專利名稱：檢測結核桿菌藥敏性的方法及培養基的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種檢測 結核桿菌藥敏性的方法和培養基，尤其涉及一種可以不加入顯色劑即可觀察結核桿菌藥敏性的方法和培養基。
背景技術：
結核桿菌(MTB)是高致死率的傳染病，自上世紀80年代以來，全球結核病疫情出現了急劇惡化，其中重要原因之一是結核桿菌耐藥性，耐藥性已成為治療和控制結核病的巨大障礙，因此，檢測結核桿菌藥物敏感性對于控制疫情、治療疾病、藥物篩選和研發等均極為重要。WHO推薦的比例法穩定性較好，但是需要4周時間，無法為臨床提供及時的用藥參考；BACTEC 3D方法可在一周內報告結果，但是該方法采用放射性元素，價格昂貴。張文宏等(《微生物與感染》，2008，3 (4) :p204)報道了試驗三磷酸腺苷發光法快速檢測結核分枝桿菌藥敏性，5^7天后檢測敏感菌釋放的ATP，從而判定MTB對藥物的敏感性；彭麗等(《中國防癆雜質》，2005，27 (I) :pl8)報道了以分支桿菌噬菌體為基礎的噬菌體生物擴增法，利用噬菌體生長快、只能活在分支桿菌中增殖的特性，可大大縮短檢測時間；此外還報道耐藥性基因測定，如PCR-單鏈構象多態性分析、DNA測序、DNA芯片檢測等；雖然上述方法應用前景較好，但是上述對操作條件和操作人員技能要求較高，不利于工業上使用。2000年，Caviedes等人建立了一種新的MTB耐藥性檢測技術——顯微鏡觀察藥物敏感度檢測技術(MODS)，通過倒置顯微鏡對MTB特征性索狀結果進行觀察，來確定MTB的生長，從而進行藥敏判斷，胡忠義、崔振玲等(《中華預防醫學雜志》2011,45(1) :p21)進行了MTB痰涂陽標本直接藥敏實驗，證明MODS技術直接檢測痰涂陽標本中MTB對藥物的敏感度具有快速、準確、廉價的優點，可作為痰涂陽標本直接藥敏檢測方法。在MODS方法中，將MTB與藥物一起與培養基混合，然后進行培養，所用培養基主要為固體培養基和液體培養基、以及在此基礎上的固液雙相培養基、半流體培養基等，其中液體培養基能夠使MTB廣發接觸營養成分，因此MTB生長較快，但是液體培養基不利于肉眼觀察，一般需要加入顯色劑染色，以判斷結核桿菌是否生長，而顯色劑往往會給MTB帶來毒性，因此影響藥敏性的判斷。

發明內容
針對目前液體培養基、以及檢測結核桿菌藥敏性方法不便于直接肉眼觀察的問題，本發明提供了一種新的檢測結核桿菌藥敏性的方法和培養基。本發明第一個方面是提供一種檢測結核桿菌藥敏性的培養基，包括液體培養基、促生長組分，所述培養基為酸性，pH值彡4. 5。所述培養基pH值優選為4. 5 6. 5，更優選為5 6。其中，所述液體培養基可以是單獨的液體培養基，也可以是來自含有液體培養基的固液雙相培養基、或包括所述液體培養基的混合物。
所述液體培養基如米氏培養基、蘇通培養基、以及其它可用液體培養基、或上述培養基的改良，可以是其中的任意一種或多種的混合，并優選為米氏培養基7H9、7H10、7H11、或上述任意培養基的改良、或其中任意幾種的組合，更優選為米氏培養基7H9、7H10、或上述任意培養基的改良、或其混合物；最有選為米氏培養基7H9、7H10、或其混合物。所述促生長組分指的是促進結核桿菌生長的營養組分，如牛血清蛋白、小牛血清、酵母提取物、葡萄糖(右旋糖)、氯化鈉、硫酸鎂、氯化錳、油酸、過氧化氫酶(Catalase)等，可以是其中的任意一種或幾種的混合物。根據本發明所述培養基的一種實施例，所述液體培養基包括米氏培養基，以及用于調節PH值的酸，此外，還可以包括蛋白胨、酵母提取物、瓊脂、甘油、乳化劑中的任意一種或幾種的混合物；所述酸可以是有機酸或無機酸，并優選為無機酸，如磷酸、鹽酸、磷酸氫鹽、磷酸二氫鹽等，可以是其中的任意一種或幾種的混合物，所述鹽優選為鉀鹽、鈉鹽、或其 混合物。所述蛋白胨可以是來自于動物或植物，如牛肉蛋白胨、魚蛋白胨、大豆蛋白胨等，具體例子包括酪蛋白胨、骨蛋白胨、胰蛋白胨等。所述乳化劑可以是脂肪酸環氧乙烯酯、多元醇脂肪酸酯、多元醇脂肪酸酯與環氧乙烷縮合物等，如吐溫-20、吐溫-21、吐溫-40、吐溫-60、吐溫-21、吐溫-80、吐溫-81、吐溫-85等，可以是一種或多種的混合物。根據所述培養基的另一種優選實施例，所述培養基還包括抗生素，以抑制其它菌的生長，可以是單一抗生素或多種抗生素的混合物，如多粘菌素B、兩性菌素B、萘啶酸、甲氧芐嘧啶、氨芐西林等。本發明的第二個方面是提供一種檢測結核桿菌藥敏性的方法，步驟包括
