產物稀釋將突變第二步獲得的PCR產物稀釋I萬-10萬倍，終濃度約為10_20ng/μ L。
9.根據權利要求4-8任一所述的方法，其特征在于所述M/W=1%陽性對照模板的獲取混合99 μ L野生型模板和I μ L突變型模板，配制100 μ L突變型/野生型(M/W) =1 %的混合模板，作為檢測用I %陽性對照模板。
10.根據權利要求I或5任一所述的方法，其特征在于所述野生型目的片段的獲取包括以已知未突變基因組為模板、IDH2F+IDH2R為引物進行實驗，獲得條帶單一的特異性IDH2野生型目的片段；將目的片段稀釋至I萬-10萬倍，終濃度約為10-20ng/ μ L，作為檢測野生型陰性對照模板用。
全文摘要
本發明提供了一種IDH2基因突變的快速檢測方法，其包括如下實現步驟在IDH2基因突變位點兩端設計一對野生型引物，并在突變位點上設計一對突變引物；分別設計了IDH2的野生型引物和突變型，引物分別擴增出野生型模板和突變型模板，再用野生型引物對兩種模板進行PCR擴增，分別擴增對應的野生型目的片段和突變型目的片段；不同比例混合這兩種片段，用HRM方法進行區分；與其它方法相比，本發明方法具有高特異性、高靈敏度與方便快捷的優點；而且通量更高，單次成本更低。
文檔編號C12Q1/68GK102925579SQ201210461630
公開日2013年2月13日 申請日期2012年11月16日 優先權日2012年11月16日
發明者王明, 范少安 申請人:上海賽安生物醫藥科技有限公司