專利名稱：一種培育抗黃瓜花葉病毒植物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種培育抗黃瓜花葉病毒植物的方法，屬于基因工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
植物病毒病有植物“癌癥”之稱，每年因病毒病對農(nóng)作物所造成的經(jīng)濟損失約數(shù)百億元。植物病毒必須在寄主細胞內(nèi)專性寄生生活，某一種病毒只能侵染某一種或某些植物， 但也有少數(shù)病毒危害十分廣泛，如黃瓜花葉病毒(cucumber mosaic virus, CMV)0 CMV能侵入1000多種植物，包括常見的葫蘆科、茄科、十字花科作物，以及泡桐、香蕉、玉米等農(nóng)林作物，還有繁縷、老鶴草、竹葉草、酢漿草等農(nóng)田常見雜草，嚴重影響了農(nóng)作物的正常生長。CMV是雀麥花葉病毒科(Bromoviridae)黃瓜花葉病毒屬(Cucumovirus)的成員， 基因組由3條正義單鏈RNA組成，根據(jù)大小依次命名為RNA1、RNA2和RNA3。RNAl編碼Ia 蛋白。Ia蛋白是CMV復(fù)制酶復(fù)合體的一個亞單位，在CMV復(fù)制過程中起到解旋酶和甲基轉(zhuǎn)移酶的功能。此外，CMV Ia蛋白在病毒移動過程中也起重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)， 基因能編碼甲基化轉(zhuǎn)移酶，并且Tcoil可以和CMV Ia蛋白相互作用，控制CMV的傳播，引發(fā) CMV 系統(tǒng)性侵染(Kim MJ, Huh SU, Ham BK, Paek KH. A novel methyltransferase methylates cucumber mosaic virus la protein and promotes systemic spread. J Virol, 2008，82: 4823-4833)。RNA2編碼加蛋白，即復(fù)制酶復(fù)合體中依賴RNA的RNA聚合酶(RNA-cbpendent RNA polymerase, RdRP)，2a與Ia蛋白協(xié)同作用形成復(fù)制復(fù)合體；RNA3 編碼運動蛋白(movement protein,MP)和衣殼蛋白(coat protein,CP)分別負責病毒的長距離移動和衣殼化。另外，由RNA2的亞基因組RNA4表達產(chǎn)生的大小為ll_13KDa蛋白2b， 是轉(zhuǎn)錄后基因沉默(post-transcriptional gene silencing,PTGS)的抑制蛋白(Brigneti G, Voinnet 0, Li WX, et al. Viral pathogenicity determinants are suppressors of transgene silencing in Nicotiana benthamiana. EMBO J, 1998, 17: 6739—6746)。 CMV在全世界范圍內(nèi)普遍發(fā)生，并且寄主范圍最廣，能侵染65科885種植物。因其引起病害的重要性，CMV已經(jīng)成為世界范圍內(nèi)最重要的植物RNA病毒，也是目前研究最多的植物RNA 病毒之一。由于病毒對植物寄生性生活，其復(fù)制所需要的能量、物質(zhì)場所等完全由寄主細胞提供，因而病毒病的防治十分困難。到目前為止，對病毒病的防治主要有三種方法。一是化學(xué)防治法，但因其對植物的絕對寄生性和發(fā)病的獨特性使得化學(xué)防治等常規(guī)措施難以發(fā)揮作用，而且還存在化學(xué)農(nóng)藥的污染問題。二是可利用脫毒技術(shù)獲得無毒繁殖材料。但其只適用于鱗莖、接穗等，使用范圍有限。三是預(yù)防為主、綜合防治，一方面消滅侵染來源和傳播介體；另一方面采取增強植物抗病力、培育和推廣耐病或抗病品種等。雖然這些傳統(tǒng)方法能夠不同程度的降低病毒發(fā)病的嚴重程度，但不能從根本上解決問題。近年來，隨著病毒分子生物學(xué)的發(fā)展，植物基因工程技術(shù)的出現(xiàn)為防治植物病毒病開辟了新的途徑。植物抗病毒基因工程研究主要包括3個領(lǐng)域一是植物病毒來源基因介導(dǎo)的抗性(pathogen-derived resistance, PDR) ；二是植物、微生物的核糖體失活蛋白(ribosome inactivating proteins，RII3S)；三是利用植物中自然存在的抗性基因。