專利名稱：：雙相多孔三維細胞培養(yǎng)支架的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及一種雙相多孔三維細胞培養(yǎng)支架，屬于細胞、組織培養(yǎng)領域。
背景技術：
：在現有技術中，常規(guī)使用的主要的細胞培養(yǎng)方式包括以下兩種O以單層二維方式培養(yǎng)細胞細胞培養(yǎng)是一種在藥物開發(fā)、細胞生物學、毒理學、生物工程以及組織工程領域中非常有用并且被廣泛使用的技術。常規(guī)的細胞培養(yǎng)是在細胞培養(yǎng)板如2、4、6、24、96孔細胞培養(yǎng)板中進行，上述細胞培養(yǎng)板由非降解性的聚合物包括聚苯乙烯制成。這些細胞培養(yǎng)板往往用等離子體處理其表面以改進其表面的親水性，從而使得培養(yǎng)的細胞可以更好地粘附于所述培養(yǎng)板的二維表面。在典型的采用聚苯乙烯細胞培養(yǎng)平板進行的細胞培養(yǎng)實驗中，所培養(yǎng)的細胞是在細胞培養(yǎng)基中以一種二維方式單層生長。2)以三維方式培養(yǎng)細胞二維細胞培養(yǎng)是一種用于制備、觀察和研究細胞以及它們與藥物、生物因子和生物材料在體外相互作用的方便的方法。但這與所述細胞在體內的生長方式相距甚遠。在真實的活體內，細胞通常是三維生長的并構建形成三維的活組織或器官。越來越多的證據表明體外的三維細胞培養(yǎng)體系可以加深對正常和病理的組織的結構-功能關系的了解。為了研究這種功能性和形態(tài)學上的相互關系，一些研究者已經探索使用三維的凝膠基質，包括膠原凝膠[DouglasWHJ,MoormanGW,和TeelRW,Theformationofhistotypicstructuresfrommonodispersefetalratlungcellsculturedonathreedimensionalsubstrate.InVitro1976;12:373-381]、明膠、血纖維蛋白、瓊脂糖和藻酸鹽[GruberHE，FisherECJrjDesaiB，StaskyAAjHoelscherG，HanleyENjHumanintervertebraldisccellsfromtheannulus:ThreedimensionalcultureinagaroseoralginateandresponsivenesstoTGF—bLExp.CellRes.1997，235:13-21;GruberHE,StaskyAAjHanleyENJrjCharacterizationandphenotypicstabilityofhumandisccellsinvitro.MatrixBiol.1997;16:285-288]。在這些凝膠體系中，將細胞培養(yǎng)在凝膠基質內以三維的方式生長。近來的研究已經顯示，與單層生長的細胞相比，培養(yǎng)在三維的藻酸鹽或瓊脂糖凝膠體系中的人椎間盤細胞(humanannulusdisccells)顯示出不同的形態(tài),增加了含蛋白多糖的合成，并且形成帶有沉積在細胞周圍和之間的胞外基質的多細胞集落[GruberHE,FisherECJr,DesaiB,StaskyAAjHoelscherG，HanleyENjHumanintervertebraldisccellsfromtheannulus:ThreedimensionalcultureinagaroseoralginateandresponsivenesstoTGF-bl.Exp.CellRes.1997，235:13-21;GruberHE，StaskyAAjHanleyENJrjCharacterizationandphenotypicstabilityofhumandisccellsinvitro.MatrixBiol.1997;16:285-288]。此外，在所述三維藻酸鹽凝膠體系中培養(yǎng)的人椎間盤細胞證實產生了I型和II型膠原，而該I型和II型膠原在單層細胞培養(yǎng)時未有發(fā)現[GruberHE和HanleyEN，Jr，Humandisccellsinmonolayervs3Dculture:cellshape,divisionandmatrixformation,BMCMusculoskeletalDisorders,2000;1:1]。體外動物細胞的三維生長促進正常上皮細胞的極化和分化[RoskelleyCD，BissellMJjDynamicreciprocityrevisited:acontinuous,bidirectionalflowofinformationbetweencellsandtheextracellularmatrixregulatesmammaryepithelialcellfunction,BiochemCellBiol1995;73(7-8):391-7]。與活組織細胞相比較，三維培養(yǎng)的細胞移動和分裂得更快并且具有一種特征性的不對稱外形[CukiermanEjPankovRjStevensDRjYamadaKMjTakingcellmatrixadhesionstothethirddimension,Science，2001;294(5547):1708-12]。三維細胞培養(yǎng)還被用于研究細胞與生長因子以及細胞和藥物之間的相互作用。