專利名稱：一種培育抗黃瓜花葉病毒植物的方法
技術領域：
本發明涉及一種培育抗黃瓜花葉病毒植物的方法，屬于基因工程領域。
背景技術：
植物病毒病有植物“癌癥”之稱，每年因病毒病對農作物所造成的經濟損失約數百億元。植物病毒必須在寄主細胞內專性寄生生活，雖然一些病毒只能侵染某一種或某些植物，也有少數病毒危害十分廣泛，如黃瓜花葉病毒(Cucumber mosaic virus, CMV)。CMV在世界范圍內普遍發生，并且寄主范圍最廣，能侵染約65科885種植物。因其引起病害的重要性，CMV已經成為世界范圍內最重要的植物RNA病毒，也是目前研究最多的植物RNA病毒之一。CMV是雀麥花葉病毒科(Bromoviridae)黃瓜花葉病毒屬(Cucumovirus)的成員， 基因組由3條正義單鏈RNA組成，根據大小依次命名為RNA1、RNA2和RNA3。RNAl編碼Ia 蛋白。Ia蛋白是CMV復制酶復合體的一個亞單位，在CMV復制過程中起到解旋酶和甲基轉移酶的功能。此外，CMV Ia蛋白在病毒移動過程中也起重要的作用。RNA2編碼加蛋白，即復制酶復合體中依賴RNA的RNA聚合酶(RNA-d印endent RNA polymerase, RdRP), 2a 與Ia蛋白協同作用形成復制復合體。在CMV復制過程中，首先la_2a與一些寄主蛋白組成的RNA依賴的RNA聚合酶合成反義鏈RNA，然后la-加斷開，再由磷酸化的加和一些寄主蛋白共同起作用合成正義鏈 RNA (Seo JK, Kwon SJ, Choi HS, et al. Evidence for alternate states of Cucumber mosaic virus replicase assembly in positive- and negative-strand RNA synthesis. Virology, 2009，383 O) : 248J60)。RNA3 編碼運動蛋白(movement protein,MP)和衣殼蛋白(coat protein,CP)分別負責病毒的長距離移動和衣殼化。另外，由RNA2的亞基因組RNA4表達產生的大小為ll_13KDa蛋白2b，是轉錄后基因沉默(post-transcriptional gene silencing,PTGS)的抑制蛋白(Brigneti G, Voinnet O, Li WX, et al. Viral pathogenicity determinants are suppressors of transgene silencing in Nicotiana benthamiana. EMBO J, 1998, 17: 6739—6746)。由于病毒對植物寄生性生活，其復制所需要的能量、物質場所等完全由寄主細胞提供，因而病毒病的防治十分困難。到目前為止，對病毒病的防治主要有三種方法。一是化學防治法，但因其對植物的絕對寄生性和發病的獨特性使得化學防治等常規措施難以發揮作用，而且還存在化學農藥的污染問題。二是可利用脫毒技術獲得無毒繁殖材料。但其只適用于鱗莖、接穗等，使用范圍有限。三是預防為主、綜合防治，一方面消滅侵染來源和傳播介體；另一方面采取增強植物抗病力、培育和推廣耐病或抗病品種等。雖然這些傳統方法能夠不同程度的降低病毒發病的嚴重程度，但不能從根本上解決問題。近年來，病毒分子生物學的發展和植物基因工程技術的出現為防治植物病毒病開辟了新的途徑。在植物抗病毒基因工程研究方面，主要采用3種策略提高植物的病毒抗性 一是植物病毒來源基因介導的抗性(pathogen-derived resistance,PDR) ；二是植物、微生物的核糖體失活蛋白(ribosome inactivating proteins, RIPs)；三是利用植物中自然存在的抗性基因。目前PDR已成為遺傳工程中增強作物對病毒抗性的主要措施之一(Prins M, Laimer M, Noris E, el at. Strategies for antiviral resistance in transgenic plants. Mol Plant Pathol, 2008， 9: 73-83)。