目前 PDR已成為遺傳工程中增強作物對病毒抗性的主要措施之一(Prins M, Laimer M, Noris E, el at. Strategies for antiviral resistance in transgenic plants. Mol Plant Pathol, 2008， 9: 73-83)。RNA干涉(RNA interference，RNAi)是由雙鏈RNA (double-stranded RNA, dsRNA) 引起的序列特異性基因沉默，可以調(diào)節(jié)關(guān)閉基因的表達，進而調(diào)控細胞的各種高級生命活動(Denli AM, Hannon GJ. RNAi an ever-growing puzzle. Trends Biochem Sci, 2003，28: 196-201)。RNAi是由dsRNA誘導(dǎo)的多步驟、多因素參與的過程，是生物體的一種防御機制，普遍存在于絕大多數(shù)真核細胞中。在這個過程中，兩種類型的小RNA發(fā)揮了核心功能作用，即長度為2H6nt的小干涉RNA (small intertering RNA, si RNA)和mi RNA (microRNA)。dsRNA是RNAi的激發(fā)子，長的dsRNA被核糖核酸酶Dicer識別并剪切成長度為2H6nt的siRNA。接著siRNA被RNA誘導(dǎo)的干涉復(fù)合體(RNA-induced silencing complex, RISC)識別、解鏈，并以單鏈RNA的形式與RISC結(jié)合，隨后直接剪切具有siRNA同源序列的mRNA，阻斷其翻譯成蛋白。來自于非編碼RNA基因莖環(huán)結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄前體的小RNA稱為miRNAs。siRNAs和miRNAs介導(dǎo)的基因沉默都屬于轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默。RNAi是一項自然發(fā)生的高效的病毒防御機制。利用RNAi技術(shù)的原理設(shè)計合成與病毒同源的dsRNA，并將其導(dǎo)入植物，植物的RNAi機制受到激發(fā)并對病毒基因組進行特異性切割降解，阻止病毒的復(fù)制擴張，從而保護植物不受病毒危害。克隆CMV長747bp的 CF基因cDNA片段，并構(gòu)建至植物表達載體，即在花椰菜花葉病毒(cauliflower mosaic virus, CaMV) 35S啟動子后面同時插入正義和反義的CF cDNA序列，中間插入一個內(nèi)含子將其分開，形成一個反向重復(fù)序列。將構(gòu)建的表達載體導(dǎo)入到煙草中，轉(zhuǎn)基因植株中CMV CF雙鏈RNA的表達產(chǎn)生了小的干涉RNA，118株轉(zhuǎn)基因植株中有20株產(chǎn)生了對CMV的抗性 (Kalantidis K, Psaradakis S, Tabler M, et al. The occurrence of CMV-specific short RNAs in transgenic tobacco expressing virus-derived double-stranded RNA is indicative of resistance to the virus. Mol Plant Microbe interact, 2002, 15: 826-833)。以馬鈴薯Y病毒(Photo virus Y, PVY)的3’端保守序列設(shè)計引物，構(gòu)建RNAi 表達載體并轉(zhuǎn)化馬鈴薯，結(jié)果15株轉(zhuǎn)基因植株中有12株可以表達siRNAs，并且能對三種不同亞型的PVY表現(xiàn)出高強度的抗性(Missiou A, Kalantidis K, Boutla A, et al. Generation of transgenic potato plants highly resistant to potato virus Y (PVY) through RNA silencing. Mol Breed, 2004， 14: 185—197)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明利用基因工程手段及RNAi技術(shù)，目的是提供一種培育抗黃瓜花葉病毒植物的方法，抗黃瓜花葉病毒植物能表達黃瓜花葉病毒復(fù)制酶基因Ia的發(fā)夾RNA，在細胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄形成具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的Ia雙鏈RNA分子，誘導(dǎo)細胞產(chǎn)生RNA干涉，并形成Ia的小干涉 RNA，特異性的抑制病毒的侵染。