新的卷曲乳桿菌菌株的制作方法
【專利摘要】本發明涉及標示為IP174178且在編號I–464下保藏于CNCM的分離的卷曲乳桿菌菌株或與IP174178具有相同特征的分離的菌株。本發明還涉及包含此類菌株的藥物組合物或營養食品組合物，及其用于治療或預防生殖器感染的用途。
CNCM I-4646
20120622
【專利說明】新的卷曲乳桿菌菌株 發明領域
[0001] 本發明涉及從健康組織的樣品分離的新的特定卷曲乳桿菌（Lactobacillus crispatus)菌株和具有相同特征的任何菌株及包含其的組合物。
[0002] 在健康女性中，泌尿生殖器菌群包含幾乎50種不同的微生物物種。在這些微生物 中，95%的群體由各種乳桿菌菌株（包括"德德萊因氏桿菌（D6derlein'sbacillus)"） 組成。這些乳桿菌通過多種機制有助于針對病原體提供保護，所述機制包括生成過氧化 氫，乳酸和細菌素，抑制病原體的粘附和擴散。特別地，這些乳桿菌通過從陰道粘液中 存在的糖原生成乳酸而維持酸性pH。因此，陰道菌群的多種病原體，諸如陰道加德納氏 菌（Gardnerellavaginalis)、二路普雷沃氏菌（Prevotellabivia)、淋病奈瑟氏球菌 (Neisseriagonorrhoeae)、支原體（mycoplasmas)、動彎桿菌屬（Mobiluncus)和最重要的 白色念珠菌（Candidaalbicans)的生長受到抑制。
[0003] 因此，正常的陰道菌群主要由在粘膜表面上形成保護性生物膜的乳桿菌構成。特 別地，陰道中最常觀察到的乳桿菌是卷曲乳桿菌、詹氏乳桿菌（Lactobacillusjensenii)、 陰道乳桿菌（Lactobacillusvaginalis)、惰性乳桿菌（Lactobacillusiners)和加氏乳桿 菌（Lactobacillusgasseri)〇
[0004] 外陰陰道念珠菌病（Vulvovaginalcandidiasis)影響70 - 75%的女性，在其生 育年份期間至少一次受到影響，并且約40 - 50%會具有第二例事件。復發性外陰陰道念珠 菌病的發生率（定義為每年至少4例事件，包括通過真菌學檢查確認的2例）已經評估為 5 - 8%。此種良性疾病對患者的生命質量具有非常負面的影響，并且產生相當大的健康護 理花費。此類病理學由于此疾病的多因素發病機制而難以治療。
[0005] 使用口服或陰道抗真菌劑的傳統維持療法必須持續至少6個月，但是復發率仍然 較高，其中60 - 70%的女性在治療中斷后2個月中復發。此外，抗真菌劑具有常見的副作 用，并且其長期使用可以促進細菌性陰道炎的發生。
[0006] 細菌性陰道炎是由于正常陰道菌落的定性和定量失調所致，其可以導致乳桿菌的 實際上完全消失，導致厭氧性菌群受益，而且還導致細菌諸如參與細菌性陰道炎的陰道加 德納氏菌和陰道阿托波氏菌（Atopobiumvaginae)的出現。
[0007] 細菌性陰道炎是具有10至15的頻率的最常見陰道感染之一。女性中的此種良性 病理學在妊娠期間可以是嚴重的，因為它可以引起早產、低出生重量和自發性流產。
[0008] 細菌性陰道炎和陰道微菌群的其它失調通常通過抗生素療法治療。此治療具有抗 生素治療的典型缺點，并且正在證明是效果越來越小的。此外，其目的為消除病原性菌群， 但還破壞正常的有益菌群。
[0009] 發明背景
