專利名稱：一種嗜酸乳桿菌凍干保護劑的制作方法
技術領域：
本發明具體涉及ー種嗜酸乳桿菌凍干保護劑及含有其的嗜酸乳桿菌凍干劑，屬于微生態制劑エ藝技術領域。
背景技術：
嗜酸乳桿菌是動物體中固有的有益菌，它和雙歧桿菌占動物體腸道內益生菌的95%以上，它們主要是通過維護腸道的微生態平衡而起到促進動物健康作用的。嗜酸乳桿菌主要存在在腸道的上半部，與主要存在在下半部的雙歧桿菌共同維護著整個腸道的健庚。綜合起來具有以下幾方面的作用(I)提高免疫力嗜酸乳桿菌可產生大量的免疫球蛋白，從而激活集體的免疫細胞，使得外在菌難以留存在動物體內，達到免疫調節作用。(2)改善胃腸道功能嗜酸乳桿菌在腸道粘膜表面形成保護屏障，能夠產生乳酸和醋酸，形成不利于有害菌生長的環境，抑制有害菌的生長，從而起到調節腸道菌群平衡的作用。(3)營養功能嗜酸乳桿菌能夠產生乳酸和醋酸，能夠提高鈣、磷、鐵的利用率，促進鐵和維生素的吸收，產生維生素K和維生素B，產生乳糖酶幫助消化乳糖。(4)恢復因使用抗生素后而破壞的腸道菌群。但是，嗜酸乳桿菌作為益生菌在生產制備、貯藏和進入腸道之前很容易失活，為了得到較高的活菌，需要對其進行必要的保護，因此，嗜酸乳桿菌的保護技術成為其應用于在動物生產時的核心技術問題。冷凍保藏和凍干技術是生物學的ー個重要應用技術，近年來這ー技術因為“功能性食品”的快速發展而被應用于食品生產中，酸奶中的乳酸菌發酵劑的制備也常用該技木。然而，要想獲得理想的冷凍及凍干效果，除エ藝外，主要是篩選和使用適宜的冷凍保護劑。適宜的凍干保護劑能夠使得益生菌在凍干過程中的保藏最小限度死亡，減輕冷凍干燥所引起的對菌體的損傷，在保存時耐受較高的溫度不損害菌體的活力。因而，凍干保護劑的種類、濃度和配制方法對益生菌的保存效果有明顯的影響。

發明內容
為了解決上述問題，本發明的目的在于提供一種嗜酸乳桿菌的冷凍干燥保護劑。首先，本發明提供一種嗜酸乳桿菌冷凍干燥保護劑，其含有1.0-5. 0%海藻糖；5. 0-20.0% 脫脂奶粉；2. 0-8.0% 蔗糖；0. 4-1. 0% D-異抗壞血酸；0. 5-2. 0% 谷氨酸鈉。
進ー步地，本發明提供一種嗜酸乳桿菌冷凍干燥保護劑，其含有5%海藻糖、15%脫脂奶粉、4%蔗糖、I % D-異抗壞血酸和2. O %谷氨酸鈉。其中，所述冷凍干燥保護劑的懸浮基質為無菌生理鹽水或MRS液體培養基。其中，所述的脫脂奶粉為伊利高蛋白脫脂高鈣奶粉。本發明還提供一種嗜酸乳桿菌凍干劑，其含有所述的冷凍干燥保護劑。進ー步地，所述的嗜酸乳桿菌為嗜酸乳桿菌CGMCC No. 5093。本發明中的嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)為申請人從動物腸道中分離得到，能分泌抗生物素類物質(嗜酸乳菌素、嗜酸桿菌素、乳酸菌素)，對腸道致病菌產生拮抗作用，抑制腸道不良微生物的増殖，調整腸道菌群平衡，它的生物學特征如下桿菌，兩端圓，0. 6-0. 9X1. 5-6 u m,以單個、成雙或短鏈出現；不運動，無邊帽，菌落粗糙。在顯微鏡下觀察，顯示纏繞或微絨毛絲狀物，從似暗影的菌堆的中心放射伸出。無特有的色素。可同 化苦杏仁苷、纖維ニ糖、七葉苷、果糖、麥芽糖、半乳糖、乳糖、蔗糖、甘露糖、蜜ニ糖、棉籽糖、海藻糖，不能同化阿拉伯糖、葡萄糖酸鹽、甘露糖。同型發酵，產生DL-乳酸。15°C下不生長，最適生長溫度為35°C -38°C，生長初始pH值為5. 0-7. 0，最適生長pH值為5. 