病毒侵染過程中，在植物被侵染組織或其它組織都能檢測到長度為21nt的雙鏈 siRNAs存在，由此可見PTGS的激活。PTGS作為一種RNA介導(dǎo)的防衛(wèi)反應(yīng)能維持植物基因組的穩(wěn)定性和保護植物免受病毒侵染。利用RNAi技術(shù)并結(jié)合轉(zhuǎn)基因技術(shù)能高頻率大規(guī)模產(chǎn)生病毒抗性植物。從生物安全性方面考慮，利用RNAi提高植物的病毒抗性也是一種很好的方法。dsRNA在植物中很快被降解成siRNAs，因此不會積累所轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，更不可能表達形成外源蛋白。在CMV (黃瓜花葉病毒)復(fù)制過程中，RNAl編碼的Ia蛋白起解旋酶和甲基轉(zhuǎn)移酶的功能。此外，CMV Ia蛋白可以和Tcoil相互作用，控制CMV的傳播，引發(fā)CMV系統(tǒng)性侵染。本發(fā)明克隆CMV的復(fù)制酶基因7a的⑶嫩片段，長344bp，位于CMV辦全長基因序列的 1673bp-2016bp之間，并將這個基因片段構(gòu)建到RNAi高通量表達載體pHellsgate〗上，再通過根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化法將RNAi植物表達載體導(dǎo)入煙草中并穩(wěn)定表達，以重組載體T-DNA上具有的卡那霉素標記篩選轉(zhuǎn)化子，并通過聚合酶鏈式反應(yīng)(Polymerase Chain Reaction, PCR)獲得真正的轉(zhuǎn)基因植株，然后將得到的陽性轉(zhuǎn)基因煙草植株接種CMV，觀察發(fā)病情況并分析轉(zhuǎn)基因煙草植株的抗性差異，最后得到具有CMV抗性的煙草植株。本發(fā)明提供的方法具體操作如下
(1)從感染黃瓜花葉病毒的植物組織中克隆CMVIa基因的CDNA片段；
(2)將克隆的cDNA片段與RNAi高通量植物表達載體pHellsgate〗進行BP重組反應(yīng)， 構(gòu)建CMV la RNAi植物表達載體；
(3)將構(gòu)建的CMVIa的RNAi植物表達載體通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)入目標植物中；
(4)以重組載體T-DNA上具有的抗性標記篩選轉(zhuǎn)化子，并通過聚合酶鏈式反應(yīng)獲得真正的轉(zhuǎn)基因植株，接種黃瓜花葉病毒，最后篩選出對黃瓜花葉病毒抗性明顯增強的轉(zhuǎn)基因植株。本發(fā)明構(gòu)建的CMV la RNAi植物表達載體具有黃瓜花葉病毒復(fù)制酶基因Ia的發(fā)夾RNA (hpRNA)表達盒。本發(fā)明中7a發(fā)夾RNA表達盒具有CaMV35S啟動子、表達7a基因發(fā)夾RNA的DNA 分子以及Nos終止子；表達Ia發(fā)夾RNA的DNA分子由三個組件構(gòu)成，中間組件為一個內(nèi)含子，兩邊組件分別為344bp的黃瓜花葉病毒復(fù)制酶辦基因片段，且為兩邊組件為反向重復(fù)序列。此表達盒能在植物細胞中形成CMV辦的具發(fā)夾結(jié)構(gòu)的雙鏈RNA，誘導(dǎo)細胞產(chǎn)生 RNAi，從而阻止病毒的復(fù)制擴張，保護植物不受病毒危害。本發(fā)明為提高煙草、黃瓜、百合等植物對黃瓜花葉病毒病害的抗性提供了一種新的方法，通過基因工程手段培育抗病毒植物能克服傳統(tǒng)育種的不足，不僅育種周期短，而且操作簡單，容易獲得高抗材料。本發(fā)明利用植物基因工程的技術(shù)手段，構(gòu)建病毒基因片段的 RNAi表達載體并在植物中表達病毒基因的hpRNA，誘發(fā)植物產(chǎn)生RNAi，從而使植物能夠抵抗病毒的侵染。該發(fā)明為農(nóng)作物的大規(guī)模生產(chǎn)提供方便，大量減少抗病毒制劑的使用，為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)節(jié)約成本、減小環(huán)境污染且提高管理水平，因此本發(fā)明具有廣闊的市場應(yīng)用前景。


