專利名稱：利用人工microRNA提高水稻抗黑條矮縮病的方法及其專用雙鏈RNA的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種提高水稻抗黑條矮縮病的方法及其專用雙鏈RNA，尤其涉及利用人工microRNA技術及其雙鏈專用RNA，屬于生物技術領域。
背景技術：
水稻是我國的第一大糧食作物，水稻的生產對于保障我國糧食安全具有重要的戰略意義。雖然我國經過長期努力，利用傳統育種技術在提高水稻的產量和品質方面取得了巨大的進步，但是水稻的病蟲害仍未得到有效的控制。特別是近年來水稻黑條矮縮病毒的發生對我國的水稻生產造成了巨大的損失。水稻黑條矮縮病是由水稻黑條矮縮病毒(Rice black-streaked dwarfviral diease, RBSDV)引起的，RBSDV病毒屬于呼腸孤病毒科斐濟病毒屬，是一種主要由灰飛風傳播的病毒病，其危害性大。除危害水稻外，該病毒還危害大小麥、玉米、聞粱及馬唐、稗草等禾本科作物和雜草(章松柏等，2010)。水稻黑條矮縮病作為一種病毒病，現在沒有有效藥物治療，而且水稻以及其它作物中缺少對黑條矮縮病毒的抗原，這使得傳統育種很難獲得抗RBSDV的種質。近年來，水稻黑條矮縮病毒基因組的研究已經取得了豐碩的成果。研究表明RBSDV的基因組由10條雙鏈RNA組成，按其在聚丙烯酰胺上遷移距離由小到大計的順序依次命名為=Sl-SlO (王朝輝2004，方守國2000，張恒木2001)。RBSDV的基因組大小為29141nt，是目前斐濟病毒屬中基因組最大的一個。RBSDV的S1-S6均編碼病毒的一個主要蛋白，其中SI可能編碼RNA依賴的RNA聚合酶；S2長約3813nt，編碼一個有1226個氨基酸組成的蛋白，猜測很可能是核心結構蛋白；S3長3752nt，編碼一個有1146個氨基酸組成的蛋白，其編碼蛋白可能是病毒粒子的結構蛋白；S4、S5長3617nt、3163nt，功能未知；S6長2645nt，雖然功能未知但利用計算機軟件對其二級結構的預測和數據庫比較分析表明，其編碼蛋白存在高度保守的親水性結構域及多個跨膜區域，可能具有結合RNA及ATPase活性，這些結果表明，RBSDV的S6基因可能具有編碼植物基因沉默抑制子的功能；S7全長大約為2193nt，含有兩個開發閱讀框(0RF)，分別編碼約為41Ku和36Ku的蛋白質ORFl和0RF2，目前已經正式ORFl和0RF2均為病毒的非結構蛋白；S8全序列約為1936bp，只含有I個0RF，編碼蛋白的分子量約為68Ku，可能是病毒的核心衣殼蛋白；S9全長1900bp，含有2個0RF，其中0RF2保守性極高，編碼一種24. 2Ku的非結構蛋白。SlO全長1819nt，編碼病毒63ku的外殼蛋白。截止到2010年6月29日在NCBI注冊的RBSDV序列總計有60條，其中20條是從中國水稻、玉米產區分類得到的。RBSDV基因組序列測序及其功能研究的深入，為利用植物基因工程提高水稻抗矮縮病的能力，培養抗病新種質奠定了基礎。相比傳統雜交育種，利用基因工程技術手段培育抗病品種是徹底解決水稻黑條矮縮病毒的根本途徑，而且與藥劑防治相比，它既不用增加生產投資，也沒有農藥殘留污染環境，對防治發生范圍廣、流行速度快的病害更為有效。