RNA干涉(RNA interference，RNAi)是由雙鏈RNA (double-stranded RNA, dsRNA) 引起的序列特異性基因沉默，可以調節關閉基因的表達，進而調控細胞的各種高級生命活動(Denli AM, Hannon GJ. RNAi an ever-growing puzzle. Trends Biochem Sci, 2003，28: 196-201)。RNAi是由dsRNA誘導的多步驟、多因素參與的過程，是生物體的一種防御機制，普遍存在于絕大多數真核細胞中。在這個過程中，兩種類型的小RNA發揮了核心功能作用，即長度為2H6nt的小干涉RNA (small intertering RNA，siRNA)和miRNA (microRNA)。dsRNA是RNAi的激發子，長的dsRNA被核糖核酸酶Dicer識別并剪切成長度為2H6nt的siRNA。接著siRNA被RNA誘導的干涉復合體(RNA-induced silencing complex, RISC)識別、解鏈，并以單鏈RNA的形式與RISC結合，隨后直接剪切具有siRNA同源序列的mRNA，阻斷其翻譯成蛋白。來自于非編碼RNA基因莖環結構轉錄前體的小RNA稱為miRNAs。siRNAs和miRNAs介導的基因沉默都屬于轉錄后水平的基因沉默。RNAi是一項自然發生的高效的病毒防御機制。利用RNAi技術的原理設計合成與病毒同源的dsRNA，并將其導入植物，植物的RNAi機制受到激發并對病毒基因組進行特異性切割降解，阻止病毒的復制擴張，從而保護植物不受病毒危害。克隆CMV長747bp的 CF基因cDNA片段，并構建至植物表達載體，即在花椰菜花葉病毒(cauliflower mosaic virus, CaMV) 35S啟動子后面同時插入正義和反義的CF cDNA序列，中間插入一個內含子將其分開，形成一個反向重復序列。將構建的表達載體導入到煙草中，轉基因植株中CMV CF雙鏈RNA的表達產生了小的干涉RNA，118株轉基因植株中有20株產生了對CMV的抗性 (Kalantidis K, Psaradakis S, Tabler M, et al. The occurrence of CMV-specific short RNAs in transgenic tobacco expressing virus-derived double-stranded RNA is indicative of resistance to the virus. Mol Plant Microbe interact, 2002, 15: 826-833)。以馬鈴薯Y病毒(Photo virus Y, PVY)的3’端保守序列設計引物，構建RNAi 表達載體并轉化馬鈴薯，結果15株轉基因植株中有12株可以表達siRNAs，并且能對三種不同亞型的PVY表現出高強度的抗性(Missiou A, Kalantidis K, Boutla A, et al. Generation of transgenic potato plants highly resistant to potato virus Y (PVY) through RNA silencing. Mol Breed, 2004， 14: 185—197)。

發明內容
本發明利用基因工程手段及RNAi技術，目的是提供一種培育抗黃瓜花葉病毒植物的方法，抗黃瓜花葉病毒植物能表達黃瓜花葉病毒復制酶基因為的發夾RNA，在細胞內轉錄形成具有發夾結構的2a雙鏈RNA分子，誘導細胞產生RNA干涉，并形成2a的小干涉 RNA，特異性的抑制病毒的侵染。在CMV中，RNA2編碼加蛋白，即復制酶復合體中依賴RNA的RNA聚合酶 (RNA-dependent RNA polymerase, RdRP)，2a與Ia蛋白協同作用形成復制復合體。在CMV 復制過程中，首先la-2a與一些寄主蛋白組成的RNA依賴的RNA聚合酶合成負義鏈RNA，然后la-加斷開，再由磷酸化的加和一些寄主蛋白共同起作用合成正義鏈RNA。