圖1是部分轉(zhuǎn)基因煙草基因組DNA的PCR凝膠電泳圖譜。Marker :DL2000 DNA Marker (大連寶生物)，由 2，OOObp、1，000bp、750bp、500bp、250bp 以及 IOObp 六條 DNA 片段組成。正對照以CMV la RNAi植物表達載體質(zhì)粒為模板的PCR產(chǎn)物；WT 以非轉(zhuǎn)基因煙草總DNA為模板的PCR產(chǎn)物。
圖2是轉(zhuǎn)基因煙草病毒抗性分析效果圖。A 野生型煙草(WT)接種CMV兩周后的葉片；B 轉(zhuǎn)基因煙草接種CMV兩周后的葉片。圖3是轉(zhuǎn)基因煙草接種CMV兩周后葉片的RT-PCR凝膠電泳圖譜。Marker :DL2000 DNA Marker，其余泳道為部分轉(zhuǎn)基因煙草株系。圖4是野生型煙草接種CMV兩周后葉片的RT-PCR凝膠電泳圖譜。Marker :DL2000 DNA Marker ；WT1、WT3、WT5、WT7為野生型煙草未接種CMV葉片的擴增結(jié)果；WT2、WT4、WT6、 WT8為野生型煙草接種CMV葉片的擴增結(jié)果。
具體實施例方式
實施例1
UCMV辦基因片段的擴增和序列分析
用液氮將帶有CMV癥狀的百合葉片研磨成粉末，轉(zhuǎn)入1. 5ml的離心管中，采用改良的異硫氰酸胍法提取總RNA。采用逆轉(zhuǎn)錄酶M-MLV (promega)以總RNA為模板合成cDNA第一鏈，反應(yīng)體系和操作過程為取8 μ g Total RNA，依次加入50 ng oligo (dT)、4 μ L ddH20 (RNase-free)至反應(yīng)體積為12. 5 μ L ；混勻后，70°C加熱變性5min后迅速在冰上冷卻 5min，然后依次加入 2 μ L dNTP (2. 5mM each)、4 μ L M-MLV 5 Xbuffer,0. 5 μ L 核酸酶抑制劑RNasin (2_、1 μ L反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV (200U)，混勻并短時離心，42°C溫浴1. 5h，取出后95°C加熱5min，終止反應(yīng)。cDNA第一鏈合成后置于_20°C保存?zhèn)溆谩?
以合成的第一鏈cDNA為模板，擴增目的基因7a，所用引物序列分別為 5， -AGGTATCGGACAGTCCTGAGACG-3’ 和 5’ -CACAGGACGCATCCACC
GA-3’，采用大連寶生物的高保真DNA聚合酶ex taq擴增出目的基因。PCR反應(yīng)條件94 "C 2min ；94 "C 30s, 60 "C 30s, 72 "C 30s，32 個循環(huán)；72 "C IOmin0 反應(yīng)體系(20 μ L) SlyL cDNA、2 μ L Ex taq Buffer U. 5 μ L dNTP (2.5 mM each) >0. 1 μ L 正向引物 (20μΜ),0. 1 μ L 反向引物 QO μΜ)、0·2 μ L Ex Taq DNA 聚合酶(5 U/μ L)、15.1 μ L 重蒸水dc!H20。PCR結(jié)束后通過瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物的特異性以及大小，點樣量為 5 μ L0由于PCR產(chǎn)物只有一條DNA帶，且符合預(yù)期設(shè)計的大小，故直接對PCR產(chǎn)物進行 TA克隆，使用的試劑盒為pMDIS-T vector kit (大連寶生物)，反應(yīng)體系和操作過程為取 1. 5 μ L PCR 產(chǎn)物，依次加入 1 μ L pMD18-T 載體(50 ng/ μ L)和 2. 5 μ L 2 X Ligation solution I (連接液)，混勻后置于16°C過夜反應(yīng)。采用熱激轉(zhuǎn)化法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入到大腸桿菌DH5ci中，再涂于含有氨芐青霉素(ampicillin，Amp)的LB固體平板上，篩選陽性克隆。挑單菌落，搖菌，之后用擴增CMV辦的特異引物進行PCR檢測。將檢測出的陽性克隆進行序列測定，最終獲得CMV片段長344bp，位于CMV辦全長基因序列的 1673bp-2016bp 之間。通過 NCBI BLAST (http //blast, ncbi. nlm. nih. gov/Blast. cgi)分析發(fā)現(xiàn)克隆的基因片段與不同植物CMV分離物Ia基因序列的同源性達到99%以上。2,CMV la RNAi植物表達載體和含有CMV la RNAi表達載體質(zhì)粒的農(nóng)桿菌的構(gòu)建采用堿裂解法提取插入CMV辦的大腸桿菌質(zhì)粒pMD-18T-7a以及RNAi表達載