癌細胞的三維細胞培養(yǎng)可用于研究許多與癌生物學有關的基礎性問題，因為與標準的二維組織培養(yǎng)平板相比，癌細胞的腫瘤發(fā)展生長因子的受體在三維細胞培養(yǎng)時的表達方式是不同的[WangF，WeaverVMjPetersenOWjLarabellCA，DedharS，BriandP，LupuRjBissellMJ.Reciprocalinteractionsbetweenbetal—integrinandepidermalgrowthfactorreceptorinthreedimensionalbasementmembranebreastcultures:adifferentperspectiveinepithelialbiology.ProcNatlAcadSciUSA1998;95(25):14821-6;JacksT，WeinbergRA.Takingthestudyofcancercellsurvivaltoanewdimension.Cell,2002;111(7):923-5]對于乳腺癌，三維細胞培養(yǎng)體系提供一種用于了解癌細胞增殖調控以及用于評價不同抗癌藥物的模型體系[BissellMJjRizkiA,MianIS,Tissuearchitecture:theultimateregulatorofbreastepithelialfunction.CurrOpinCellBiolmj2003;15(6):753-62;PadronJMjvanderWiltCL，SmidK，Smitskamp-WilmsE，BackusHHjPizaoPEjGiacconeGjPetersGJ.Themultilayeredpostconfluentcellcultureasamodelfordrugscreening.CritRevOncolHematol，2000;36(2-3):141-57]大量的證據表明，與在單層或分散培養(yǎng)物中的細胞相比，三維培養(yǎng)中生長的細胞對細胞毒性試劑具有更高的耐受性。許多研究已經揭示，與單層細胞相比，球體細胞培養(yǎng)具有更高的耐藥性[HoffmanRM.Three-dimensionalhistoculture:originsandapplicationsincancerresearch.CancerCells1991;3(3):86-92]。起初，研究者們將細胞球體對藥物的耐受性歸因于藥物向球體內部細胞的不良擴散，但是現在已經證實，耐藥性是由三維細胞培養(yǎng)而引起的，而不是僅僅無法接觸到營養(yǎng)物質[LawlerEMjMillerFR，HeppnerGHjSignificanceofthreedimensionalgrowthpatternsofmammarytissuesincollagengels.InVitro1983;19(8):600-10;MillerBE，MillerFR,HeppnerGHjFactorsaffectinggrowthanddrugsensitivityofmousemammarytumorlinesincollagengelcultures.CancerRes,1985;45(9):4200-5]。進一步的研究證實，三維細胞培養(yǎng)是一種用于評價抗癌藥物的體外細胞毒性的更好的模型[HarpreetK.DhimanjAlokRRayjAmulyaKPanda，Three-dimensionalchitosanscaffoldbasedMCF—7cellcultureforthedeterminationofthecytotoxicityoftamoxifen,Biomaterials,2005;26979-986]o不斷增加的證據表明，三維的環(huán)境也能揭示細胞功能的基本機制，而且體外的三維培養(yǎng)體系可以促進對在正常和病理條件中的結構-功能關系的了解[AbbottA.Cellculture:biology’snewdimension.Nature,2003;424(6951):870-2;HutmacherDW.Scaffolddesignandfabricationtechnologiesforengineeringtissues—stateoftheartandfutureperspectives.JBiomaterSciPolymEdj2001;12:107-24;SchmeichelKLjBissellMJ.Modelingtissue-specificsignalingandorganfunctioninthreedimensions.JCellScij2003;116(Ptl2):2377-88;ZahirN，WeaverVMjDeathinthethirddimension:apoptosisregulationandtissuearchitecture.CurrOpinGenetDev2004;14:71-80;MartinI，WendtD，HebererMjTheroleofbioreactorsintissueengineering,TrendsBiotechnolj2004;22:80-6]?