本發明利用植物基因工程技術手段，從感染CMV的病葉組織中克隆CMV的復制酶基因2a的cDNA片段，長 308bp，位于CMV 2a全長基因序列的1207bp_1515bp之間，接著將該基因片段構建到RNAi 高通量表達載體pHellsgatd上，再通過根癌農桿菌介導的遺傳轉化法將CMV 2a RNAi植物表達載體導入煙草中并穩定表達，并以重組載體T-DNA上具有的抗性標記篩選轉化子， 通過聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction, PCR)獲得真正的轉基因植株，然后對陽性轉基因煙草植株接種CMV，定期觀察發病情況，分析轉基因煙草植株對CMV的抗性，最后得到具有CMV抗性的轉基因煙草植株。病毒侵染過程中，在植物被侵染組織或其它組織都能檢測到長度為21nt的雙鏈 siRNAs存在，由此可見PTGS的激活。PTGS作為一種RNA介導的防衛反應能維持植物基因組的穩定性和保護植物免受病毒侵染。利用RNAi技術并結合轉基因技術能高頻率大規模產生抗病毒植物。從生物安全性方面考慮，利用RNAi提高植物的病毒抗性也是一種很好的方法。dsRNA在植物中很快被降解成siRNAs，因此不會積累所轉基因的轉錄產物，更不可能表達形成外源蛋白。本發明提供的方法具體操作如下
(1)從感染黃瓜花葉病毒的植物組織中克隆獲得CMV2a的CDNA片段；
(2)將克隆的cDNA片段與RNAi高通量表達載體pHellsgatd進行BP重組反應，構建 CMV 2a RNAi植物表達載體；
(3)將構建CMV2a的RNAi表達載體通過根癌農桿菌介導轉入目標植物中；
(4)以重組載體T-DNA上具有的抗性標記篩選轉化子，并通過聚合酶鏈式反應獲得真正的轉基因植株，接種黃瓜花葉病毒，觀察發病情況，最后篩選出對CMV抗性明顯增強的轉基因植株。本發明構建的CMV為RNAi植物表達載體含有來源于黃瓜花葉病毒復制酶基因為基因序列的發夾RNA (hpRNA)的表達盒。本發明中為發夾RNA表達盒含有CaMV35S啟動子、表達為基因發夾RNA的DNA 分子和Nos終止子；表達為基因發夾RNA的DNA分子由三個組件構成，兩段反向重復序列之間由內含子分隔，兩邊組件分別為308bp的黃瓜花葉病毒復制酶為基因片段。本發明為提高煙草、黃瓜、百合等植物對黃瓜花葉病毒病害的抗性提供了一種新的方法，通過基因工程手段培育抗病毒植物能克服傳統育種的不足，不僅育種周期短，而且操作簡單，容易獲得高抗材料。本發明利用RNAi技術以及基因工程手段，構建CMV 2a RNAi 表達載體并在植物中表達病毒基因的hpRNA，誘導植物產生RNAi，從而使植物能夠抵抗病毒的侵染。它可以為農作物的大規模生產提供方便，大量減少抗病毒化學制劑的使用，為農業生產節約成本、減小環境污染且提高管理水平，因此本發明具有廣闊的市場應用前景。


圖1是部分轉基因煙草基因組DNA的PCR凝膠電泳圖譜。Marker :DL2000 DNA Marker (大連寶生物)，由 2，OOObp、1，000bp、750bp、500bp、250bp 以及 IOObp 六條 DNA 片段組成。正對照以CMV 2a RNAi植物表達載體質粒為模板的PCR產物；WT 以非轉基因煙草(野生型，WT)總DNA為模板的PCR產物。
圖2是轉基因煙草病毒抗性分析效果圖。A 轉基因煙草接種CMV兩周后的發病情況；B 野生型煙草(WT)接種CMV兩周后的發病情況。圖3是轉基因煙草接種CMV兩周后葉片的RT-PCR凝膠電泳圖譜。Marker :DL2000 DNA Marker，其余泳道為部分轉基因煙草株系。圖4是野生型煙草接種CMV兩周后葉片的RT-PCR凝膠電泳圖譜。Marker :DL2000 DNA Marker ；WT1、WT3、WT5、WT7、WT9為野生型煙草未接種CMV葉片的擴增結果；WT2、WT4、 WT6、WT8、WT10為野生型煙草接種CMV葉片的擴增結果。
具體實施例方式實施例1
UCMV 2a基因片段的擴增和序列分析