步驟1，將待測菌用上述內容中任意一種培養基配成菌液；
步驟2，將所述菌液與藥物混合，進行培養；
步驟3，3 20天后觀察沉淀，根據出現的沉淀量判斷待測菌對藥物的敏感度。其中，步驟2中，藥物在與菌液的混合物中濃度優選為llOOOyg/ml，更優選為10 3500 μ g/ml,更優選為12. 5 3200 μ g/ml,更優選為100 500 μ g/ml,更優選為150 500 μ g/ml,如 200 μ g/ml>400 μ g/ml 等。其中，所述藥物指的是抗結核桿菌藥物，如氧氟沙星、左氧氟沙星、利福平、利福布丁、吡嗪酰胺、乙胺丁醇、對氨基水楊酸、異煙肼等，或者上述化合物的衍生物；優選為吡嗪酰胺。其中，菌液中待測菌濃度優選為IO2 109CFU/ml，更優選為IO3 106CFU/ml，更優選為 104 105CFU/mUn 2X104CFU/ml、5X104CFU/ml、6X104CFU/ml。其中，觀察沉淀時間優選為5 20天后，更優選為7 14天后，更優選為7 10或1(Γ14天后。當菌量較大時，活菌生長會產生沉淀，死菌沉淀與活菌沉淀可能出現混淆，因此，上述方法中，培養基中還可以加入顯色劑，如ΜΤΤ、刃天青、XTT等,此時,活菌產生的沉淀帶有其它顏色，而死菌沉淀為白色，但是顯色劑并不是必須的。因此，本發明上述的檢測結核桿菌藥敏性的培養基中，還可以包括顯色劑，如ΜΤΤ、刃天青、XTT等，但是顯色劑并不是必須的。
根據本發明上述檢測結核桿菌藥敏性方法的一種優選實施方式，將菌液和藥物置于培養板中進行培養。根據本發明所述檢測結核桿菌藥敏性方法的進一步優選實施方式，所述培養板的培養孔為U型孔，即培養孔底部為球面。本發明提供的檢測結核桿菌藥敏性的方法和培養基，可以在不使用顯色劑的情況下，通過倒置顯微鏡或放大鏡、或肉眼直接對沉淀進行觀察，不需要特殊設備讀取結果，只需肉眼觀察孔底菌量和顏色變化即可判斷結核分枝桿菌的藥物敏感性。
具體實施例方式本發明提供了一種用于檢測結核桿菌藥敏性的方法和培養基，所述培養基為酸性，在不加入顯色劑的情況下，即可通過肉眼直接觀察。
以檢測MTB對吡嗪酰胺藥敏性為例，下面通過具體實施例,對本發明進行詳細的介紹和描述，以使更好的理解本發明內容，但是應當理解的是，下述實施例并不限制本發明范圍。菌株來源
MTB標準株(H37Rv，保藏號ATCC27294)和牛分枝桿菌(M. bovis，保藏號ATCC19210)購自美國國家菌種保藏中心。60株已知結果的MTB臨床分離株來自上海市肺科醫院菌株庫，已知PZA藥敏結果，且藥敏結果經羅氏絕對濃度法和Bactec MIGIT藥敏檢測(Bactec MIGIT藥敏檢測為WHO推薦的方法)結果一致的MTB菌株，60株菌株中30株為對吡嗪酰胺(PZA)敏感的MTB菌株，30株為對PZA耐藥的MTB菌株。280株未知藥敏結果的MTB臨床分離株，來源于上海市肺科醫院結核科2011年I月 12月住院患者的痰標本培養物，經菌種鑒定為MTB。培養基組分
液體培養基
米氏培養基7H94. 7-5. 9g
酪蛋白胨1.25g
甘油2-5ml
吐溫 80O. I-Iml
磷酸二氫鉀調節PH值至5飛。促生長成分
小牛血清50. Og
右旋糖20. Og
NaCl8. 5g
過氧化氫霉O. 03g
油酸O. 05-0. Ig
在培養過程中，為了抑制空氣中其它菌的污染，還可以加入抗生素成分，但是抗生素不是必須的。抗牛素多粘菌素B50U/ml
兩性霉素B5 μ g/ml
萘啶酸5-20 μ g/ml
甲氧芐嘧啶2-5 μ g/ml
氨節西林10-25 μ g/ml