[0010] 已經描述了有益的乳桿菌的口服或陰道施用促進陰道健康并且治療生殖器感染。 特別地，專利申請W0 84/04675、W0 2000/035465、US2002/0044926 和W0 2006/045475 描 述了乳酸細菌的口服或陰道施用促進陰道健康并且預防外陰陰道念珠菌病的復發。
[0011] 優選的乳桿菌是鼠李糖乳桿菌（Lactobacillusrhamnosus)和德德萊因氏桿菌 (陰道嗜酸乳桿菌（Lactobacillusacidophilusvaginalis))。專利US6, 093, 394、US6, 468, 526和US7, 807, 440以及專利申請US2010/0151026描述了特定卷曲乳桿菌菌株的 施用。
[0012] 在這些菌株中，可以提到下列卷曲乳桿菌菌株：
[0013] -在DSMZ(德國）在保藏號DSM16735、16736、16738、16739、16740、16741、16742 和16743下保藏的卷曲乳桿菌菌株，如記載于專利申請EP1 824 500的；這些菌株能夠定 殖陰道粘膜，如此能夠促進陰道健康；它們還對上皮細胞具有良好的粘附特性；
[0014] -在CNCM(法國）在保藏號I- 3483、I- 3484和I- 3486下保藏的卷曲乳桿菌菌 株，如記載于專利申請EP1 812 023的；針對其粘附上皮細胞的能力選擇這些菌株；它們 展現出對胃環境的酸性pH的良好抗性，及得到證明的抗病原性效果；
[0015] -在BCCM/LMG(比利時）在保藏號P- 20558下保藏的卷曲乳桿菌菌株，如記載于 專利EP1 427 808B1的；此菌株與其它乳酸菌株組合使用，要借助于棉塞（tampon)施用， 此菌株具有能夠定殖陰道腔的能力，包括在月經期間；和
[0016] -在ATCC(USA)在保藏號202225下保藏的卷曲乳桿菌菌株，如記載于專利EP1 011 721B1的；此菌株展現出對上皮細胞的良好粘附，較長的存活力（特別是在存在此文 件中描述的保存基質的情況下）、及良好的乳酸和H202生成。
[0017] -卷曲乳桿菌的p- 17631菌株，如記載于專利申請EP949 330,其能夠發酵糖原 并抑制念珠菌（Candida)的生長。
[0018] 大多數這些益生菌菌株（從來自健康女性的陰道樣品分離）不能在酸性pH環境 中存活或幸免于與膽汁的延長接觸。
[0019] 陰道pH是在女性一生中顯著變化的一項參數：生理pH在青春期前女孩中是7,在 青春期女性中下降到3. 8,并且在絕經期期間（缺乏激素替換療法）大于5. 5。這些變化與 多種因素，諸如雌激素的存在和乳桿菌的定殖相關。
[0020] 因此，對于外源施用的益生菌菌株重要的是能夠耐受陰道腔的酸性生理pH，此外 還能夠耐受口服施用期間胃腔的pH。
[0021] 此外，許多這些菌株不能使用糖原作為可發酵碳的來源（MartinR.等，2008)。然 而，此特性是有利的，因為陰道粘膜通常缺乏葡萄糖，并且益生菌菌株的乳酸生成僅可以在 存在可發酵碳的來源的情況下得到維持。
[0022] 發明概述
[0023] 本發明涉及在CNCM于2012年6月22日以登錄號CNCMI- 4646下保藏的新的分 離的卷曲乳桿菌菌株，標示為IP174178,以及具有相同特征的任何卷曲乳桿菌菌株。
[0024] 在下文的說明書中，對卷曲乳桿菌IP174178的任何提及會指此菌株及具有相同 特征的任何卷曲乳桿菌菌株。
[0025] 此新的菌株IP174178具有以下的結構特征：
[0026] -它在需氧-厭氧條件中生長；
[0027] -其rep-PCR概況（profile)在圖 1 中呈現；
[0028] -其16S核糖體DNA的序列以SEQIDNO: 1呈現。