用液氮將帶有CMV癥狀的百合葉片研磨成粉末，轉入1. 5ml的離心管中，采用改良的異硫氰酸胍法提取總RNA。采用逆轉錄酶M-MLV (promega)以總RNA為模板合成cDNA第一鏈，反應體系和操作過程為取8 μ g Total RNA，依次加入50 ng oligo (dT)、4 μ L ddH20 (RNase-free)至反應體積為12. 5 μ L ；混勻后，70°C加熱變性5min后迅速在冰上冷卻 5min，然后依次加入 2 μ L dNTP (2. 5mM each)、4 μ L M-MLV 5 Xbuffer,0. 5 μ L 核酸酶抑制劑RNasin (2_、1 μ L反轉錄酶M-MLV (200U)，混勻并短時離心，42°C溫浴1. 5h，取出后95°C加熱5min，終止反應。cDNA第一鏈合成后置于_20°C保存備用。以合成的第一鏈cDNA為模板，擴增目的基因CMV為，所用引物序列分別為 5，-GTCTAGATTGAGTAAAGCTGTGGCT-3，和 5，-TGAATAACGGTGAGAACT GGGAG-3，。采用大連寶生物的高保真DNA聚合酶Ex Taq擴增出目的基因。PCR反應條件94 V 2min ；94 V 30s, 59 "C 30s, 72 "C 30s，32 個循環；72 "C IOmin0 反應體系 QO μ L)為 1 μ L cDNA、2 μ L Ex taq BufferU. 5 μ L dNTP (2· 5 mM each)、0· 1 μ L 正向引物 QO μ Μ)、0· 1 μ L 反向引物 QO μΜ)、0. 2 μ L Ex Taq DNA 聚合酶(5 U/μ L) ,15. 1 μ L 重蒸水 ddH20。PCR 結束后通過瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物的特異性以及大小，點樣量為5 μ L。由于PCR產物只有一條DNA特征帶，且符合預期設計的大小，故直接對PCR產物進行TA克隆，使用的試劑盒為pMDIS-T vector kit (大連寶生物)，反應體系和操作過程為 取 1.5 μ L PCR 產物，依次加入 1 μ L pMD18_T 載體(50 ng/μ L)和 2. 5 μ L 2 X Ligation solution I (連接液)，混勻后置于16°C過夜反應。采用熱激轉化法將連接產物轉入到大腸桿菌DH5ci中，再涂于含有氨芐青霉素(ampicillin，Amp)的LB固體平板上，篩選陽性克隆。挑單菌落，搖菌，之后用擴增CMV為的特異引物進行PCR檢測。將檢測出的陽性克隆進行序列測定，最終獲得CMV為的⑶嫩片段長308bp，位于CMV為全長基因序列的 1207bp-1515bp 之間。通過 NCBI BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)分析發現克隆的基因片段與不同植物CMV分離物為基因序列的同源性達到99%以上。2,CMV 2a RNAi植物表達載體的構建和含有CMV 2a RNAi表達載體質粒的農桿菌的構建
采用堿裂解法提取插入CMV 2a的大腸桿菌質粒pMD-18T-J a以及RNAi表達載體 pHellsgate2的質粒，取1 μ L用于瓊脂糖凝膠電泳以檢測所提取質粒的完整性和濃度高低。用含有attBl和attB2接頭的引物擴增pMD_18T_為，所用引物序列分別為5，-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTGCGTCTAGATT GAGTAAAGCTGTGGCT-3 ‘和 5' -GGGGACCACTTTGTACA AGAAAGCTGGGTCTG AATAACGGTGAGAACTGGGAG-3，。PCR 反應條件為95 "C 2 min ；94 "C 30 s, 59 "C 30s, 72 "C 40 s，28 cycles ；72 "C 5 min。反應體系(20 μ L)為1 μ L 質粒模板，2 μ L Ex Taq BufferU. 5 μ L dNTP (2· 5 mM each)、0· 1 μ L 正向引物(20 μ Μ)、0· 1 μ L 反向引物 QO μΜ)、0·2 μ L Ex Taq DNA 聚合酶(5 U/μ L)、15.1 μ L ddH20。