專利名稱：檢測黃瓜綠斑駁花葉病毒的pcr引物及其方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本 發(fā)明涉及一種檢測植物中黃瓜綠斑駁花葉病毒的PCR引物及其方法，具體而言，涉及ー種特異性檢測葫蘆科植物種子中黃瓜綠斑駁花葉病毒的PCR引物及其檢測方法。
背景技術(shù)：
黃瓜綠斑駁花葉病毒greenmottle mosaic virus, CGMMV)是煙草花葉病毒屬的重要成員之一，主要侵染黃瓜、西瓜、甜瓜、南瓜等葫蘆科植物，自1935年英國首次報道以來，已廣泛分布于亞洲、歐洲、南美洲的多個國家和地區(qū)，對葫蘆科作物的生產(chǎn)造成了嚴重的經(jīng)濟損失。2005年遼寧省蓋州市首次發(fā)現(xiàn)CGMMV，西瓜發(fā)病面積達333 hm2，其中13 hm2絕收。2006年和2007年此病毒分別被列為全國農(nóng)業(yè)植物檢疫性有害生物和進境植物檢疫性有害生物。目前，我國已有遼寧、北京、河北、山東、甘肅、湖北、云南、廣西、四川、廣東、浙江、湖南等省市的多個地區(qū)發(fā)現(xiàn)該病毒。目前，CGMMV的檢測技術(shù)主要有酶聯(lián)免疫吸附法和實時熒光RT-PCR等分子生物學檢測方法。但是本發(fā)明人在實際的檢測中發(fā)現(xiàn)現(xiàn)有檢測方法存在的一些弊端ー是在PCR擴增時存在引物特異性不好，引物對不同CGMMV分離物覆蓋率低等問題；ニ是在檢測種子時，現(xiàn)有的檢測方法一般要求先播種，待種子長到3、4葉期時，分類并采集葉片后提取總RNA進行檢測，或者直接提取單粒或幾粒種子的總RNA進行檢測，這種提取總RNA的方法存在耗時長，成本高，工作量大等缺點，不適用于大批量種子的檢測。雖然現(xiàn)有技術(shù)也有研究人員探索PCR檢測方法，但也存在不夠靈敏和覆蓋面不全面的缺點，例如中國檢驗檢疫科學研究院2011年01月18日申請的的發(fā)明名稱為“快速檢測黃瓜綠斑駁花葉病毒的特異引物對及其應用”的專利申請(申請?zhí)枮?01110020249. 5 )，其中發(fā)明的特異性引物，并沒有與CGMV全基因組核苷酸序列達到100的覆蓋率，即正向引物5’-GAAGAGTCCAGTTCTGTTTC-3’在NCBI中經(jīng)BLAST檢索發(fā)現(xiàn)有四條CGMMV全基因組核苷酸序列與其只有85%的覆蓋率；2009年07月07日中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)瞀檢驗檢疫總局發(fā)布的《中華人民共和國出入境檢驗檢疫行業(yè)標準》中《黃瓜綠斑駁花葉病毒檢疫鑒定方法》里所描述的用于RT-PCR檢測的特異性引物，都存在CGMMV全基因組核苷酸序列與正向引物還是反向引物沒有達到100%覆蓋率的情況。上述現(xiàn)有技術(shù)的PCR引物顯然不能檢測出某些CGMMV分離物，存在檢測錯誤的可能。因此有必要建立一種更加快速、更加準確檢測種子中CGMMV的方法，對于PCR檢測方法而言，需要找到更加合適的引物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種檢測黃瓜綠斑駁花葉病毒的PCR引物及其方法，利用本發(fā)明所述弓I物及方法能夠更加快速、更加準確、直接檢測出種子中黃瓜綠斑駁花葉病毒。本發(fā)明提供的技術(shù)方案是一種檢測黃瓜綠斑駁花葉病毒的引物，其正向引物核苷酸序列如SEQ ID No. I所示，反向引物核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示。同時，本發(fā)明還提供一種檢測黃瓜綠斑駁花葉病毒的方法，該方法以提取待測樣品總RNA為模板，利用權(quán)利要求I所述的引物進行RT-PCR，然后取擴增產(chǎn)物進行檢測，若擴增產(chǎn)物大小約為323bp，則待測樣品中存在黃瓜綠斑駁花葉病毒。上述方法中，所述待測樣品是葫蘆科植物。上述方法中，所述待測樣品是植物種子。本發(fā)明具有以下有益效果
本發(fā)明中設(shè)計的特異性引是物根據(jù)CGMMV核苷酸序列的高保守區(qū)所設(shè)計，與其它引物相比較，除了特異性好之外，還具有對不同的CGMMV分離物覆蓋率最高的特點，能有效檢測到不同的CGMMV分離物，檢測結(jié)果更加準確，且檢測時不需加輔助引物，更加方便。本發(fā)明 的檢測方法可適用于大批量葫蘆科作物種子中CGMMV的直接檢測，在降低了檢測成本，減少了工作量的同時，保留了快速、準確、靈敏度高等優(yōu)勢。