體pHellsgatd的質(zhì)粒，取1 PL用于瓊脂糖凝膠電泳以檢測所提取質(zhì)粒的完整性和濃度高低。用含有attBl和attB2接頭的引物擴增pMD-18T_7a，所用引物序列分別為 5， -GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTGCAGGTATC GGACAGTCCTGAGACG-3，禾口 5' -GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGG
GTCCACAGGACGCATCCACCG A-3，，PCR 反應(yīng)條件為95 "C 2 min ；94 "C 30 s，60 "C 30s, 72 "C 40 s, 28 cycles ；72 "C 5 min。反應(yīng)體系(20 μ L)為·Λ yL 質(zhì)粒模板 ，2 μ L Ex taq Buffer、1. 5 μ L dNTP (2· 5 mM each)、0· 1 μ L 正向引物(20 μ Μ)、0· 1 μ L 反向引物(20 μΜ)、0·2 μ L Ex Taq DNA 聚合酶(5 U/μ L)、15.1 μ L ddH20。PCR 結(jié)束后，取 5 μ L PCR產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物的大小以及濃度。上述attB-PCR產(chǎn)物大小略微大于400bp，符合預(yù)期值，并且沒有雜帶，直接用PCR 產(chǎn)物進行BP重組反應(yīng)。將BP Clonase II enzyme mix (invitrogen)在冰上解凍2min， 并短時渦旋2次，在0.5 mL離心管中依次加入下面的試劑2 μ L attB-PCR產(chǎn)物(10 ng/ μ L), 1 μ L pHellsgate2 質(zhì)粒(150 ng/μ L)，2 μ L BP Clonase II。短時渦旋 2 次充分混勻反應(yīng)物，短時離心收集反應(yīng)物到管底。置于25 ° C水浴鍋中反應(yīng)4 h后加入1 yL 蛋白酶K，短時渦旋，37 ° C溫育10 min中止反應(yīng)。取2 yL BP反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH10B，篩選抗生素為壯觀霉素。挑取若干個單克隆搖菌提質(zhì)粒，同一個克隆的質(zhì)粒分別用損al、損ol酶切，檢測兩個位點是否同時重組上外源基因片段，兩種酶切產(chǎn)物理論上大小相同，且都與PCR產(chǎn)物大小相當。經(jīng)酶切驗證符合要求的質(zhì)粒，即CMV Ia與pHellsgatd成功重組的克隆，在陽性菌株中加入20%甘油混勻，置于-80°C保存?zhèn)溆谩Ｓ脡A裂解法提取并純化上述大腸桿菌中的CMV la RNAi表達載體的質(zhì)粒。制備農(nóng)桿菌LBA4404菌株的感受態(tài)細胞，操作過程為將實驗室保存的LBA4404菌株在LB固體培養(yǎng)基(含利福平20mg/L)上劃線，28°C培養(yǎng)至長出單菌落后，挑取一個單克隆于含20mg/L 利福平的2 mL LB液體培養(yǎng)基，28°C振蕩培養(yǎng)至混濁；取5 mL菌液轉(zhuǎn)接于含20mg/L利福平的100 mL LB液體培養(yǎng)基中，28°C振蕩培養(yǎng)至OD600為0. 5 ；4°C離心5min (5，000g/min)收集菌體，棄上清，加入10 mL預(yù)冷的0. IM CaCl2,輕輕充分懸浮菌體，冰浴20min ；接著4°C 離心5min (5, 000g/min)收集菌體，棄上清，加入4 mL預(yù)冷的含15%甘油的0. IM CaCl2溶液，輕輕懸浮后分裝于1.5 mL離心管中，每管200 μ L，液氮速凍后置于-80°C保存?zhèn)溆谩２捎靡旱獌鋈诜▽⑸鲜鰳?gòu)建的CMV la RNAi植物表達載體轉(zhuǎn)入所制備的農(nóng)桿菌 LBA4404感受態(tài)細胞中。