PCR 結束后，取5 μ L PCR產物通過瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物的大小以及濃度。上述attB-PCR產物大小介于300bp-400bp，更接近400bp，符合預期值，并且沒有雜帶，直接用PCR產物進行BP重組反應。將BP Clonase II enzyme mix (invitrogen)在冰上解凍anin，并短時渦旋2次，在0. 5 mL離心管中依次加入下面的試劑2 μ L attB-PCR 產物(10 ng/ μ L), 1 μ L pHellsgate2 質粒(150 ng/μ L)，2 μ L BP Clonase II。短時渦旋2次充分混勻反應物，短時離心收集反應物到管底。置于25 ° C水浴鍋中反應4 h 后加入1 μ L蛋白酶K，短時渦旋，37 ° C溫育10 min中止反應。取2 yL BP反應產物轉化大腸桿菌DH10B，篩選抗生素為壯觀霉素。挑取若干個單克隆搖菌提質粒，同一個克隆的質粒分別用損al、損ol酶切，檢測兩個位點是否同時重組上外源基因片段，兩種酶切產物理論上大小相同，且都與PCR產物大小相當。經酶切驗證符合要求的質粒，即CMV徹與 PHe 11 sgate2成功重組的克隆，在陽性菌株中加入20%甘油混勻，置于-80 V保存備用。用堿裂解法提取并純化上述大腸桿菌中的CMV 2a RNAi表達載體的質粒。制備農桿菌LBA4404菌株的感受態細胞，操作過程為將實驗室保存的LBA4404菌株在LB固體培養基(含利福平20mg/L)上劃線培養至長出單菌落后，挑取一個單克隆于含20mg/L 利福平的2 mL LB液體培養基，28°C振蕩培養至混濁；取5 mL菌液轉接于含20mg/L利福平的100 mL LB液體培養基中，28°C振蕩培養至OD600為0. 5 ；4°C離心5min (5，000g/min)收集菌體，棄上清，加入10 mL預冷的0. IM CaCl2,輕輕充分懸浮菌體，冰浴20min ；接著4°C 離心5min (5, 000g/min)收集菌體，棄上清，加入4 mL預冷的含15%甘油的0. IM CaCl2溶液，輕輕懸浮后分裝于1.5 mL離心管中，每管200 μ L，液氮速凍后置于_80°C保存備用。采用液氮凍融法將上述構建的CMV為RNAi植物表達載體轉入所制備的農桿菌 LBA4404感受態細胞中。操作步驟為取2 μ g質粒加入含有200 μ L感受態細胞的離心管中，輕輕混勻后冰浴5min，接著轉入液氮中冷凍lmin，然后迅速置于37°C水浴5min，之后立即冰浴aiiin，加入800 μ L LB液體培養基振蕩培養4h。將活化后的農桿菌涂于含有50mg/L Km的LB固體培養基上，28°C倒置培養。挑選單菌落搖菌，用擴增CMV為的特異引物進行PCR，檢測重組載體是否轉入農桿菌中。對于陽性克隆，加入20%甘油混勻后置于-80°C保存備用。3、農桿菌介導的植物遺傳轉化以及轉基因植物篩選
本實驗的轉基因受體是煙草mcotiana tabacum L.)。將煙草的種子用75%的酒精浸泡30s，用無菌水洗滌后用0. 1%的HgCl2浸泡8min，然后再用無菌水洗滌若干次，播種于 1/2 MS培養基上，28°C暗培養5-8d，發芽后轉至光照培養箱(25°C，Wh/d光照)，以后每月用MS培養基繼代一次。從_80°C冰箱中取出保存的含有CMV 2a RNAi表達載體質粒的農桿菌LBA4404菌種，接種于5 mL含有50mg/L Km和20mg/L利福平的LB液體培養基中，28°C培養至渾濁。吸取ImL渾濁的菌液至含有50mg/L Km的LB固體培養基上，培養48h。將LB固體培養基上的農桿菌刮下適量接種于MGL液體培養基中，附加一定量的乙酰丁香酮振蕩培養