5-6. O。本發明的嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)申請人已于2011年7月26日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，簡稱CGMCCJii :北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，保藏編號為CGMCC No. 5093。本發明提供的凍干保護劑具有體積小、含菌量高、低污染、便于保藏、運輸，使用方便等優點。用本發明的冷凍干燥保護劑制備的嗜酸乳桿菌干粉的活菌數可達到4. 0X10nCFU/g 以上。
具體實施例方式以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。實施例I嗜酸乳桿菌的種子液制備嗜酸乳桿菌的活化培養將甘油凍存管中保藏菌種嗜酸乳桿菌CGMCC No. 5093用接種針在MRS瓊脂培養基平板中劃線，37°C恒溫培養20h。然后將平板上長出的單菌落接種至裝有IOOmLMRS液體培養基的250mL錐形瓶中，37°C恒溫培養20h。再次將培養好的菌液在MRS培養基平板上劃線培養，37°C恒溫培養20h后，將單菌落接種至裝有IOOmLMRS液體培養基的250mL錐形瓶中，37°C恒溫培養20h。將以上操作重復3次，完成嗜酸乳桿菌的活化。嗜酸乳桿菌的種子液的制備將活化好的嗜酸乳桿菌的單菌落接種至裝有IOOmLMRS培養基的250mL錐形瓶中，37°C恒溫培養20h。培養嗜酸乳桿菌所用的MRS液體培養基配方如下蛋白胨，10.0g/L;牛肉膏，8. 0g/L ;酵母膏，4. 0g/L ;葡萄糖，20. 0g/L ;吐溫80，lmL/L ;磷酸氫ニ鉀，2. 0g/L ;三水こ酸鈉，5. 0g/L ;檸檬酸三銨，2. 0g/L ;七水硫酸鎂，0. 2g/L ;硫酸錳，0. 05g/L ；pH 6. 2±0. 2。MRS瓊脂培養基是在MRS液體培養基的基礎上添加瓊脂15g/L。實施例2不同材料對嗜酸乳桿菌冷凍干燥保護的效果比較I、實驗材料(I)懸浮基質MRS增菌液MRS液體培養基，經121°C滅菌15分鐘。(2)供試菌種嗜酸乳桿菌CGMCC No. 5093。
(3)保護劑材料蔗糖、乳糖、脫脂奶粉、D-異抗壞血酸、玉米淀粉、谷氨酸鈉、海藻糖、山梨醇、甘油。(4)補料50%的葡萄糖，經121°C滅菌15分鐘。(4)菌落計數培養基MRS瓊脂培養基。(5)真空冷凍干燥機德國CHRIST ALPHA2-4LSC型。2、嗜酸乳桿菌的冷凍干燥2. I嗜酸乳桿菌的増殖培養將培養好的種子液300mL接種至4L優化培養基的5L發酵罐中，培養參數為溫 度，37。。;攪拌速度，50rmp ;pH值，6. 0±0. 5 ;培養時間，24h。嗜酸乳桿菌的増殖培養所用的優化培養基配方如下蛋白胨，10.0g/L;牛肉膏，8. Og/L ;酵母膏，6. Og/L ;葡萄糖，25. Og/L ;吐溫80，lmL/L ;磷酸氫ニ鉀，3. 0g/L ;三水こ酸鈉，5. 0g/L ;檸檬酸三銨，2. 0g/L ;七水硫酸鎂，0. 2g/L ;硫酸錳，0. 05g/L ；pH 6. 2±0. 2。發酵過程中加入0. 5-1 %的CaCO3,調節pH在6. 2 6. 5 ;發酵8h后進行補料，即加入50%的葡萄糖200mL。