，F已被普遍接受的是，骨和軟骨來源的細胞在三維與二維的環(huán)境中的行為不同，并且，上述三維體外培養(yǎng)體系比二維培養(yǎng)體系能更接近地模擬體內的情況[KaleS，BiermannS，EdwardsC，TarnowskiC，MorrisM,LongMW,Three-dimensionalcellulardevelopmentisessentialforexvivoformationofhumanbone.NatBiotechnol,2000;18:954-8;FerreraD,PoggiS,BiassoniC,DicksonGR,AstigianoS,Barbieri0,FavreA,FranziAT,StrangioA,FedericiA,ManducaP,Three-dimensionalculturesofnormalhumanosteoblasts:proliferationanddifferentiationpotentialinvitroanduponectopicimplantationinnudemice,Bone2002;30:718-25;TallhedenT,KarlssonC,BrunnerA,VanDerLeeJ,HaggR,TommasiniR,LindahlA.Geneexpressionduringredifferentiationofhumanarticularchondrocytes.OsteoarthritisCartilage,2004;12:525-35;]。在近期的研究中，在一種羥丙基甲基纖維素水凝膠基質的內部，三維培養(yǎng)三種人成骨細胞系以及正常的人成骨細胞。已經證實，骨肉瘤細胞以群落球體的方式而增殖，而且所述的人成骨細胞集落存活至少3周。成骨細胞標志物和細胞因子的礦化試驗和基因表達分析表明，在上述水凝膠基質中進行三維培養(yǎng)的細胞比在塑料細胞培養(yǎng)平板中單層培養(yǎng)的細胞表現出一種更加成熟的分化狀況[TrojaniC，WeissP,MichielsJF,VinatierC，GuicheuxJ,DaculsiG,GaudrayP,CarleGF,RochetN.,Three-dimensionalcultureanddifferentiationofhumanosteogeniccellsinaninjectablehydroxypropylmethyIceIlulosehydrogel,Biomaterials,2005;26(27):5509-17]。迄今為止的證據已經清楚地表明，在三維環(huán)境下培養(yǎng)細胞具有二維細胞培養(yǎng)不可比擬的巨大優(yōu)點。目前的三維細胞培養(yǎng)產品主要有凝膠體系和三維細胞培養(yǎng)支架。采用凝膠體系時，所述培養(yǎng)的細胞被包埋在凝膠基質內部，由于物質在所述凝膠中的擴散受到一定的限制，因此該細胞培養(yǎng)的營養(yǎng)和代謝產物的交換是個問題。并且，由于所述培養(yǎng)的細胞包埋在凝膠內部，培養(yǎng)后回收或分離所述細胞非常困難。這與使用二維細胞培養(yǎng)平板不同，二維培養(yǎng)的細胞可以使用胰蛋白酶簡單地將細胞從培養(yǎng)平板上洗脫并通過離心加以分離。此外，在凝膠基質內培養(yǎng)細胞要求在每次培養(yǎng)細胞前制備所需的凝膠體系，這不僅會在大量培養(yǎng)時給研究者們造成不方便，而且由于在不同的研究者和實驗室之間凝膠的制備方式上存在著輕微的差異，從而會在不同批次的凝膠制備之間造成質量的不—致。三維多孔支架是另一種能夠用來進行三維細胞培養(yǎng)的體系。三維多孔支架在使用時將細胞接種于支架的多孔結構中，在適當的細胞培養(yǎng)條件下，細胞即可在此多孔結構中培養(yǎng)形成三維組織結構。常見的有多孔磷酸鈣支架，聚乳酸支架，聚乳酸和乙交酯共聚物支架，膠原蛋白支架，海藻酸鈉支架。其共同的特點是它們具有無規(guī)的孔洞形狀和尺寸?？锥粗g的連通性不好，因此細胞不容易進入支架中心，即使進入到多孔支架的中心，由于營養(yǎng)和代謝產物的交換不容易，因此細胞在這些三維細胞培養(yǎng)支架的中心生長受到限制，甚至死亡。因此大大限制了采用三維多孔支架進三維細胞培養(yǎng)的進展。綜上所述，盡管三維細胞培養(yǎng)有更多的優(yōu)點，但由于上面提到的目前使用的三維凝膠培養(yǎng)體系所存在的種種問題，二維細胞培養(yǎng)仍然是主要的細胞培養(yǎng)方法。因此，一種兼具二維細胞培養(yǎng)體系的全部便捷之處的三維培養(yǎng)體系，對于醫(yī)藥、生命科學以及生物工程研究領域極具價值。這一理想的三維細胞培養(yǎng)體系將需要首先具有能夠讓使用者像在使用平面細胞培養(yǎng)板那樣很方便地觀察細胞在三維細胞培養(yǎng)支架中的生長情況。長期以來，聚苯乙烯已經成為一種成功地用于二維細胞培養(yǎng)的培養(yǎng)物基底材料。由聚苯乙烯制造的細胞培養(yǎng)平板被廣泛地使用并且具有可從許多供應商處商購獲得的多種尺寸規(guī)格。由于聚苯乙烯培養(yǎng)平板對做細胞或組織培養(yǎng)的研究者們來說相當熟悉，因此可以想像，一種由聚苯乙烯制造的三維細胞培養(yǎng)體系將不僅能提供三維培養(yǎng)環(huán)境的優(yōu)點，而且能夠提供聚苯乙烯二維細胞培養(yǎng)體系的許多其它優(yōu)點，具有明確的表面性質且易于使用。然而，聚苯乙烯作為三維細胞培養(yǎng)體系的應用在以前卻幾乎從未被探索過。