2-3h以活化農桿菌。取煙草的無菌苗葉子切成Icm2左右的葉盤，完全浸泡于上述含有活化農桿菌的 MGL液體培養基中15min。用無菌濾紙吸干葉片表面的菌液，將葉盤置于共培養基上進行室溫培養。煙草轉化的共培養基為MS+0. Oang/L 6-BA+2 mg/L NAA+30g/L蔗糖，培養時間為 2d。將共培養后的葉盤轉到加有抗生素的篩選培養基中分化成苗，同時篩選轉基因植株。煙草篩選培養基為 MS+0. 5mg/L 6-BA+O. lmg/L NAA+30g/L 蔗糖 +50mg/L Km+200mg/L 頭孢霉素(cefotaxime sodium salt, Cef)。篩選培養時將培養瓶轉移至光照培養箱培養(25°C， l^i/d光照，8h/d黑暗)。煙草出芽后，用含有50mg/L Km和200mg/L Cef的MS培養基繼代培養。因煙草愈傷分化率較高，故需要對再生植株進行進一步篩選。將煙草再生苗移至含有50mg/L Km (卡那霉素)和200mg/L Cef (頭孢霉素)的MS培養基上使其生根，最后選用生根較好的再生苗進行分子水平的檢測。采用植物總DNA的快速少量抽提法(CTAB)法提取轉基因煙草植株葉片的基因組DNA，將提取的基因組DNA取1 μ L通過瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性和濃度。以轉基因植株的基因組DNA為模板、以新霉素磷酸轉移酶基因MT # (位于pHellsgatd T-DNA區段，作為轉基因陽性轉化子的抗性篩選標記)設計特異引物進行PCR，引物序列為 5，-CCCTGATGCTCTTCGTCCA-3，和 5，-CTCTGATGCCGCCGTGTT-3，。PCR 反應條件為95 "C 2 min ；94 "C 30 s，60 "C 30 s，72 "C 50 s，28 cycles ；72 "C 2min。反應體系為1 yL 煙草總 DNA，0.2 μ L 正向引物，0.2 μ L 反向引物，9 μ 2Xpower Taq PCR MasterMix, 10. 6 μ ddH20。PCR結束后，取8 μ L產物用于瓊脂糖凝膠電泳以檢測陽性轉基因植株。由于陽性轉基因煙草基因組中整合了 CMV 2a RNAi表達載體的T-DNA，因此能擴增出長度為679bp 的MT#基因特征條帶。部分轉基因煙草植株的擴增結果如圖1所示。轉基因煙草共篩選到132株陽性植株，分別編號為1 132。4、轉基因煙草的CMV抗性分析
首先制備黃瓜花葉病毒粗提液。取5g辣椒CMV癥狀病樣組織加IOOml抽提緩沖液
，在研缽中研磨均勻，尼龍紗布過濾，濾液加25%氯仿，震蕩15min，置4°C冰箱lh，然后5000rpm/min離心20min，取上清加8% 的聚乙二醇(PEG6000)、3% NaCl，攪拌至PEG完全溶解，置4°C冰箱內4h，8000rpm/min離心 30min,取沉淀，用ddH20懸浮過夜，8000rpm/min離心30min，取上清液，沉淀用ddH20再懸浮一次，兩次上清液合并，并加入8%PEG、3%NaCl沉淀，再用少量的ddH20過夜懸浮沉淀，最后 8000rpm/min離心lOmin，收獲的上清液即為病毒粗提液。挑選PCR檢測為陽性的轉基因煙草植株，移栽到盛有培養液的三角瓶中。待長出
3-4片新葉后，使用摩擦接種法對各陽性株的葉片進行接種，操作過程為預備接種的植株置于25°C培養箱中暗培養Mh，接種葉片上撒少量500目石英砂，蘸取少量的病毒粗提液， 以逆著葉脈的方向輕輕摩擦葉片，放置15min后，接種植株用清水沖洗干凈后置于暗室培養過夜，再放置進光照培養箱培養。兩周后取接種葉片進行RT-PCR檢測，每株檢測4-6片葉，具體步驟如下選取接種后煙草葉片，采用異硫氰酸胍法，提取總RNA。用RT-PCR方法檢測CMV感染情況，RT-PCR反應條件同步驟1。以合成的第一鏈cDNA為模板，使用CMV CF基因引物進行PCR擴增，引物
8序列為5，-CCAACTATTAACCACCCAACCTT-3，和 5，-TGCTCGACGTCAACATGAAGT