人工microRNA (Artif ical microRNA, amiRNA)技術是利用內源 microRNA 前體骨架，通過替換microRNA序列產生具有新功能的microRNA。最近人工microRNA在抗病育種的潛力逐漸被人們認識，Schwab等利用擬南芥pre-miRNA172和pre_miRNA319做骨架,將miRNA/miRNA*區替換成與目標mRNA互補的片段,形成了 artifical microRNA,在擬南芥中超表達后引起表型的明顯改變(Schwab 2006)，證明amiRNA可以有效沉默單個和多個靶基因，并且在誘導性啟動子或組織特異性啟動子驅動下均可以特異性地發揮作用；Warthmann等利用水稻osa_MIR528作骨架構建了人工microRNA，成功對水稻靶基因高效干涉(Warthmann)。2006年Niu等通過修飾擬南芥miR159的前體獲得了能夠分別鏢IE P69和 HC-Pro 的人造 microRNAs amiR-P69159 和 amiR-HC-Pro159，發現表達 amiR_P69159 和amiR-HC-Pro159的轉基因擬南芥能夠分別特異抵抗TYMV和TuMV病毒感染(Niu，2006)。2007年Qu等設計了鏢靶黃瓜花葉病毒(CMV)的沉默抑制子2b的microRNA并在煙草中表達，獲得抗病毒的煙草植株，并且發現煙草的抗性水平和microRNA的表達水平成正相關(Qu，2007)。 相比PTGS (RNAi)介導的基因沉默，人工microRNA在培養抗病毒植物上具有其獨特的應用優勢=(I)RNAi介導的基因沉默依賴DCL4途徑，而病毒編碼的抑制蛋白(基因沉默抑制子)可以抑制這種沉默，能夠抑制RNAi機制的發生。AmiRNA通過DCLl途徑，可以避開一些病毒抑制蛋白的拮抗作用；(2) RNAi介導的基因沉默在植物中轉錄長片段病毒基因組，這些病毒基因組序列可能與植物基因組重組，存在一些生物安全方面的隱患，而amiRNA只引入21個堿基的外源序列，降低了此類風險的發生；(3)田間病毒多是混合侵染，并不是一個純的株系，而且病毒株系多、變異快，RNAi等方法只能有效抵御部分株系，無法培育一種持久廣譜的抗病毒品種，amiRNA可以允許錯配的存在，因而科研針對病毒保守區設計amiRNA，使之有效抑制大多數病毒株系，并且當病毒發生突變后仍然能夠保持抗病毒能力，從而延長品種的壽命；(4) RNAi介導的基因沉默會產生一系列序列信息不明確的siRNAs,往往造成意外“脫靶”現象和非目標基因的沉默等現象，amiRNA只產生I條microRNA成熟體(mature microRNA)，和靶基因的結合更加精確、高效、可控；(5)低溫能夠抑制RNAi介導基因沉默的機制，在低溫(<15°C)條件下，RNAi轉基因種質抗病毒能力明顯下降，容易受到病毒的侵染。而研究表明人工microRNA介導的基因沉默在15°C和24°C下沒有區別，在低溫環境下人工microRNA將更加穩定、高效。然而在可檢索的現有技術中，利用人工microRNA技術提高水稻抗黑條矮縮病毒的方法還未見報道。

發明內容
針對現有技術的不足，本發明需要解決的是問題是提供一種利用人工microRNA提高水稻抗黑條矮縮病的方法，并且提供改造microRNA的專用雙鏈RNA序列。本發明的技術方案是一種利用人工microRNA提高水稻抗黑條矮縮病的專用雙鏈RNA,其特征是，它是由sequenceA和sequenceB組成的雙鏈RNA ;所述sequenceA如SEQNO. 1-22所述；所述sequenceB的核苷酸序列是與sequenceA反向互補，或者與sequenceA小于4個堿基錯配的反向互補序列。本發明還提供了一種利用人工microRNA提高水稻抗黑條矮縮病的方法，其特征是，以水稻內源的microRNA作為骨架結構，如osa-MIR528，osa_MIR319，osa_MIR159，osa_MIR171等；分別用sequenceA和sequenceB替換水稻內源microRNA的成熟體序列(mature sequence)及其成熟體的反向互補序列(mature*sequence);同時在microRNA的5’和3’分別設計酶切位點和保護堿基，通過人工合成獲得人工microRNA載體；然后將合成的人工microRNA載體通過酶切連接,轉化到到帶有強啟動子(CaMV 35S或者ubiqutin)的植物表達載體中，再將該植物表達載體導入水稻中(可以采用農桿菌侵染的方法)，得到抗水稻黑條矮縮病的轉基因水稻。