近來，Baker等人報導其使用靜電紡絲技術加工出一種三維多孔的聚苯乙烯纖維基體[BakerSC,AtkinN,GunningPA,GranvilleN,WilsonK,WilsonDandSouthgateJ,Characterisationofelectrospunpolystyrenescaffoldsforthree-dimensionalinvitrobiologicalstudies,Biomaterials,2006;27,3136-46]。他們獲得的三維聚苯乙烯纖維基體類似于一種無紡墊，其中有內部纖維間的空隙就是多孔的空隙。他們將該三維聚苯乙烯纖維基體切割成適當的可以放在6孔聚苯乙烯培養(yǎng)平板的孔中的尺寸。經在氬氣中等離子體處理后，將這些三維聚苯乙烯纖維基體接種細胞并且在常用的6孔聚苯乙烯細胞培養(yǎng)平板中進行細胞培養(yǎng)。結果表明，這些三維聚苯乙烯纖維基體具有適于細胞貼附的良好的表面性質。該數據揭示，這些聚苯乙烯三維纖維性支架可以是二維聚苯乙烯細胞培養(yǎng)平板體系的一種補充。然而，這些纖維性聚苯乙烯基體的缺點是所述基體的孔徑尺寸和孔的形狀不易確定并且該纖維性基質在自然狀態(tài)下是軟的，從而令所述基質在不發(fā)生變形的情況下進行進一步的操作產生困難。發(fā)明專利“三維細胞培養(yǎng)插入件，其制造設備和成套用具”(200720187562.7)提供了一種具有規(guī)則孔洞結構的三維細胞培養(yǎng)支架。該支架用于三維細胞培養(yǎng)應用，與目前的二維組織培養(yǎng)體系包括組織培養(yǎng)平板一起使用。該支架具有100%的孔聯通性，細胞可以很容易均勻地接種在支架上并且生長良好。然而，在進行細胞接種時，由于孔是100%聯通的，因此會有少量的細胞從此三維細胞培養(yǎng)支架上漏到細胞培養(yǎng)板上，從而影響到細胞在三維支架上的接種效率。
發(fā)明內容本發(fā)明的目的在于克服上述不足，提供一種雙相多孔三維細胞培養(yǎng)支架，可以提高細胞接種效率，并能夠對在其上生長的細胞，特別是干細胞的成長和分化起到促進和調控作用。本發(fā)明的目的是這樣實現的一種雙相多孔三維細胞培養(yǎng)支架，所述雙相多孔三維細胞培養(yǎng)支架是由粗纖維相和細纖維相兩種直徑截然不同的材料構成的，其中粗纖維相比所培養(yǎng)的細胞的尺寸大，細纖維相比所培養(yǎng)細胞的尺寸小，粗纖維相分為多層粗纖維結構，所述相鄰兩層粗纖維結構按一定角度排列，細纖維相單獨結合在粗纖維相的一面或多面；細纖維相可均勻分布或集中分布在粗纖維相構成的三維細胞培養(yǎng)支架的孔洞結構中。本發(fā)明雙相三維細胞培養(yǎng)支架，所述粗纖維構成的三維細胞培養(yǎng)支架由恒定或不同直徑的支柱和/或纖維組成。本發(fā)明雙相三維細胞培養(yǎng)支架，所述細胞培養(yǎng)支架的孔隙率通過改變所述支架中的支柱和/或纖維的數量和尺寸而改變；和/或所述多孔結構可通過改變支柱和/或纖維的三維定位圖案而改變。本發(fā)明雙相三維細胞培養(yǎng)支架，粗纖維具有圓形、三角形、正方形和/或矩形的橫截面。本發(fā)明雙相三維細胞培養(yǎng)支架做成適合細胞培養(yǎng)平板孔、培養(yǎng)室、培養(yǎng)瓶和/或生物反應器的尺寸。本發(fā)明雙相三維細胞培養(yǎng)支架,粗纖維相的材料與細纖維相的材料為同一種材料。本發(fā)明雙相三維細胞培養(yǎng)支架，所述粗纖維與細纖維均由無細胞毒性的材料制成。本發(fā)明雙相三維細胞培養(yǎng)支架，粗纖維相與細纖維相均為非降解性材料。本發(fā)明雙相三維細胞培養(yǎng)支架，粗纖維相與細纖維相均為可降解性材料。本發(fā)明雙相三維細胞培養(yǎng)支架，其中一相材料為非降解材料，另一相為可降解材料。本發(fā)明雙相三維細胞培養(yǎng)支架，所述細胞培養(yǎng)支架采用表面改性技術處理改善所述細胞支架的細胞貼附作用。本發(fā)明雙相三維細胞培養(yǎng)支架，所述表面改性技術是物理化學方式包括等離子體處理、輝光放電處理，和/或化學方式，使用H2SO4、HNO3強酸處理。本發(fā)明雙相三維細胞培養(yǎng)支架，所述表面改性技術是一種表面涂覆技術，通過施加一種不同于用于制備權利要求I所述構建體的聚合物的涂層物質，所述涂層物質是天然存在的聚合物，和/或合成聚合物，和/或無機物質，和/或兩種或多種有機材料組成的復合涂層，和/或一種無機/有機的復合物。本發(fā)明雙相三維細胞培養(yǎng)支架，所述涂層物質包括蛋白、肽、糖胺聚糖、膠原、粘連蛋白、聚乙烯醇、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚賴氨酸、磷酸鈣、TiO2,SiO2,Al2O3、凝膠和脫乙酰殼多糖、聚丙烯酸和聚乙二醇、聚乙烯醇和聚乙烯吡咯烷酮、磷酸鈣/膠原復合物、鈣磷酸/聚乙二醇復合物、磷酸鈣/胞外基質中的一種或幾種。本發(fā)明雙相三維細胞培養(yǎng)支架，所述的表面涂層物質是以化學方式包括共價鍵、氫鍵、離子鍵或范德華力結合到所述細胞培養(yǎng)支架的支柱和/或纖維上。