操作步驟為取2 μ g質(zhì)粒加入含有200 μ L感受態(tài)細胞的離心管中，輕輕混勻后冰浴5min，接著轉(zhuǎn)入液氮中冷凍lmin，然后迅速置于37°C水浴5min，之后立即冰浴2min，加入800 μ L LB液體培養(yǎng)基，28°C振蕩培養(yǎng)4h。將活化后的農(nóng)桿菌涂于含有50mg/L Km的LB固體培養(yǎng)基上，28°C倒置培養(yǎng)。挑選單菌落搖菌，用擴增CMV 7a的特異引物進行PCR，檢測重組載體是否轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中。對于陽性克隆，加入20%甘油混勻后置于-80°C保存?zhèn)溆谩?、農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物遺傳轉(zhuǎn)化以及轉(zhuǎn)基因植物篩選
本實驗的轉(zhuǎn)基因受體是煙草mcotiana tabacum L.)。將煙草的種子用75%的酒精浸泡30s，用無菌水洗滌后用0. 1%的HgCl2浸泡8min，然后再用無菌水洗滌若干次，播種于 1/2 MS培養(yǎng)基上，28°C暗培養(yǎng)5-8d，發(fā)芽后轉(zhuǎn)至光照培養(yǎng)箱(25°C，16h/d光照)，以后每月用MS培養(yǎng)基繼代一次。從_80°C冰箱中取出保存的含有CMV la RNAi表達載體質(zhì)粒的農(nóng)桿菌LBA4404菌種，接種于5 mL含有50mg/L K m和20mg/L利福平的LB液體培養(yǎng)基中，28°C培養(yǎng)至渾濁。吸取ImL渾濁的菌液至含有50mg/L Km的LB固體培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng)48h。將LB固體培養(yǎng)基上的農(nóng)桿菌刮下適量接種于MGL液體培養(yǎng)基中，附加一定量的乙酰丁香酮，28°C振蕩培養(yǎng)
2-3h以活化農(nóng)桿菌。取煙草的無菌苗葉子切成Icm2左右的葉盤，完全浸泡于上述含有活化農(nóng)桿菌的 MGL液體培養(yǎng)基中15min。用無菌濾紙吸干葉片表面的菌液，將葉盤置于共培養(yǎng)基上進行室溫培養(yǎng)。煙草轉(zhuǎn)化的共培養(yǎng)基為MS+0. 02mg/L 6-BA+2 mg/L NAA+30g/L蔗糖，培養(yǎng)時間為 2d。將共培養(yǎng)后的葉盤轉(zhuǎn)到加有抗生素的篩選培養(yǎng)基中分化成苗，同時篩選轉(zhuǎn)基因植株。 煙草篩選培養(yǎng)基 MS+0. 5mg/L 6-BA+O. lmg/LNAA+30g/ 蔗糖 +50mg/LKm+200mg/L 頭孢霉素 (cefotaxime sodium salt，Cef)。篩選培養(yǎng)時將培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)移至光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)(25°C，16h/ d光照，8h/d黑暗)。煙草出芽后，用含有50mg/L Km和200mg/L Cef的MS培養(yǎng)基繼代培養(yǎng)。 因煙草愈傷分化率較高，故需要對再生植株進行進一步篩選。將煙草再生苗移至含有50mg/ L Km (卡那霉素)和200mg/L Cef (頭孢霉素)的MS培養(yǎng)基上使其生根，最后選用生根較好的再生苗進行分子水平的檢測。采用植物總DNA的快速少量抽提法(CTAB)提取轉(zhuǎn)基因煙草植株葉片的基因組DNA，將提取的基因組DNA取1 μ L通過瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性和濃度。以轉(zhuǎn)基因植株的基因組DNA為模板、以新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因NPT # (位于pHellsgate 2 T-DNA區(qū)段，作為轉(zhuǎn)基因陽性轉(zhuǎn)化子的抗性篩選標記)設(shè)計特異引物進行PCR，引物序列為 5，-CCCTGATGCTCTTCGTCCA-3，和 5，-CTCTGATGCCGCCGTGTT-3，。