[0029] 其主要的功能特性是：
[0030]-其較高的H202和乳酸生成速率（超過7g/升）；
[0031]-其依靠糖原作為唯一碳底物生長的能力；
[0032]-其對膽汁的抗性；
[0033]-其對酸性pH(特別是2. 5-4的pH)的抗性；
[0034]-其抑制泌尿生殖器區的病原體形成的能力。
[0035] 特別地，菌株卷曲乳桿菌IP174178具有對酸性pH的抗性。
[0036] 更特別地，菌株卷曲乳桿菌IP174178具有對膽汁及對酸性pH的抗性。
[0037] 更特別地，菌株卷曲乳桿菌IP174178具有對膽汁及對酸性pH的抗性，并且能夠代 謝糖原。
[0038] 本發明還涉及藥物組合物，其包含單獨的或與其它益生菌菌株或其它活性成分組 合的至少1〇 9個CFU的此菌株卷曲乳桿菌IP174178。
[0039] 本發明還涉及此菌株IP174178用于預防和治療復發性或非復發性生殖器和泌尿 生殖器感染的用途。
[0040] 發明詳述
[0041] 本發明涉及標示為IP174178且在登錄號I-4646下保藏于CNCM的新的分離的卷 曲乳桿菌菌株，及與此分離的菌株具有相同特征的任何分離的卷曲乳桿菌菌株。
[0042] 術語"乳桿菌"指所有乳桿菌細菌，是革蘭氏陽性細菌（不能移動，具有可變的形 狀和大小），和兼性厭氧菌。大多數乳桿菌將乳糖和其它單糖轉化成乳酸。它們存在于陰道 和胃腸道中，并且它們構成腸和陰道菌群的重要組成。
[0043] 卷曲乳桿菌在歐洲、美國和日本是陰道菌群的優勢種類之一（Antonio,MAD 等，1999)。
[0044] 分離的菌株卷曲乳桿菌IP174178具有下列功能特性：
[0045] _較高的H202和乳酸生成（超過7g/升）；
[0046]-依靠糖原（由陰道粘膜分泌的內源底物）生長的能力；
[0047] -對酸性pH和對膽汁的抗性；
[0048]-抑制病原體形成的能力；
[0049]-對陰道上皮細胞的粘附。
[0050] 此種依靠糖原生長的能力是相對罕見的，并且對于意圖在生殖道中形成的菌株是 特別有利的，在生殖道中葡萄糖經常是缺乏的，且在那里唯一的碳源是糖原。如此，即使在 缺乏葡萄糖的情況下此菌株的乳酸生成也得到維持（參見表5)。
[0051] 耐受酸性pH的能力是一種高度有利的特征，因為在一個方面，它容許根據本發明 的菌株在口服施用時抵抗胃的PH，且在另一個方面，在女性生殖道中即使在異常酸性分泌 的情況下也能繁殖。
[0052] 抵抗膽汁的能力使得有可能設想此菌株的口服施用，而不僅僅是陰道施用。
[0053] 本發明還涉及包含菌株卷曲乳桿菌IP174178的藥物組合物。
[0054] 在根據本發明的組合物中，每克組合物的細菌數目優選大于108,且特別是 1〇 8_1〇1(1。根據本發明的一個典型的方面，組合物包含至少1〇9個CFU的卷曲乳桿菌菌株。 術語"CFU"指"菌落形成單位"，并且是本領域技術人員公認為量化能夠建立菌落的細菌的 量度單位。
[0055] 優選地，卷曲乳桿菌菌株是凍干的。菌株可以是組合物的唯一凍干成分，但是優選 地，菌株在包含凍干步驟之前或之后添加的其它組分的培養基中凍干。
[0056] 根據本發明的另一個典型的方面，藥物組合物進一步包含本領域技術人員公知的 保存基質和/或賦形劑，和任選地具有補充作用的其它活性成分。
[0057] 根據本發明的一個典型的方面，組合物為粉末形式，其可以置于膠囊中，或者其可 以并入任何合適的載體類型，諸如乳劑或營養食品（nutraceutical)組合物中。