本發(fā)明雙相三維細胞培養(yǎng)支架的制作方法，所述方法包括(A)采用快速成型方法制備粗纖維相構成的半成品多孔三維支架；(B)在半成品多孔三維支架外表面采用靜電紡絲技術噴涂細纖維；(C)繼續(xù)在帶有細纖維相的面上采用快速成型方法制備多孔三維支架，從而使得細纖維相被固定在粗纖維相構成的三維支架內部；(D)利用機械切割方法，將雙相多孔三維細胞培養(yǎng)支架切割成所需尺寸；(E)使用一種等離子體表面處理器，在氬氣氣氛中將所述細胞培養(yǎng)支架進行等離子體處理；(F)分別地包裝該等離子體處理過的細胞培養(yǎng)支架，并且最終用20KGy劑量的Y射線輻射進行滅菌。本發(fā)明雙相三維細胞培養(yǎng)支架培養(yǎng)細胞的方法，所述方法包括(A)使用動態(tài)接種或靜態(tài)接種方法，將細胞接種于所述細胞培養(yǎng)支架中；(B)接種細胞以后，將所述細胞培養(yǎng)支架保持在浸沒于生長培養(yǎng)基之中的細胞培養(yǎng)支持物，包括組織培養(yǎng)平板、培養(yǎng)室、培養(yǎng)瓶和/或生物反應器中進行培養(yǎng)。與現有技術相比，本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明雙相多孔三維細胞培養(yǎng)支架，進一步增加了比細胞直徑小的多的細纖維，包括納米直徑的纖維。細纖維，特別是納米纖維，能夠促進細胞吸附。納米纖維具有比細胞小的多的直徑，在結構方面與哺乳動物體內的膠原和彈性纖維相似，因此細胞能夠很容易貼附到納米纖維上。納米纖維還能夠有效的促進干細胞在其上的分化。因此，添加細纖維到三維細胞培養(yǎng)支架上能夠提高細胞接種效率，并能夠對在其上生長的細胞，特別是干細胞的成長和分化起到促進和調控作用。圖I為本發(fā)明雙相多孔三維細胞培養(yǎng)支架的結構示意圖。具體實施例方式下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。但這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。所屬領域技術人員應當理解，對于下列實施例中未注明具體實驗條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，或按照廠商所建議的條件。參見圖1，本發(fā)明雙相多孔三維細胞培養(yǎng)支架是由兩種直徑截然不同的材料構成的，其中一相是由比所培養(yǎng)的細胞尺寸大的粗纖維相所構成，粗纖維相分為四層粗纖維結構，所述相鄰兩層粗纖維結構按一定角度排列，相鄰兩層粗纖維之間呈90度排列，或者成60度排列，或者成45度排列；粗纖維相提供規(guī)則的多孔結構供細胞在其中進行三維生長；另一相則是由比所培養(yǎng)細胞尺寸小的細纖維相所構成，細纖維相單獨結合在粗纖維相的一面或多面，促使細胞吸附在細纖維上，從而阻止細胞從粗纖維相構成的多孔三維細胞培養(yǎng)支架中漏出。細纖維相還被選擇性的加入到粗纖維相構成的多孔三維細胞培養(yǎng)支架中。構形本發(fā)明雙相多孔三維細胞培養(yǎng)支架可以形成用于實現具體的應用目的的任何大小和形狀，所述應用目的適合細胞/組織培養(yǎng)平板、燒瓶和生物反應器的大小和形狀。在一種實施方式中，本發(fā)明提供一種由粗細不同的兩種纖維構成的三維細胞培養(yǎng)支架。其中，粗纖維或支柱構成三維細胞培養(yǎng)支架的主要框架結構。所述支柱和纖維按照一種預先設計的方式或圖案結合在一起。細纖維依托于粗纖維，提供細胞更容易吸附的結構并影響細胞的生長和分化情況。通過所述支架的整體設計來確定細胞培養(yǎng)支架的孔隙率和孔徑尺寸，所述支架的設計包括支柱或粗纖維的尺寸和幾何結構，每單位體積內支柱或粗纖維的數目，以及該三維支架中粗纖維或支柱的結構圖案。細纖維則以一種無序或有序排列的方式加入到支架的多孔結構中。在一種實施方式中，本發(fā)明的支架設計是一種由支柱和/或粗纖維在連接處相互垂直結合而組成的三維細胞培養(yǎng)支架。細纖維則以一種無序或有序排列的方式加入到支架的多孔結構中。在一種實施方式中，本發(fā)明提供一種由支柱和/或粗纖維組成的三維細胞培養(yǎng)支架，在該支架中，所述支柱和/或纖維在連接處并不都是彼此垂直的，而是以不同的角度結合。細纖維則以一種無序或有序排列的方式加入到支架的多孔結構中。在一種具體的實施方式中，所述雙相多孔三維細胞培養(yǎng)支架是一種三維的圓盤形多孔結構。在另一種具體的實施方式中，所述雙相多孔三維細胞培養(yǎng)支架是一種三維的立方體形多孔結構。尺寸本發(fā)明所述的雙相多孔三維細胞培養(yǎng)支架預先加工成標準尺寸，或者定做成適合具體的細胞培養(yǎng)平板孔、箱、燒瓶、生物反應器的尺寸。在一種實施方式中，本發(fā)明提供一種具有一種尺寸(直徑和高度)的雙相多孔三維細胞培養(yǎng)支架，其適合一種可商購的組織培養(yǎng)平板的圓形孔。在另一種實施方式中，本發(fā)明提供一種具有一種立方形尺寸(長X寬X高)的雙相多孔三維細胞培養(yǎng)支架，其適合一種組織培養(yǎng)平板的矩形孔。在另一種實施方式中，該雙相多孔三維細胞培養(yǎng)支架具有適合一種生物反應器的腔室的尺寸和形狀。在一種具體實施方式中，該雙相多孔三維細胞培養(yǎng)支架的尺寸適合一種組織培養(yǎng)燒瓶的立方空間。該雙相三維細胞培養(yǎng)支架的支柱/粗纖維的直徑為50Mm-1mm。細胞培養(yǎng)支架的平均孔徑為50Mm—2mm。