所述陽性轉基因苗的分子檢測方法是根據水稻內源的microRNA的前體序列在5’端設計引物primerl,在其3’端設計引物primer2 ;提取轉基因苗的總RNA,以轉錄后的 cDNA 為模板，分別以(sequenceA, sequenceB)、(sequenceA, primer2)、(primerl,sequenceB) 3對引物進行PCR檢測。水稻黑條矮縮病毒是造成我國水稻大面積減產甚至絕收的主要病害之一，由于水 稻黑條矮縮病毒主要靠灰飛虱傳播，從苗期到成株期均可發病，且感病期越早，發病越重，所以通過噴施農藥或者栽培措施優化等方法很難防止水稻黑條矮縮的發生和危害，所以說提高水稻自身的抗病能力是解決黑條矮縮病危害的根本途徑，由于水稻中缺少對該病毒的天然抗原，所以通過傳統育種很難得到抗黑條矮縮病的品種。通過基因工程手段提高水稻的抗病能力將是徹底解決水稻黑條矮縮病的有效途徑。本發明以水稻為受體植物，涉及了能夠干擾水稻黑條矮縮病毒的人工microRNA載體，通過導入水稻，成功實現利用人工microRNA提高水稻對黑條矮縮病的抗性，具有廣闊的應用前景。本發明的優點(I)相比傳統雜交育種，利用人工microRNA技術手段培育抗病品種是徹底解決水稻黑條矮縮病的根本途徑，而且與藥劑防治相比，它既不用增加生產投資，也沒有農藥殘留污染環境，對防治發生范圍廣、流行速度快的病害更為有效。(2)相比PTGS (RNAi)介導的基因沉默，人工microRNA技術只引入21個堿基的外源序列，不容易造成“脫靶”現象和非目標基因的沉默等現象，生物安全性更高。(3)本發明中人工microRNA載體的構建采用水稻內源的microRNA前體作為骨架，和傳統的通過引入外源基因改良作物品質有很大不同，一定程度上可以減少引入外源基因造成的不確定表型，另外也可以減少轉基因引起的爭議。(4)本發明可以用(sequenceA, sequenceB)、(sequenceA, primer2)> (primerl,sequenceB) 3對引物對轉基因水稻進行PCR快速檢測。


圖I :標靶RBSDV人工microRNA載體構建 2 Art-528-S6-l 酶切圖，Marker DNA 分子量標準
具體實施例方式以下結合實施例對本發明做進一步說明，但不限于此。實施例I :改造microRNA的專用雙鏈RNA序列的獲得
根據水稻黑條矮縮病毒基因組S6片段(基因登錄號AJ409148)設計正向引物 primer3 :5’-AAGimTTGAGTCTGAGATA-3’ (SEQ NO. 27)和反向引物 primer4 :5’ -GACATCAGCTGATTTGAGTC-3’ (SEQ NO. 28);提取水稻黑條矮縮病發病病葉的總RNA，通過RT-PCR方法克隆到水稻黑條矮縮病毒基因組S6片段序列，將該序列提交到在線軟件WMD3(http://wmd3. weigelworld. org/cgi-bin/webapp. cgi page=Home;project=stdwmd),根據雙鏈RNA的能量值，通過和水稻全基因組及mRNA序列的比對，雙鏈RNA的能量值，改造后microRNA的二級結構確定專用的RNA序列。水稻黑條矮縮病發病病葉總RNA的提取和純化方法如下I.稱取0.2g新鮮組織，在液氮中充分研磨至粉末狀，研磨中不斷緩慢加入液氮，防止材料解凍。2.將研好的組織迅速轉移至預熱(65°C)的裝有600微升CTAB提取液(2%CTAB，2%PVP，0. IM Tris-Cl，2. OMNaCl，25mM EDTA)的EP管中，立即劇烈渦旋振蕩30s，使其混勻。