[0058] 特別地，此組合物可以包含下列活性成分：激素和/或抗炎劑和/或殺細菌劑和/ 或抗真菌劑。本領域技術人員會能夠確定哪些活性成分可以與菌株卷曲乳桿菌IP174178 有利結合。
[0059] 根據本發明的一個優選的方面，組合物包含硫代硫酸鈉，優選地濃度為至少 l〇〇mg/克包含108_101(1個CFU的卷曲乳桿菌IP174178的粉末。以下實施例例示了稱作"配 制劑A"的組合物，其包含凍干前的113g/l硫代硫酸鈉，及最終230mg硫代硫酸鈉/g粉末。 硫代硫酸鈉的存在使得有可能加強菌株IP174178的抗病原性效果（參見表6C)。
[0060] 根據本發明的組合物還可以包含其它乳桿菌菌株。
[0061] 根據本發明，藥物組合物可以配制用于陰道施用或口服施用。特別地，對意圖口服 施用的細菌測試其對膽汁的抗性、對酸性pH的抗性及其在存在膽汁的情況下生長的能力。 創造性的菌株IP174178具有使其能夠口服施用的這些特征。
[0062] 對于供口服施用的藥物組合物，合適的配制劑特別是片劑、膠囊、粉末、顆粒、溶液 和口服懸浮液。
[0063] 對于供陰道施用的藥物組合物，合適的配制劑特別是乳劑、膠囊和陰道栓劑和棉 塞。
[0064] 特別地，根據本發明的組合物意圖用于治療生殖器和泌尿生殖器感染，諸如陰道 病（vaginosis)和念珠菌病。
[0065] 術語"陰道病"指陰道的微生物菌群的失調。其特征在于乳桿菌消失和病原性細 菌諸如上文所列的那些細菌的繁殖。
[0066] 術語"念珠菌病"指由念珠菌屬（Candida)酵母引起的陰道感染。
[0067] 這些感染與病原體，特別是屬于白色念珠菌、陰道加德納氏菌、支原體或動彎桿菌 屬家族的病原體的存在相關。
[0068] 白色念珠菌是念珠菌屬的最重要且最知名的酵母物種。它主要對消化和生殖器粘 膜引起真菌感染（念珠菌病（candidiasis,candidosis))。
[0069] 陰道加德納氏菌是一種具有多形桿菌（pleomorphicrod)或球桿菌形狀的細菌。 它是一種通常存在于陰道病（非特異性陰道炎）病例中的細菌，作為唯一的病原性細菌或 與其它細菌組合存在。它生成僅影響人細胞的穿孔毒素。
[0070] 術語"支原體"指對靶向細胞壁的抗生素家族（青霉素或P-內酰胺）不敏感的 超過100個細菌物種的家族。特別地，生殖道支原體（Mycoplasmagenitalium)造成生殖 器和泌尿生殖器感染（尿道炎、宮頸炎、陰道炎、輸卵管炎）和不育問題。
[0071] 動彎桿菌屬是一種經常與細菌性陰道病中的陰道加德納氏菌一起找到的厭氧性 革蘭氏陽性細菌。
[0072] 本發明還涉及營養食品組合物，其包含菌株卷曲乳桿菌IP174178,或具有相似特 征的菌株。此類營養食品組合物會以食物組合物或食物補充物形式提供。
[0073] 食物組合物會由菌株卷曲乳桿菌IP174178構成，該菌株優選是凍干的，與食物產 品諸如乳制品、脂肪、含有谷類的產物、糖果或飲料混合。
[0074] 特別地，在本發明的背景中，食物補充物可以以明膠或植物物質的軟膠囊或膠囊 形式提供。
[0075] 本發明還涉及包含如上文描述的組合物之一的醫學裝置，此醫學裝置特別是陰道 棉塞，抹刀（spatula)、衛生棉、生殖器肥皂，等等。
[0076] 本發明還涉及分離的菌株卷曲乳桿菌IP174178用于預防和治療生殖器和泌尿生 殖器感染諸如陰道病和念珠菌病的用途。