所述粗纖維相構成的三維細胞培養(yǎng)支架由恒定或不同直徑的支柱和/或纖維組成；優(yōu)選地，所述細胞培養(yǎng)支架的孔隙率通過改變所述支架中的支柱和/或纖維的數量和尺寸而改變；和/或優(yōu)選地，多孔結構可通過改變支柱和/或纖維的三維定位圖案而改變。細纖維相可均勻分布或集中分布在粗纖維相構成的三維細胞培養(yǎng)支架的孔洞結構中。優(yōu)選地，所述粗纖維相與細纖維相采用同種或不同種的材料。優(yōu)選地，細纖維相由不同材料組成。所述材料優(yōu)選為無細胞毒性的材料所制成的。材料是聚合物，無機非金屬材料，金屬材料以及上述材料的復合物。聚合物材料優(yōu)選自聚苯乙烯、聚外消旋乳酸(PDLLA)、聚乳酸和乙交酯的共聚物，聚碳酸酯、聚酰胺和聚氯乙烯的聚合物材料制成。無機非金屬材料優(yōu)選自磷酸三鈣，羥基磷灰石，硅酸鹽，三氧化二鋁。金屬材料優(yōu)選自鈦，鈦合金，不銹鋼，鉭，鎂合金。所述雙相多孔三維細胞培養(yǎng)支架通過表面改性技術處理，從而改善細胞貼附作用。優(yōu)選地，所述表面改性技術是物理化學方式，包括等離子體處理、輝光放電處理，和/或化學方式，使用H2S04、HNO3強酸處理。優(yōu)選地，所述表面改性技術是一種表面涂層技術，通過涂覆一種多種不同于用于制備本發(fā)明所述構建體的聚合物的涂層物質。優(yōu)選地，所述涂層物質是天然聚合物，包括蛋白、肽、糖胺聚糖、膠原、粘連蛋白和/或合成聚合物，包括聚乙烯醇、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚賴氨酸；和/或無機物質，包括磷酸鈣、TiO2,SiO2,Al2O3;和/或兩種或多種有機材料組成的復合涂層，包括凝膠和脫乙酰殼多糖，聚丙烯酸和聚乙二醇，聚乙烯醇和聚乙烯吡咯烷酮和/或一種無機/有機的復合物，包括磷酸鈣/膠原復合物、鈣磷酸/聚乙二醇復合物、磷酸鈣/胞外基質。優(yōu)選地，所述雙相多孔三維細胞培養(yǎng)支架的細纖維相與支架涂覆同種或者不同種涂層。優(yōu)選地，所述表面涂層物質是以化學方式包括共價鍵、氫鍵、離子鍵或范德華力結合到所述雙相多孔三維細胞培養(yǎng)支架的支柱和/或纖維上。優(yōu)選地，所述雙相多孔三維細胞培養(yǎng)支架做成適合細胞培養(yǎng)平板孔、箱、燒瓶和/或生物反應器的尺寸。優(yōu)選地，所述粗纖維相是由恒定或不同直徑的聚合物支柱和/或纖維組成。優(yōu)選地，所述粗纖維相的孔隙率通過改變構成所述支架的支柱和/或纖維的數量和尺寸而改變。所述粗纖維相的多孔結構也可通過改變支柱和/或纖維的三維定位圖案而改變。優(yōu)選地，所述粗纖維相的支柱和/或纖維具有圓形、三角形、正方形和/或矩形的橫截面。優(yōu)選地，所述雙相多孔三維細胞培養(yǎng)支架帶有的細纖維相覆蓋在粗纖維相構成的三維細胞培養(yǎng)支架的外表面。優(yōu)選地，細纖維相位于粗纖維相構成的支架材料中間。優(yōu)選地，細纖維分布在粗纖維相構成的多孔支架中。實施例I:雙相多孔三維細胞培養(yǎng)支架的制造方法方法一(A)使用聚苯乙烯材料制造雙相多孔三維細胞培養(yǎng)支架，采用快速成型方法制備粗纖維相構成的半成品多孔三維支架。(B)在半成品多孔三維支架外表面采用靜電紡絲技術噴涂細纖維。(C)繼續(xù)在帶有細纖維相的表面采用快速成型方法制備多孔三維支架，從而使得細纖維相被固定在粗纖維相構成的三維支架內部。(D)利用機械切割方法。將雙相多孔三維細胞培養(yǎng)支架切割成所需尺寸。(E)使用一種等離子體表面處理器。在氬氣氣氛中將雙相多孔三維細胞培養(yǎng)支架進行等離子體處理。(F)分別地包裝該等離子體處理過的雙相多孔三維細胞培養(yǎng)支架，并且最終用20KGy劑量的Y射線輻射進行滅菌。方法二(A)使用常規(guī)的聚合物加工方法，包括注塑、纖維織造和粘合技術制造所述支架的單個片層。(B)根據結構設計，將步驟(A)所述的多個多孔片層結構切割或不經切割后，組裝成所述的細胞培養(yǎng)支架。所述組裝優(yōu)選使用非細胞毒性的聚合物纖維或夾子連接件。(C)根據結構設計，可將細纖維相通過靜電紡絲技術噴涂在組裝好的三維支架外表面。也可將纖維噴涂在未組裝的支架的單個片層上，再進行支架組裝。所述表面涂覆處理優(yōu)選是將所述涂層物質化學交聯、加熱交聯、真空加熱交聯和/或輻射交聯到所述細胞支架上。優(yōu)選地，所述交聯是化學進行的。優(yōu)選地，所述交聯是使用加熱進行的。優(yōu)選地，所述交聯是使用真空加熱進行的。優(yōu)選地，所述交聯是使用輻射進行的。進一步優(yōu)選地，所述福射是電子束(e-beam)福射、Y福射和/或紫外線福射。所述涂層優(yōu)選是交聯的。進一步優(yōu)選地，所述交聯是使用輻射進行的，所述輻射優(yōu)選是電子束輻射、Y輻射和/或紫外線輻射。進一步優(yōu)選地，所述交聯是化學進行的。進一步優(yōu)選地，所述交聯是使用加熱和真空進行的。實施例2:使用雙相多孔三維細胞培養(yǎng)支架來培養(yǎng)細胞本發(fā)明還提供在組織培養(yǎng)聚苯乙烯平板中使用該雙相多孔三維細胞培養(yǎng)支架培養(yǎng)活細胞的方法。用于該研究的雙相多孔三維細胞培養(yǎng)支架具有IOmm寬XIOmm長X0.3mm厚的尺寸,具有200μm的正方形孔和400μm的纖維直徑。