3. 65 0C水浴2_5min，期間劇烈渦旋振蕩3-5次。4.稍微冷卻后加入等體積的氯仿/異戊醇(氯仿異戊醇=24 1 (V/V)，下同)，渦旋振蕩 Imin,混勻,4°C, 12，OOOrpm 離心 15min。5.將上清轉移到另一新的EP管中，加入2微升的DNase I，37°C水浴15min。6.再加入等體積的氯仿/異戍醇潤旋振蕩lmin,混勻,4°C, 12000rpm離心15min。7.將上清轉移到另一新的EP管中，加入1/3體積的8M LiCl，使其終濃度為2M，4 °C過夜沉淀。8. 40C，12000rpm離心20min，棄上清，分別用70%乙醇，無水乙醇洗沉淀，晾干，力口30-50微升DEPC-H2O溶解沉淀。9.在微量離心管中加入全部 RNA,DNaseI Buffer 5ul,DnaseIC5U/ul)5ul, RnaseInhibitor (40u/ul)0. 5ul，最后加入DEPC H2O使總體積達到50ul，37°C反應I個小時。10.加入 50ul DEPC H2O,混勻。11.加入等量(IOOul)的苯酚/氯仿/已戊醇(25:24:1),充分混勻。12.離心，取上層水相到新離心管中。13.加入等量(IOOul)的氯仿/已戊醇(24:1)，充分混勻。14.新取上清(水相)到新的離心管。15.加入 1/10 體積(IOul)的 3M NaOAC (pH 5. 2) 。16.加入2. 5倍(250ul)的冷無水乙醇，_20°C過夜(或者一個小時以上)。17.離心回收沉淀，用70%的乙醇清洗，干燥。20.加入20ul DEPC H2O溶解后，電泳檢測。cDNA的獲得參照Takara公司的反轉錄試劑盒說明的方法，在500ul離心管中加入oligo dT primer lul, dNTP lul，總 RNA2ul，DEPC H20 6ul，混勻后，在 PCR 儀上 65°C溫育5min后迅速在冰上冷卻，然后再加入5XPrimeScript II Buffer 4. Oul,Rnase Inhibitor0. 5ul,PrimeScript II Rtase I. Oul，最后加入 DEPC H2O，補足 20ul，混勻后在 PCR 儀上進行，42°C，60min ；70°C , 15min 后，冰上冷卻。用稀釋5倍的cDNA做模板，以primer3, primer4進行PCR反應，PCR反應程序為940C 5min ;再 94°C 50s, 54°C 45s, 72°C 3min, 30 循環；72°C 7min ;擴增產物連接到 T 載體上進行測序，測序后得到如SEQ NO. 29-30所述的水稻黑條矮縮病毒基因組S6片段。將測序后的S6片段序列提交到在線軟件WMD3，根據雙鏈RNA的能量值，通過和水稻全基因組及mRNA序列的比對，雙鏈RNA的能量值，改造后microRNA的二級結構確定專用的RNA序列，如SEQNO. 1-22。實施例2 :人工microRNA載體的設計和合成以水稻內源的microRNA 作為骨架結構，如 osa_MIR528，osa_MIR319，osa_MIR159，osa_MIR171等。分別用sequenceA和sequenceB替換水稻內源miccroRNA的成熟體序列(mature sequence)及其成熟體的反向互補序列(mature*sequence)。其中sequenceA和sequenceB分別為專用雙鏈RNA序列中的序列和其反向互補序列(mismatch〈3);同時在microRNA的5’和3’分別設計酶切位點和保護堿基；通過人工合成獲得人工microRNA載體。