圖I為本發(fā)明反向引物與CP000227. I序列對比圖。圖2為本發(fā)明反向引物與CP003244. I序列對比圖。圖3為本發(fā)明引物擴增的瓊脂糖凝膠電泳圖，圖中各泳道從左至右依次為DL2000DNA marker、攜帶CGMMV的站木種子、健康站木種子。圖4為電泳結(jié)果圖其用本發(fā)明特異性引物分別對感染了 CGMMV的西瓜病株，攜帶CGMMV的站木種子,感染了煙草花葉病毒(TbAacco mosaic virus, TMV)的煙草病株,未知病毒感染的南瓜病株進行RT-PCR檢測，圖中各泳道從左至右依次為DL2000 DNA marker、攜帶CGMMV的站木種子、西瓜病株、煙草花葉病毒感染的煙草病株和未知病毒感染的南瓜病株。
具體實施例方式下面通過具體實施方式
的詳細描述來進ー步闡明本發(fā)明，但并不是對本發(fā)明的限制，僅僅作示例說明。一、設(shè)計引物
本發(fā)明人利用病毒衣殼蛋白(CP)基因核苷酸序列進化的保守性，從NCBI捜索并下載黃瓜綠斑駁花葉病毒及其相近病毒的CP基因核苷酸序列，運用MEGA4. O軟件對這些序列進行比對，從擴展名為mas的文件中找出不同研究者報告的黃瓜綠斑駁花葉病毒衣殼蛋白基因核苷酸序列所共有其它病毒序列均與之不同的引物候選區(qū)，然后設(shè)計出的一對特異性引物，引物序列如下
正向引物5’ - CGAGTCCCTGTCTGCGTT -3，(SEQ ID No. I)
反向引物5’ - ACCAGACTACCGAAAACG -3’ ( SEQ ID No. 2)。上述引物由寶生物工程(大連)有限公司合成，預期的PCR產(chǎn)物為323bp。將正向引物和反向引物分別經(jīng)BLAST檢索，見下表I和下表2。表2中出現(xiàn)了本發(fā)明反向引物序列的2個覆蓋率和相同率均為100%非CGGMV序列(登錄號CP000227. I和CP003244. 1，分別為蠟狀芽孢桿菌Bacillus cereus和水生拉恩菌Rahnella aquatilis的序列),但從圖1和圖2可以看出，這兩個序列都是分兩段覆蓋才 有100%覆蓋率。所以，真正與本發(fā)明所述正向引物和反向引物的序列均能100%覆蓋且 100 %相同的全部是CGMMV核苷酸序列。因此，本發(fā)明的引物的特異性是非常好的，采用RT-PCR反應系統(tǒng)，能成功擴 增出CGMMV特異性序列。
表1 CGMMV正向引物的BLAST結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種檢測黃瓜綠斑駁花葉病毒的引物，其特征在于其正向引物核苷酸序列如SEQID No. I所示，反向引物核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示。
2.一種檢測黃瓜綠斑駁花葉病毒的方法，其特征在于提取待測樣品總RNA為模板，利用權(quán)利要求I所述的引物進行RT-PCR，然后取擴增產(chǎn)物進行檢測，若擴增產(chǎn)物大小約為323bp，則待測樣品中存在黃瓜綠斑駁花葉病毒。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述待測樣品是葫蘆科植物。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述待測樣品是植物種子。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測檢測黃瓜綠斑駁花葉病毒的引物及其方法，本發(fā)明的引物是黃瓜綠斑駁花葉病毒特異的，除了特異性好之外，還具有對不同的CGMMV分離物覆蓋率最高的特點，能有效檢測到不同的CGMMV分離物，檢測結(jié)果更加準確，且檢測時不需加輔助引物，更加方便。本發(fā)明的檢測方法可適用于大批量葫蘆科作物種子中CGMMV的直接檢測，在降低了檢測成本，減少了工作量的同時，保留了快速、準確、靈敏度高等優(yōu)勢。
文檔編號C12N15/11GK102653800SQ20121014675
公開日2012年9月5日 申請日期2012年5月14日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月14日
發(fā)明者趙慧茹, 高必達 申請人:湖南農(nóng)業(yè)大學