上述培養基僅為舉例，所述液體培養基也可以是其它米氏培養基如7H10、7H11等，也可以是蘇通培養基、或其它常用培養基。實施例I 檢測藥敏性的方法
將50株已知菌株分別于液體培養基中培養2周，重懸、磨菌，取懸濁液用液體培養基配成菌液，每種菌株分三組，每一組菌株濃度為IX 105、4X104、2X 104、1X IO4和5 X 103CFU/ml。含吡嗪酰胺的96孔U型孔培養板中，每孔加入100 μ I菌液，各個培養孔中吡嗪酸胺濃度分別從 12. 5mg/ml>25mg/ml>50mg/ml>IOOmg/ml>200mg/ml>400mg/ml>800mg/ml>1600mg/ml 梯度增加至 3200mg/ml。每種菌株第一組不加顯色劑，第二組加入刃天青、第三組加入MTT。37°C條件下培養，3天后即可通過倒置放大鏡觀察。其中
I)直接肉眼觀察(BMM)
出現肉眼可見的白色菌體沉淀為陽性，無肉眼可見菌體沉淀為陰性。MIC9tl定義為孔底可見白色菌體沉淀小于10%對照孔的最低藥物濃度。2)刃天青(REMA)
顏色從藍色變成粉色即預示細菌生長。MIC9tl被定義為阻止顏色變化的最低藥物濃度。3) MTT (REMA)
顏色變成紫色，加入SDS-DMF溶液變黃色，即預示細菌生長。MIC9tl被定義為阻止顏色變化的最低藥物濃度。觀察結果
每次實驗均以H37Rv為敏感株質控，以M. bovis為耐藥株質控，同一菌株的MIC值重復檢測3次；MIC值結果先以肉眼觀察結果記錄為BMM法結果；再以REMA法和MTT法對MIC結果進行確認。以Bactec MGIT藥敏結果為標準，表I和表2中給出了本發明上述三種觀察方法的MIC檢測結果和Medcalc軟件初步確定的敏感性和特異性結果。 表1，50株已知結果的MTB菌株的MIC檢測結果
權利要求
1.一種檢測結核桿菌藥敏性的培養基，其特征在于，包括液體培養基、促生長成分，所述培養基為酸性，pH值> 4. 5。
2.根據權利要求I所述的檢測結核桿菌藥敏性的培養基，其特征在于，所述培養基PH值為5 6。
3.根據權利要求I所述的檢測結核桿菌藥敏性的培養基，其特征在于，還包括抑制其它菌生長的抗生素。
4.根據權利要求I所述的檢測結核桿菌藥敏性的培養基，其特征在于，還包括顯色劑。
5.根據權利要求I所述的檢測結核桿菌藥敏性的培養基，其特征在于，所述液體培養基為米氏培養基7H9、7H10、7H11、及各種可用于結核分枝桿菌培養的培養基、或其中任意幾種的組合。
6.一種檢測結合桿菌藥敏性的方法，其特征在于，步驟包括 步驟I，將待測菌用權利要求I所述培養基配成菌液； 步驟2，將所述菌液與藥物混合，進行培養； 步驟3，5 20天后，根據出現的沉淀量判斷待測菌對藥物的敏感度。
7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于，培養溫度為35 37°C。
8.根據權利要求6所述的方法，其特征在于，步驟2中藥物在與菌液的混合物中濃度為10 3500ug/ml。
9.根據權利要求6或8所述的方法，其特征在于，在所述菌液中，待測菌濃度為IO3 106CFU/ml。
10.根據權利要求6所述的方法，其特征在于，所述培養在培養板中進行，所述培養板的培養孔為U型孔。
全文摘要
本發明提供了一種檢測結核桿菌藥敏性的方法和培養基，所述培養基為酸性，pH值≥4.5。將結核桿菌與藥物、以及本發明所述培養基混合后進行培養，3~20天即可觀察，觀察方法可以是通過肉眼直接觀察沉淀。利用本發明所述方法和培養基，建立的微量MIC檢測判斷MTB菌藥敏性的方法，不需要昂貴的儀器設備，僅需肉眼判讀，結果準確，既可以獲得較為詳細的菌株耐藥數據，又可以提供簡單明了的藥敏判斷結果，作為一種準確、快速、低成本、易于操作藥敏檢測方法，在臨床、以及企業中藥物篩選和研發過程中具有良好的推廣應用前景。
文檔編號C12R1/32GK102703572SQ201210181480
公開日2012年10月3日 申請日期2012年6月5日 優先權日2012年6月5日
發明者崔振玲, 王潔, 胡忠義, 陸俊梅, 黃曉辰 申請人:上海市肺科醫院