下面將以人工microRNA載體Art-528_S6_1的設計和合成為例詳細說明以microRNA數據庫中的水稻osa_MIR528 (登錄號MI0003201)為骨架結構，用 sequenceA :TAGCTAGTTGTTAATACGCAG (SEQ NO. I)和 sequenceB (SEQ NO. 23)CTGCGAATTTACAACTAGCTA 分別替換 osa_MIR528 的成熟體序列(mature sequence)和星號序列(mature*sequence)，在水稻 osa_MIR528 前體的 5’ 和 3’ 分別引入 Xba I (TGCTCTAGA)和Bam HI (GGATCCCG)酶切位點及保護堿基(下劃線序列為酶切位點)，通過人工合成獲得了人工 microRNA :Art-528-S6_l，其具體序列如 SEQ NO. 24 所述。實施例3 :植物表達載體的構建大腸桿菌DH5CI感受態細胞的制備和轉化的過程用無菌接種環挑取_70°C甘油保存的E. coli DH5 a，通過劃線稀釋的方法經37°C培養16_20h后在平板中得到DH5 a的單菌落；挑一單菌落于5ml的LB液體培養基，180rpm振蕩培養12h ;取Iml DH5 a LB菌液于IOOml的LB液體培養基，180rpm振蕩培養到OD值0. 4 ;冰上放置15分鐘，無菌條件下倒入50mlBeckman離心管中，4°C, 3500rpm離心IOmin,棄上清；沉淀用30ml冰預冷的0. IM CaCl2溶液重懸；4°C, 3500rpm離心IOmin,小心倒出上清液；沉淀重懸于2ml冰預冷的含15%甘油0. IM CaCl2溶液；將這些感受態細胞按每份100 U I分裝。制備農桿菌C58C1的感受態細胞挑取農桿菌EHA105單菌落到5ml LB培養基(含利福平50iig/ml)搖菌過夜；然后取Iml接種到50ml液體LB培養基中(含利福平50ii g/ml)，28°C 擴大培養，220rpm 震蕩培養至 0D600=0. 5 ;冰浴 IOmin, 4°C 4500rpm，離心IOmin ;菌體用IOml預冷的0. IM CaC12重懸，4°C 4500rpm再次離心IOmin ;沉淀加入Iml20mMCaC12懸浮液(60%甘油，0. IM CaC12)，再加入10%的甘油，80 分裝，液氮速凍保存。將人工microRNA(Art-528-S6-l)從中間載體用Bam HI和Xba I雙酶切，酶切體系為質粒5. Oul,Buffer K I. 5ul,Bam HI I. 0ul,Xba I I. Oul，混勻，37°C酶切過夜，酶切后電泳回收基因片段(圖2)，同時對植物表達載體PBI121也進行雙酶切，體系同上，電泳后回收載體大片段。在200uL離心管中加入Art-528-S6-l回收產物5ul，pBI121回收產物3ul，Bufferlul，T4DNA連接酶Iul，混勻，16°C連接過夜。將連接產物加入到大腸桿菌(DH5a)感受態細胞中，稍稍混勻，冰上靜置0. 5h，42°C熱激90S，加入600ul的LB溶液，37°C搖菌復蘇lh，取IOOul均勻涂到含有抗生素的LB固體平板上，37°C培養過夜。挑取單克隆，分別上述3 對引物[(sequenceA, sequenceB)、(sequenceA,如 SEQ NO. 26 所述的 primer2)、(如 SEQNO. 25 所述的 primerl, sequenceB)]進行 PCR 驗證，PCR 程序為94°C 5min ;再 94°C 50s,54°C 45s，72°C 40s, 30循環；72°C lmin,提取PCR陽性菌落的質粒DNA進行酶切驗證，酶切體系同上。得到重組質粒pBI121-Art-528-S6-l。重組質粒轉化農桿菌取上述測序驗證正確的質粒2 U I加入到80 U I農桿菌感受態細胞中，混勻，放到冰上45min，37°C水浴3min，28°C 120rpm振蕩培養I. 5h，5000rpm離心lmin，將菌體均勻涂抹到固體LB培養基上(含利福平50 u g/ml，卡那霉素50 u g/ml)，28°C培養2d。