AC-3，。PCR 反應條件為95 "C 2 min ；94 "C 30 s，58 "C 30s, 72 "C 40 s，28 個循環；72 "C 5 min。反應體系(20 μ L)為2 μ L cDNA,0. 2 μ L正向引物，0.2 μ L反向引物，2 μ IOXReaction Buffer (反應緩沖液)，1· 5 μ dNTP Mix (2.5 mM), 2 μ MgCl2, 0. 3 μ Taq PCR聚合酶(5 U/ μ L)，12. 8 μ ddH20。接種煙草葉片感染CMV后，即能通過 RT-PCR檢測到CMV CF基因470bp的擴增產物。如果被檢測植株具有對CMV侵染的抗性，葉片RT-PCR檢測結果不會出現CP基因的特征條帶。野生型煙草和轉基因煙草接種CMV兩周后的表型觀察結果如圖2所示。接種CMV 的野生型煙草葉片出現扭曲，黃化，失去光澤，并出現黃綠相間的花葉癥狀，而轉基因煙草植株的葉片大部分沒有CMV感染的癥狀，個別表現輕微的感病癥狀。轉基因煙草接種CMV兩周后葉片的RT-PCR檢測結果如圖3所示。野生型煙草接種CMV后，葉片RT-PCR檢測呈陽性，即能從葉片中檢測到CMV衣殼蛋白基因CP的表達；而接種CMV的38株為RNAi載體轉基因煙草中，有8株的所有檢測葉片均未受CMV侵染，有 17株僅有個別葉片受CMV侵染。顯然，為RNAi載體轉基因煙草對CMV的抗性較野生型煙草明顯增強。CMV為雙鏈RNA在煙草中的表達使轉基因煙草對CMV的侵染產生了不同程度的抗性。
權利要求
1.一種培育抗黃瓜花葉病毒植物的方法，其特征在于按如下步驟完成(1)從感染黃瓜花葉病毒的植物組織中克隆獲得CMV2a的CDNA片段；(2)將克隆的cDNA片段與RNA i高通量表達載體pHellsgate〗進行BP重組反應，構建 CMV 2a RNAi植物表達載體；(3)將構建CMV2a的RNAi表達載體通過根癌農桿菌介導轉入目標植物中；(4)以重組載體T-DNA上具有的抗性標記篩選轉化子，并通過聚合酶鏈式反應獲得真正的轉基因植株，接種黃瓜花葉病毒，觀察發病情況，最后篩選出對CMV抗性明顯增強的轉基因植株。
2.根據權利要求1所述培育抗黃瓜花葉病毒植物的方法，其特征在于CMV為基因的 cDNA片段長308bp，位于CMV 2a全長基因序列的1207bp_1515bp之間。
3.根據權利要求1所述培育抗黃瓜花葉病毒植物的方法，其特征在于黃瓜花葉病毒為基因RNAi植物表達載體，具有2a發夾RNA表達盒。
4.根據權利要求1或3所述培育抗黃瓜花葉病毒植物的方法，其特征在于黃瓜花葉病毒為基因發夾RNA表達盒自上游至下游依次包括花椰菜花葉病毒的35S啟動子，表達為基因發夾RNA的DNA分子和終止子。
5.根據權利要求4所述培育抗黃瓜花葉病毒植物的方法及應用，其特征在于表達為發夾RNA的DNA分子由三個組件構成，中間組件為一個內含子，兩邊組件分別為308bp的黃瓜花葉病毒復制酶為基因片段。
6.根據權利要求1或3所述培育抗黃瓜花葉病毒植物的方法，其特征在于表達為發夾 RNA的DNA分子其特征在于內含子兩端的組件為反向互補的基因序列。
7.根據權利要求4所述培育抗黃瓜花葉病毒植物的方法，其特征在于表達為發夾RNA 的DNA分子其特征在于內含子兩端的組件為反向互補的基因序列。
8.根據權利要求5所述培育抗黃瓜花葉病毒植物的方法，其特征在于表達為發夾RNA 的DNA分子其特征在于內含子兩端的組件為反向互補的基因序列。
全文摘要
本發明公開了一種培育抗黃瓜花葉病毒植物的方法。本發明克隆黃瓜花葉病毒復制酶基因cDNA片段，長308bp，位于CMV2a全長基因序列1207bp-1515bp之間，然后將該基因片段構建到RNAi高通量表達載體pHellsgate2上，再通過根癌農桿菌介導的遺傳轉化法將CMV2aRNAi植物表達載體導入煙草中并穩定表達，通過實驗分析轉基因植株的病毒抗性，最后獲得對CMV抗性增強的轉基因煙草植株；通過實驗證實在植物中表達病毒基因片段的雙鏈RNA能誘發RNA干涉的發生，進而產生相應基因的小干涉RNA，并特異性的抑制病毒的侵染。
文檔編號A01H5/00GK102268452SQ20111023245
公開日2011年12月7日 申請日期2011年8月15日 優先權日2011年8月15日
發明者丁為群, 劉迪秋, 周阿濤, 田榮歡, 葛鋒, 賀欣, 陳朝銀, 饒健 申請人:昆明理工大學