將發酵完成的嗜酸乳桿菌發酵液取出，并進行活菌計數，發酵液中嗜酸乳桿菌活菌數達到 I. 8X 109CFU/mL。活菌計數采用平板涂布計數法取ImL菌液加入到9mL無菌水中，用十倍梯度稀釋法稀釋，選擇適宜的三個稀釋梯度進行測定。分別吸取樣品稀釋液0. lmL，每個稀釋度做三個平板，倒置于37°C恒溫箱中培養36h，計數，并按如下公式計算。嗜酸乳桿菌發酵液活菌數(CFU/mL)=每平皿平均菌體數(CFU) XlOX稀釋倍數2. 2嗜酸乳桿菌發酵液的收集濃縮將嗜酸乳桿菌發酵液進行高速離心，轉速4000rmp，20min,得到菌泥，并進行活菌計數，活菌數 4. 28 X 1012CFU/g。活菌計數方法取Ig菌泥加入到9mL無菌水中，用十倍梯度稀釋法稀釋，選擇適宜的三個稀釋梯度進行測定。分別吸取樣品稀釋液0. lmL，每個稀釋度做三個平板，倒置于37 0C恒溫箱中培養36h，計數，并按如下公式計算。嗜酸乳桿菌菌泥活菌數(CFU/g)=每平皿平均菌體數(CFU) XlOX稀釋倍數2. 3凍干保護劑的篩選選取與發酵液同體積的保護劑將離心后的菌泥稀釋均勻成菌懸液(懸浮基質為MRS液體培養基)，分裝于小瓶中，在超低溫冰箱(-80°C)進行預凍貯藏，貯藏4h后，取出在40°C水浴中化凍后，用平板計數法測定活菌數，然后計算出凍干前活菌數。預凍后，置于真空冷凍干燥機中干燥，冷阱溫度_50°C左右，真空度20Pa，干燥24h左右后得到嗜酸乳桿菌菌干粉，測定干粉的活菌數。用倒平板法進行活菌計數，試驗重復3次，毎次試驗取2個平行樣。并按照如下公式計算在不同保護劑作用下嗜酸乳桿菌的存活率，由此確定較好的保護劑。存活率(％) = V2XIooZV1V1——干燥前的活菌數(ImL液體樣的活菌數，CFU/mL)V2——干燥后的活菌數(ImL液體樣干燥后的活菌數，CFU/mL)凍干保護劑的篩選結果見表I。
表I凍干保護劑的篩選結果
權利要求
1.一種嗜酸乳桿菌冷凍干燥保護劑，其含有 1.0-5.0%海藻糖； 5. 0-20.0%脫脂奶粉； 2.0-8. 0%蔗糖； 0. 4-1. 0% D-異抗壞血酸； 0. 5-2. 0%谷氨酸鈉。
2.如權利要求I所述的冷凍干燥保護劑，其特征在于，其含有5%海藻糖、15%脫脂奶粉、4%蔗糖、I % D-異抗壞血酸和2.0%谷氨酸鈉。
3.如權利要求I或2所述的冷凍干燥保護劑，其特征在于所述冷凍干燥保護劑的懸浮基質為無菌生理鹽水或MRS液體培養基。
4.如權利要求I或2所述的冷凍干燥保護劑，其特征在于，所述的脫脂奶粉為伊利高蛋白脫脂聞I丐奶粉。
5.一種嗜酸乳桿菌凍干劑，其特征在于，含有權利要求I 4任一項所述的冷凍干燥保護劑。
6.如權利要求5所述的凍干劑，其特征在于，所述的嗜酸乳桿菌為嗜酸乳桿菌CGMCCNo.5093。
全文摘要
本發明公開了一種嗜酸乳桿菌冷凍干燥保護劑，其含有1.0-5.0％海藻糖；5.0-20.0％脫脂奶粉；2.0-8.0％蔗糖；0.4-1.0％D-異抗壞血酸；0.5-2.0％谷氨酸鈉。本發明提供的凍干保護劑具有體積小、含菌量高、低污染、便于保藏、運輸，使用方便等優點。用本發明的冷凍干燥保護劑制備的嗜酸乳桿菌干粉的活菌數可達到4.0×1011CFU/g以上。
文檔編號C12N1/20GK102649945SQ20121016730
公開日2012年8月29日 申請日期2012年5月25日 優先權日2012年5月25日
發明者劉瀅, 王建設, 胡婷 申請人:北京大北農科技集團股份有限公司, 吉林大北農農牧科技有限責任公司