挑取單菌落到4ml液體LB中，28°C搖菌過夜。凝膠電泳回收并純化目的片段過程紫外燈下檢測，切下預期大小的基因片段放A I. 5mL離心管中，加入溶膠液300-700ul，55°C保溫溶解，期間不斷搖動。將含有目的基因的溶解液過柱，經過70%酒精清洗，用20ul雙蒸水洗脫。實施例4 :轉化水稻成熟胚愈傷組織的誘導挑選飽滿無蟲害的日本晴水稻種子，去稃片后進行種子 消毒處理，程序為先用75%酒精充分浸泡30s，用滅菌水沖洗；用50%次氯酸鈉充分搖勻20分鐘,用無菌水沖洗；用50%次氯酸鈉滅菌15min,無菌水沖洗5_6次,用無菌濾紙吸干水分，將種子播種到MS培養基上，26°C暗培養10-15天后，剝下成熟胚盾片上長出的愈傷組織，將愈傷組織轉入MS培養基上繼代培養，以后每兩周繼代培養一次，挑選繼代培養5-7天的愈傷組織進行轉化。農桿菌的培養將含有表達載體的農桿菌涂于LB培養基(含利福平50 ii g/ml,卡那霉素50 y g/ml)平板上，28°C培養2天，挑取單菌落于5mL液體LB培養基(含利福平50 u g/ml，卡那霉素50 u g/ml)中培養一天，吸取ImL到IOOmL液體LB培養基中(含利福平50 u g/ml，卡那霉素50 u g/ml)，擴大培養至0D600值0. 6左右后待用。農桿菌侵染水稻愈傷組織的共培養挑取狀態較好的愈傷組織(色澤淡黃)放入IOOmL無菌三角瓶中，加入適量的農桿菌懸浮液，室溫放置20min，并不時晃動。倒掉菌液，用無菌濾紙吸取愈傷組織上多余的菌液，然后將愈傷組織轉移到鋪有一層無菌濾紙的固體共培養基上，26 °C黑暗培養2-3d?？剐杂鷤Y選從共培養基上挑出狀態較好的愈傷組織，用無菌水清洗數次，再用帶有頭孢霉素(500mg/L)的無菌水清洗2-3次后，將愈傷轉移到選擇培養基上，28°C黑暗培養15d。大約15d后，在選擇培養基上進行繼代培養?？剐杂鷤只瘜⒔涍^2次選擇培養基繼代培養的抗性愈傷組織轉移到預分化培養基上，28°C黑暗培養；大約7d后，將預分化的抗性愈傷轉移到分化培養基上，28°C黑暗培養2d，然后轉移到光照培養；大約14d后挑取分化培養基上出現綠點的抗性愈傷組織進一步分化繼代培養，28°C光照培養14d。生根壯苗及溫室移栽分化完成后，將愈傷組織上出現的幼苗移栽到生根壯苗培養基上，1光照培養；大約14d后將壯苗移栽入溫室中進行培養。培養基愈傷組織誘導MS+4.Omg/L 2，4-D+2. 8mg/L 脯氨酸 +0. 3g/L 水解酪蛋白 +5. 6g/L瓊脂粉，pH=5.8。 共培養培養基N6+2.0mg/L2, 4-D+100uM/L 乙酰丁香酮，pH=5. 2。.選擇培養基N6+2.Omg/L 2，4-D+O. 5mg/L KT+0. 5mg/L NAA+50mg/L Kan+300mg/L羧節青霉素，pH=5. 8。預分化培養基N6大量 +MS 微量 +33. 6g/L 甘露醇 +0. 5mg/L 6-BA+O. 5mg/LNAA+0. 5mg/L KT+1. Omg/L 2，4_D+50mg/L Kan+300mg/L 羧芐青霉素，pH=5. 8。分化培養基MS+2.Omg/L 6-BA+O. 5mg/L KT+50mg/L Kan+300mg/L 羧芐青霉素，pH=5. 8o生根壯苗培養基MS+0.033mg/LNAA+5. 8g/L 瓊脂粉，pH=5. 8。實施例5 :轉基因苗的分子檢測和抗性鑒定轉基因苗的分子檢測和是根據水稻內源的HiiCT0RNA的前體序列在5’端設計引物primerl,在其3’端設計引物primer2。