PCR 反應(yīng)條件為95 "C 2 min ；94 "C 30 s，60 "C 30 s，72 "C 50 s，28 cycles ；72 "C 2min。反應(yīng)體系為1 yL 煙草總 DNA，0.2 μ L 正向引物，0.2 μ L 反向引物，9 μ 2Xpower Taq PCR MasterMix, 10. 6 μ ddH20。PCR結(jié)束后，取8 μ L產(chǎn)物用于瓊脂糖凝膠電泳以檢測陽性轉(zhuǎn)基因植株。由于陽性轉(zhuǎn)基因煙草基因組中整合了 CMV la RNAi表達載體的T-DNA，因此能擴增出長度為679bp 的MT#基因特征條帶，部分轉(zhuǎn)基因煙草植株的擴增結(jié)果如圖1所示。轉(zhuǎn)基因煙草共篩選到41株陽性植株，分別編號為1 41。4、轉(zhuǎn)基因煙草的CMV抗性分析
首先制備黃瓜花葉病毒粗提液。取5g辣椒CMV癥狀病樣組織加IOOml抽提緩沖液
，在研缽中研磨均勻，尼龍紗布過濾，濾液加25%氯仿，震蕩15min，置4°C冰箱lh，然后5000rpm/min離心20min，取上清加8% 的聚乙二醇(PEG6000)、3% NaCl，攪拌至PEG完全溶解，置4°C冰箱內(nèi)4h，8000rpm/min離心 30min,取沉淀，用ddH20懸浮過夜，8000rpm/min離心30min，取上清液，沉淀用ddH20再懸浮一次，兩次上清液合并，并加入8%PEG、3%NaCl沉淀，再用少量的ddH20過夜懸浮沉淀，最后 8000rpm/min離心lOmin，收獲的上清液即為病毒粗提液。挑選PCR檢測為陽性的轉(zhuǎn)基因煙草植株，移栽到盛有培養(yǎng)液的三角瓶中。待長出
3-4片新葉后，使用摩擦接種法對各陽性株的葉片進行接種，操作過程為預(yù)備接種的植株置于25°C培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)24h，接種葉片上撒少量500目石英砂，蘸取少量的病毒粗提液， 以逆著葉脈的方向輕輕摩擦葉片，放置15min后，接種植株用清水沖洗干凈后置于暗室培養(yǎng)過夜，再放置進光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)。兩周后取接種葉片進行RT-PCR檢測，每株檢測4-6片葉，具體步驟如下選取接種后煙草葉片，采用異硫氰酸胍法，提取總RNA。用RT-PCR方法檢測CMV感染情況，RT-PCR反應(yīng)條件同步驟1，以合成的第一鏈cDNA為模板，使用CMV CF基因引物進行PCR擴增，引物序列為5’ -CCAACTATTAACCACCCAA
CCTT-3，和 5，-TGCTCGACGTCAACATGAAGTAC-3，，PCR 反應(yīng)條件為95 "C 2 min ；94 "C 30 s, 58 "C 30s, 72 "C 40 s，28 個循環(huán)；72 "C 5 min。反應(yīng)體系(20 μ L)為2 μ L cDNA, 0.2 μ L 正向引物，0.2 μ L 反向引物，2 μ IOXReaction Buffer (反應(yīng)緩沖液)，1. 5 μ dNTP Mix (2 mM), 2 μ MgCl2,0. 3 μ Taq PCR 聚合酶(5 U/μ L), 12. 8 μ ddH20。接種煙草葉片感染CMV后，即能通過RT-PCR檢測到CMV CF基因470bp的擴增產(chǎn)物。如果被檢測植株具有對CMV侵染的抗性，葉片RT-PCR檢測結(jié)果不會出現(xiàn)CP基因的特征條帶。
野生型煙草和轉(zhuǎn)基因煙草接種CMV后的表型觀察結(jié)果如圖2所示。接種CMV的野生型煙草葉片出現(xiàn)扭曲，失去光澤，葉色濃淡不均，并出現(xiàn)黃綠相間的花葉癥狀，而轉(zhuǎn)基因煙草葉片個別表現(xiàn)輕微的花葉癥狀，大部分沒有CMV感染的癥狀。轉(zhuǎn)基因煙草接種CMV后的RT-PCR檢測結(jié)果如圖3、圖4所示。野生型煙草接種CMV 后，葉片RT-PCR檢測呈陽性，即能從葉片中檢測到CMV衣殼蛋白基因CP的表達；而接種 CMV的20株la RNAi載體轉(zhuǎn)基因煙草中，有4株的所有檢測葉片均未受CMV侵染，有8株僅有個別葉片受CMV侵染。顯然，7a RNAi載體轉(zhuǎn)基因煙草對CMV的抗性較野生型明顯增強。 CMV Ia雙鏈RNA在煙草中的表達使轉(zhuǎn)基因煙草對CMV侵染產(chǎn)生了不同程度的抗性。