細纖維直徑為Iμm。使用靜態(tài)接種方法接種平滑肌細胞用移液管將500μI平滑肌細胞懸浮液(1X105個細胞/毫升)從所述支架的上表面加入，使細胞在37°C下貼附2小時后再灌入更多細胞培養(yǎng)基。接種了細胞后，將所述細胞培養(yǎng)支架放入含有細胞培養(yǎng)基的多孔平板中，并且在37°C下，于一種90%濕度的含5-10%C02的空氣氣氛內于培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。所述生長培養(yǎng)基由包含5%(v/v)胎牛血清的Dulbecco氏改進的Eagle’s培養(yǎng)基(Dulbecco’sModifiedEagle’sMedium,DMEM)組成。在使用動態(tài)接種方法的情形下，接種是通過將所述細胞培養(yǎng)支架浸沒于裝在旋轉燒瓶內的細胞懸浮液中，于60rpm下攪拌進行的，并且將該旋轉燒瓶在37°C下放在濕潤的5%C02培養(yǎng)箱中。接種以后，將所述細胞培養(yǎng)支架放置到帶有細胞培養(yǎng)基的組織培養(yǎng)平板的孔中，于37°C下濕潤的5%C02培養(yǎng)箱中進一步培養(yǎng)，并定期更換培養(yǎng)基。當于某一確定的時間點完成細胞培養(yǎng)后，將所述細胞培養(yǎng)支架從細胞培養(yǎng)平板中取出，并進行常規(guī)的分析。并且顯微鏡下觀察在所述細胞培養(yǎng)支架的不同層或位置上的細胞貼附和細胞活性。在所述細胞需要回收的情形下，使用胰蛋白酶-EDTA溶液(SigmaT4049)對所述細胞進行胰酶消化。當細胞從所述細胞培養(yǎng)支架上脫離后，將細胞再次懸浮在小體積的新鮮的包含血清的培養(yǎng)基中，從而使胰蛋白酶失活。然后將這些細胞用于其它目的。實施例3:與聚苯乙烯組織培養(yǎng)平板一起使用本發(fā)明還提供使用所述細胞培養(yǎng)支架在一種聚苯乙烯組織培養(yǎng)平板內培養(yǎng)活細胞的方法。該細胞培養(yǎng)支架是一種圓盤或立方體的形狀，以適合組織培養(yǎng)平板的孔。使用動態(tài)接種或靜態(tài)接種方法，將細胞接種于所述細胞培養(yǎng)支架中。在一個實施例中，使用靜態(tài)接種方法，將一定體積的細胞懸浮液用吸量管從所述細胞培養(yǎng)支架的上表面加入，并讓細胞有一定的時間貼附到其上，然后再用培養(yǎng)液灌洗。接種細胞以后，將所述細胞培養(yǎng)支架放入含有細胞培養(yǎng)液的孔板中，在37°C下，相對濕度90%、二氧化碳含量5-10%的氣氛中于培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。在另一個實施例中，使用動態(tài)接種方法，所述接種是通過在一種旋轉燒瓶中，將所述細胞培養(yǎng)支架浸入細胞懸浮液中來進行的。在接種后，將細胞培養(yǎng)支架放置到帶有培養(yǎng)基的組織培養(yǎng)平板的孔內，在37°C下、5%二氧化碳的培養(yǎng)箱內進行進一步的培養(yǎng)。定期替換細胞培養(yǎng)基。當在某一確定的時間點完成細胞培養(yǎng)以后，將所述細胞培養(yǎng)支架從該細胞培養(yǎng)平板中取出，并進行常規(guī)的試驗。將細胞培養(yǎng)支架拆開，以便在顯微鏡下觀察在所述細胞培養(yǎng)支架的不同層或者不同位置上的細胞貼附和細胞活性。在所述細胞需要回收的情形下，使用胰蛋白酶-EDTA溶液對所述細胞進行胰酶消化。當細胞從所述細胞培養(yǎng)支架上分離后，將細胞再次懸浮在小體積的新鮮的包含血清的培養(yǎng)基中，從而使胰蛋白酶失活。然后可以將這些細胞清洗回收后用于其它目的。實施例4:與生物反應器一起使用本發(fā)明還提供使用所述細胞培養(yǎng)支架在生物反應器內培養(yǎng)活細胞的方法。該細胞培養(yǎng)支架是一種圓盤形或立方形，其尺寸和形狀適合放置于所述生物反應器。在使用靜態(tài)接種方法的一個實施例中，將一定體積的細胞懸浮液用吸量管從所述細胞培養(yǎng)支架的上表面加入，并且在用培養(yǎng)基灌洗前允許細胞貼附一定的時間。在使用靜態(tài)接種方法接種以后，將這些接種了細胞的細胞培養(yǎng)物支架放入充滿細胞培養(yǎng)基的生物反應器中，在37°C下、90%濕度、5-10%二氧化碳的氣氛中培養(yǎng)。在整個細胞培養(yǎng)過程中，細胞培養(yǎng)液持續(xù)地流通過細胞培養(yǎng)支架的孔洞，并被定期更換。當在某一確定的時間點完成細胞培養(yǎng)以后，將所述細胞培養(yǎng)支架從該生物反應器中取出，并進行常規(guī)的試驗。將細胞培養(yǎng)支架拆開，以便在顯微鏡下觀察在所述細胞支架的不同層或者不同位置上的細胞貼附和細胞活性。在所述細胞需要回收的情形下，使用胰蛋白酶-EDTA溶液對所述細胞進行胰酶消化。當細胞從所述細胞培養(yǎng)支架上分離后，將細胞再次懸浮在小體積的新鮮的包含血清的培養(yǎng)基中，從而使胰蛋白酶失活。然后可以將這些細胞清洗回收后用于其它目的。權利要求1.