如根據水稻osa_MIR528設計primerl:CAGCAGCAGCCACAGCAA (SEQ NO. 25),primer2 TACCGCTGCTGATGCTGA (SEQ NO. 26)；提取轉基因苗的總RNA (方法同實施例1)，以轉錄后的cDNA為模板，分別以(sequenceA, sequenceB)、(sequenceA, primer2)、(primerl, sequenceB) 3 對弓I物進行 PCR檢測，PCR程序同實施例I ;通過人工接種方法對PCR檢測為陽性的TO代轉化苗(特特普、華粳6號、淮稻5號及秈稻品種R084共四個品種，每個品種轉基因水稻幼苗各50株，對照組非轉基因水稻幼苗各50株)進行人工接種鑒定，從水稻黑條矮縮病重病區采集發病植株，將灰飛虱在毒源上飼喂獲毒，移入帶有水稻幼苗的燒杯中飼養(循回時間12-17d，有效接種強度10-20頭/株，接種時間48-72h和水稻接種齡期2葉齡)，渡過循環期，檢測完單頭灰飛虱攜帶病原菌情況后，對轉基因水稻幼苗和非轉基因水稻幼苗進行人工接種檢測。結果表明，轉基因株系的發病率(四個品種轉基因植株發病率均< 20%)顯著低于對照組(四個品種非轉基因植株發病率均彡70%)，且轉基因水稻植株較對照組抗病性明顯增強。主要參考文獻章松柏，李大勇，肖冬來，張長青，吳祖建，謝聯輝.水稻黑條矮縮病的發生和病毒檢測 湖北農業科學，2010，49 (3) : 592-594.
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權利要求
1.一種利用人工micix)RNA提高水稻抗黑條矮縮病的專用雙鏈RNA，其特征是，它是由sequenceA和sequenceB組成的雙鏈RNA ;所述sequenceA如SEQ NO. 1-22所述；所述sequenceB的核苷酸序列是與sequenceA反向互補,或者與sequenceA小于4個堿基錯配的反向互補序列。
2.一種利用人工micix)RNA提高水稻抗黑條矮縮病的方法，其特征是，以水稻內源的microRNA作為骨架結構；分別用權利要求I所述的sequenceA和sequenceB替換水稻內源microRNA的成熟體序列及其成熟體的反向互補序列；同時在microRNA的5’和3’分別設計酶切位點和保護堿基，通過人工合成獲得人工microRNA載體；然后將合成的人工microRNA載體通過酶切連接，轉化到到帶有強啟動子的植物表達載體中，再將該植物表達載體導入水稻中，得到抗水稻黑條矮縮病的轉基因水稻。
3.如權利要求2所述的一種利用人工microRNA提高水稻抗黑條矮縮病的方法，其特征是，所述水稻內源的 microRNA 為 osa_MIR528、osa_MIR319、osa_MIR159 或者 osa_MIR171。
4.如權利要求3所述的一種利用人工microRNA提高水稻抗黑條矮縮病的方法，其特征是，所述水稻內源的microRNA為osa_MIR528。
全文摘要
本發明公開了一種利用人工microRNA提高水稻抗黑條矮縮病的方法及其專用雙鏈RNA。所述雙鏈RNA是由sequenceA和sequenceB組成。本發明分別用sequenceA和sequenceB替換水稻內源microRNA的成熟體序列及其成熟體的反向互補序列；同時在microRNA的5’和3’分別設計酶切位點和保護堿基，通過人工合成獲得人工microRNA載體；然后將載體通過酶切連接，轉化到到帶有強啟動子的植物表達載體中，再將該植物表達載體導入水稻中，得到抗水稻黑條矮縮病的轉基因水稻。本發明通過人工microRNA技術提高水稻的抗病能力，不容易脫靶，安全性高，而且抗病性狀可以穩定遺傳。
文檔編號C12N15/11GK102676510SQ20121014757
公開日2012年9月19日 申請日期2012年5月14日 優先權日2012年5月14日
發明者夏晗, 李愛芹, 李長生, 楊連群, 王興軍, 趙傳志 申請人:山東省農業科學院高新技術研究中心