[0077] 可以根據建立適合于患者的藥物治療中一般考慮的標準，諸如例如患者的年齡或 重量，患者一般狀態的嚴重性（thegravityofthepatient'sgeneralstate)、對治療 的耐受性和觀察到的副作用，確定根據本發明的組合物的最佳施用模式、劑量給藥日程表 和劑量形式。分離的菌株卷曲乳桿菌IP174178會以局部（陰道）施用和口服施用兩者使 用，單獨或組合涵蓋這兩種施用類型。
[0078] 根據本發明的另一個方面，使用分離的菌株卷曲乳桿菌IP174178來維持無感染 的女性中的有益陰道菌群。
[0079] 根據本發明的又一個方面，使用分離的菌株卷曲乳桿菌IP174178在抗生素治療 后恢復有益的陰道菌群。
[0080] 如此，本發明涉及包含分離的菌株卷曲乳桿菌IP174178的藥物組合物，其用于維 持或恢復有益的陰道菌群。
[0081] 附圖簡述
[0082] 圖1 :比較通過r印-PCR得到的基因型概況的樹狀圖形式的圖示。
[0083] 圖2 :比較通過r印-PCR得到的基因型概況的相似性矩陣形式的圖示。
[0084] 圖3 :菌株IP174178對陰道上皮細胞的粘附的測試。 實施例
[0085] 實施例1 :菌株卷曲乳桿菌IP174178的分離和選擇
[0086] 對從健康女性分離的10個菌株應用7種測試，并且對其預先選擇其生成過氧化氫 (H202)的能力。這些測試是：在改良的MRS培養基（ManJC等，1960)中生長，生成H202的 能力，生成乳酸的能力，對陰道細胞系的細胞的粘附，抑制某些生殖器病原體的能力（盤抑 制法（diskinhibitionmethod))和甲硝咕唑（metronidazole)抗性。
[0087] 在這第一批測試后，鑒定為特別感興趣，特別是在其較高的H202和乳酸生成上特 別感興趣的三個菌株是在存在糖原的情況下的生長測試的對象，僅菌株IP174178具有使 用糖原（其是陰道粘膜分泌的內源底物）作為碳源的能力。另外，此菌株在存在膽汁的情 況下展現出最佳的生長。
[0088] 獲得的結果如下：
[0089] 表1 :菌株IP174178的最后一項選擇測試
[0090]
【權利要求】
1. 一種分離的卷曲乳桿菌（Lactobacillus crispatus)菌株，其標示為IP174178且在 登錄號I - 4646下保藏于CNCM。
2. -種藥物組合物，其包含根據權利要求1的菌株。
3. 根據權利要求2的藥物組合物，其包含至少10 9個CFU的所述菌株。
4. 根據權利要求2或3中一項的藥物組合物，其進一步包含保存基質（preservation matrix)和任選地其它活性成分。
5. 根據權利要求2至4中任一項的藥物組合物，其進一步包含硫代硫酸鈉。
6. 根據權利要求2至5中任一項的藥物組合物，其配制用于陰道施用或用于口服施用。
7. 根據權利要求2至6中任一項的組合物，其用于治療和預防生殖器和泌尿生殖器感 染，諸如陰道病（vaginosis)和念珠菌病（candidiasis)。
8. -種含有根據權利要求7的組合物的醫學裝置，特別是陰道塞（vaginal tampon)。
9. 一種營養食品組合物,其包含根據權利要求1的菌株。
10. 根據權利要求2至6中任一項的藥物組合物，其用于維持或恢復有益的陰道菌群 (flora)〇
【文檔編號】C12N1/20GK104508117SQ201380036919
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2013年7月9日 優先權日:2012年7月9日
【發明者】A.尼沃利茲 申請人:S.P.M.D公司