一種雙相多孔三維細胞培養(yǎng)支架，其特征在于，所述雙相多孔三維細胞培養(yǎng)支架是由粗纖維相和細纖維相兩種直徑截然不同的材料構成的，其中粗纖維相比所培養(yǎng)的細胞的尺寸大，細纖維相比所培養(yǎng)細胞的尺寸小，粗纖維相分為多層粗纖維結構，所述相鄰兩層粗纖維結構按一定角度排列，細纖維相單獨結合在粗纖維相的一面或多面；細纖維相均勻分布或集中分布在粗纖維相構成的三維細胞培養(yǎng)支架的孔洞結構中。2.根據權利要求I所述的雙相三維細胞培養(yǎng)支架，其特征在于，所述粗纖維構成的三維細胞培養(yǎng)支架由恒定或不同直徑的支柱和/或纖維組成。3.根據權利要求I所述的雙相三維細胞培養(yǎng)支架，其特征在于，所述細胞培養(yǎng)支架的孔隙率通過改變所述支架中的支柱和/或纖維的數量和尺寸而改變；和/或所述多孔結構通過改變支柱和/或纖維的三維定位圖案而改變。4.根據權利要求I所述的雙相三維細胞培養(yǎng)支架，其特征在于，粗纖維具有圓形、三角形、正方形和/或矩形的橫截面。5.根據權利要求I所述的雙相多孔三維細胞培養(yǎng)支架，其特征在于，所述雙相多孔三維細胞培養(yǎng)支架做成適合細胞培養(yǎng)平板孔、培養(yǎng)室、培養(yǎng)瓶和/或生物反應器的尺寸。6.根據權利要求1-5任一項所述的雙相三維細胞培養(yǎng)支架，其特征在于，粗纖維相的材料與細纖維相的材料為同一種材料。7.權利要求6所述的雙相三維細胞培養(yǎng)支架，其特征在于，粗纖維相與細纖維相均為非降解性材料。8.根據權利要求6所述的雙相三維細胞培養(yǎng)支架，其特征在于，粗纖維相與細纖維相均為可降解性材料。9.根據權利要求6所述的雙相三維細胞培養(yǎng)支架，其特征在于，其中一相材料為非降解材料，另一相為可降解材料。10.根據權利要求I所述的雙相三維細胞培養(yǎng)支架，其特征在于，所述細胞培養(yǎng)支架采用表面改性技術處理改善所述細胞支架的細胞貼附作用。11.根據權利要求10所述的雙相三維細胞培養(yǎng)支架，其特征在于，所述表面改性技術是物理化學方式包括等離子體處理、輝光放電處理，和/或化學方式，使用h2so4、HNO3強酸處理。12.根據權利要求11所述的雙相三維細胞培養(yǎng)支架，其特征在于，所述表面改性技術是一種表面涂覆技術，通過施加一種不同于用于制備權利要求I所述構建體的聚合物的涂層物質，所述涂層物質是天然存在的聚合物，和/或合成聚合物，和/或無機物質，和/或兩種或多種有機材料組成的復合涂層，和/或一種無機/有機的復合物。13.根據權利要求12所述的雙相三維細胞培養(yǎng)支架，其特征在于，所述涂層物質包括蛋白、肽、糖胺聚糖、膠原、粘連蛋白、聚乙烯醇、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚賴氨酸、磷酸鈣、Ti02、Si02、Al203、凝膠和脫乙酰殼多糖、聚丙烯酸和聚乙二醇、聚乙烯醇和聚乙烯吡咯烷酮、磷酸鈣/膠原復合物、鈣磷酸/聚乙二醇復合物、磷酸鈣/胞外基質中的一種或幾種。14.根據權利要求13所述的雙相三維細胞培養(yǎng)支架，其特征在于，所述的表面涂層物質是以化學方式包括共價鍵、氫鍵、離子鍵或范德華力結合到所述細胞培養(yǎng)支架的支柱和/或纖維上。15.一種制造權利要求I所述的雙相三維細胞培養(yǎng)支架的方法，所述方法包括(A)采用快速成型方法制備粗纖維相構成的半成品多孔三維支架；(B)在半成品多孔三維支架外表面采用靜電紡絲技術噴涂細纖維；(C)繼續(xù)在帶有細纖維相的面上采用快速成型方法制備多孔三維支架，從而使得細纖維相被固定在粗纖維相構成的三維支架內部；(D)利用機械切割方法，將雙相多孔三維細胞培養(yǎng)支架切割成所需尺寸；(E)使用一種等離子體表面處理器，在氬氣氣氛中將所述細胞培養(yǎng)支架進行等離子體處理；(F)分別地包裝該等離子體處理過的細胞培養(yǎng)支架，并且最終用20KGy劑量的Y射線輻射進行滅菌。16.一種使用權利要求I所述的雙相三維細胞培養(yǎng)支架培養(yǎng)細胞的方法，所述方法包括(A)使用動態(tài)接種或靜態(tài)接種方法，將細胞接種于所述細胞培養(yǎng)支架中；(B)接種細胞以后，將所述細胞培養(yǎng)支架保持在浸沒于生長培養(yǎng)基之中的細胞培養(yǎng)支持物，包括組織培養(yǎng)平板、培養(yǎng)室、培養(yǎng)瓶和/或生物反應器中進行培養(yǎng)。全文摘要本發(fā)明涉及一種雙相多孔三維細胞培養(yǎng)支架由粗纖維相和細纖維相兩種直徑截然不同的材料構成的，其中粗纖維相比所培養(yǎng)的細胞的尺寸大，細纖維相比所培養(yǎng)細胞的尺寸小，粗纖維相分為多層粗纖維結構，所述相鄰兩層粗纖維結構按一定角度排列，細纖維相單獨結合在粗纖維相的一面或多面；細纖維相均勻分布或集中分布在粗纖維相構成的三維細胞培養(yǎng)支架的孔洞結構中。本發(fā)明雙相多孔三維細胞培養(yǎng)支架中細纖維相具有比細胞小的多的直徑，細胞能夠很容易貼附到納米纖維上，還能夠有效的促進干細胞在其上的分化。因此，添加細纖維到三維細胞培養(yǎng)支架上能夠提高細胞接種效率，并能夠對在其上生長的細胞，特別是干細胞的成長和分化起到促進和調控作用。文檔編號C12N5/00GK102719391SQ201210186049公開日2012年10月10日申請日期2012年6月7日優(yōu)先權日2012年6月7日發(fā)明者劉青申請人:江陰瑞康健生物醫(yī)學科技有限公司