權(quán)利要求
1.一種培育抗黃瓜花葉病毒植物的方法，其特征在于具體操作如下(1)從感染黃瓜花葉病毒的植物組織中克隆CMVIa基因的CDNA片段；(2)將克隆的cDNA片段與RNAi高通量植物表達載體pHellsgate〗進行BP重組反應(yīng)， 構(gòu)建CMV la RNAi植物表達載體；(3)將構(gòu)建的CMVIa的RNAi植物表達載體通過根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)入目標植物中；(4)以重組載體T-DNA上具有的抗性標記篩選轉(zhuǎn)化子，并通過聚合酶鏈式反應(yīng)獲得真正的轉(zhuǎn)基因植株，接種黃瓜花葉病毒，最后篩選出對黃瓜花葉病毒抗性明顯增強的轉(zhuǎn)基因植株。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的培育抗黃瓜花葉病毒植物的方法，其特征在于CMV辦基因的 cDNA片段長:344bp，位于CMV Ia全長基因序列的1673bp_2016bp之間。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的培育抗黃瓜花葉病毒植物的方法，其特征在于黃瓜花葉病毒 Ia基因RNAi植物表達載體具有黃瓜花葉病毒Ia基因發(fā)夾RNA表達盒。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的培育抗黃瓜花葉病毒植物的方法，其特征在于黃瓜花葉病毒Ia基因發(fā)夾RNA表達盒從上游至下游依次為花椰菜花葉病毒的35S啟動子、表達Ia 基因發(fā)夾RNA的DNA分子和終止子。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的培育抗黃瓜花葉病毒植物的方法，其特征在于表達7a發(fā)夾 RNA的DNA分子由三個組件構(gòu)成，中間組件為一個內(nèi)含子，兩邊組件分別為344bp的黃瓜花葉病毒復(fù)制酶辦基因片段。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的培育抗黃瓜花葉病毒植物的方法，其特征在于表達7a發(fā)夾RNA的DNA分子的內(nèi)含子兩端的組件為反向互補的基因序列。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的培育抗黃瓜花葉病毒植物的方法，其特征在于表達7a發(fā)夾 RNA的DNA分子的內(nèi)含子兩端的組件為反向互補的基因序列。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的培育抗黃瓜花葉病毒植物的方法，其特征在于表達7a發(fā)夾 RNA的DNA分子的內(nèi)含子兩端的組件為反向互補的基因序列。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種培育抗黃瓜花葉病毒植物的方法。本發(fā)明克隆黃瓜花葉病毒的復(fù)制酶基因1a的cDNA片段，長344bp，位于CMV1a全長基因序列的1673bp-2016bp之間，并將這個基因片段構(gòu)建到RNAi高通量表達載體pHellsgate2上，再通過根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化法將RNAi植物表達載體導(dǎo)入煙草中并穩(wěn)定表達，最后獲得抗病毒的煙草植株；通過實驗證實在植物中表達病毒基因片段的雙鏈RNA能誘發(fā)RNA干涉的發(fā)生，進而產(chǎn)生相應(yīng)基因的小干涉RNA，并特異性的抑制病毒的侵染，篩選的轉(zhuǎn)基因煙草對黃瓜花葉病毒侵染具有明顯的抗性。
文檔編號A01H5/00GK102286525SQ201110232449
公開日2011年12月21日 申請日期2011年8月15日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月15日
發(fā)明者丁為群, 劉迪秋, 周阿濤, 田榮歡, 葛鋒, 賀欣, 陳朝銀, 饒健 申請人:昆明理工大學(xué)