本發明涉及一種基于卡拉膠的多孔支架材料及其制備方法，屬于組織工程生物材料制備技術。

背景技術：

聚電解質配合物(Polyelectrolyte Complex, PEC)是通過帶有相反電荷的聚電解質很容易混合而成，即聚陽離子和聚陰離子之間通過庫侖力結合而形成。按形成PEC的材料類型來劃分，它可分為聚陽離子(Polycations)-聚陰離子(Polyanions)復合物、聚陰離子(Polyions)-兩性大分子(如蛋白質等)復合物及兩性大分子-兩性大分子復合物等。由于其獨特的性能，已經在藥物控制釋放、組織工程等領域得以廣泛應用。天然細胞外基質中含有多種多糖和蛋白質，模擬細胞外基質的多糖-蛋白質聚電解質配合物基支架材料是組織工程支架材料的首選。

卡拉膠是一類線性、含有硫酸酯基團的陰離子多糖。具有重復的α-(1→4)-D-半乳吡喃-β-(1→3)-D-半乳吡喃糖（或3,6內醚-D-半乳吡喃糖）二糖單元骨架結構。根據結構單元上硫酸酯基團數量分為κ (kappa)、ι(iota)、λ (1ambda)三種類型。與重要生物粘多糖之一的硫酸軟骨素相比，卡拉膠有著與其相似的化學結構。近期研究表明，在長期的細胞培養過程中，卡拉膠體系可以促進多種細胞的成活和增殖。與此同時卡拉膠還具有促進細胞產生有序的細胞外基質的能力。卡拉膠制備的凝膠可以很好的促進封裝細胞的生長和分化。這些結果表明支架材料中加入卡拉膠成分有益于促進三維細胞培養，從而能在組織工程中得以廣泛使用。因此，研制基于卡拉膠的多孔支架材料在組織工程研究中具有潛在的應用前景。

技術實現要素：

本發明的目的在于提供一種基于卡拉膠的組織工程用支架材料。

本發明的目的還在于提供上述新型多孔支架材料的制備方法。

本發明是通過以下技術方案實現的：

一、兼具導電和抗氧化性能的苯胺五聚體-谷胱甘肽復合物合成

(1) 將一定量的殼聚糖（分子量5-60 萬，脫乙酰度大于85％）溶于1%的醋酸中，磁力攪拌12 小時，形成質量濃度為2-6%的殼聚糖溶液，備用。

(2) 將一定量的明膠溶于去離子水中，50℃下溶解 12 h，形成質量濃度為6-12%的明膠溶液，備用。

(3) 將步驟(1)制備的殼聚糖溶液和步驟(2)制備的明膠溶液按照一定的比例混合（1:1-1:3）混合均勻，備用。

(4) 配置質量濃度為1%的氯化鉀溶液，并將一定量的卡拉膠(kappa型或Iota型)加入其中，70℃下溶解6-12 h致溶液澄清，配置質量濃度為2-4%的卡拉膠氯化鉀溶液。

(5) 將步驟(4)獲得的卡拉膠溶液加入步驟(3)制備殼聚糖-明膠混合溶液中，使卡拉膠含量為5%-50%，超聲粉碎，快速機械攪拌，均勻后，加入一定量的戊二醛溶液(0.25%，戊二醛與混合溶液的體積比為1:4)，繼續攪拌1-2小時后將倒入模具中，室溫靜止12-24小時，形成混合凝膠。

(6) 將步驟(5)形成的混合凝膠，至于低溫冰箱中，-30℃- -60℃冷凍12小時以上。然后在冷凍干燥機中凍干48小時，形成多孔支架材料。

(7) 將步驟(6)凍干后所得支架材料置于 2％的 NaOH/乙醇水溶液中浸泡 6-12h，用水洗至中性后，再將支架置于 2％NaBH4溶液中浸泡4-8h，最后浸泡于蒸餾水中洗至中性。

(8) 將步驟(7)獲得的支架再次冷凍干燥，獲得基于卡拉膠的多孔支架材料。

本發明的有益效果：本發明制備的卡拉膠基多孔支架材料在化學結構上與天然細胞外基質類似。該支架中存在有陰離子多糖卡拉膠與陽離子多糖殼聚糖之間的靜電相互作用，同時也存在殼聚糖和/或明膠之間的交聯網絡。此外，可通過調整支架中卡拉膠的含量改變其在復合支架中的構象。在制備方法上采用離子屏蔽技術，使殼聚糖和卡拉膠能夠形成均已穩定的配合物而不是不均一的沉淀。此外，所制備的卡拉膠基多孔支架材料的平均孔徑在200 μm左右，且孔徑大小隨著支架中卡拉膠含量的增加而減小，該類支架具有良好的溶脹特性和力學強度。此外，該支架材料能夠支持間充質干細胞、軟骨細胞的粘附與生長。這些優異的性能說明，該方法制備的卡拉膠基多孔支架材料在組織工程中具有良好的應用前景。

附圖說明

圖1：軟骨細胞和支架材料共培養結構圖

具體實施方式

實施所用的主要原料為明膠、殼聚糖、卡拉膠、氯化鉀、戊二醛、氫氧化鈉、硼氫化鈉等均為化學純。

實施例一：卡拉膠基多孔支架材料制備

(1) 將分子量20 萬，脫乙酰度大于85%的殼聚糖溶于1%的醋酸中，磁力攪拌12 小時，制備質量濃度為3%的殼聚糖溶液。

(2) 將一定量的明膠溶于去離子水中，50℃下溶解 12 h，形成質量濃度為6%的明膠溶液，備用。

(3) 將步驟(1)制備的殼聚糖溶液和步驟(2)制備的明膠溶液按照體積比為混合均勻，備用。

(4) 配置質量濃度為1%的氯化鉀溶液，并將一定量的kappa型卡拉膠加入其中，70℃下溶解6致溶液澄清，配置質量濃度為2%的卡拉膠氯化鉀溶液。

(5) 將步驟(4)獲得的卡拉膠溶液加入步驟(3)制備殼聚糖-明膠混合溶液中，體積比為,2:10，使卡拉膠的固體含量為10%，超聲粉碎，快速機械攪拌，均勻后，加入一定量的戊二醛溶液(0.25%，戊二醛與混合溶液的體積比為1:4)，繼續攪拌2小時后將倒入模具中，室溫靜止12小時，形成混合凝膠。

(6) 將步驟(5)形成的混合凝膠，至于低溫冰箱中，-45℃冷凍12小時以上。然后在冷凍干燥機中凍干48小時，形成多孔支架材料。

(7) 將步驟(6)凍干后所得支架材料置于 2％的 NaOH/乙醇水溶液中浸泡 12h，用水洗至中性后，再將支架置于 2％NaBH₄溶液中浸泡4h，最后浸泡于蒸餾水中洗至中性。再次冷凍干燥，獲得基于卡拉膠的多孔支架材料。

實施例三：軟骨細胞在支架材料中的種植

（1）將所制備的支架材料⁶⁰Co輻照滅菌24小時，備用。

（2）取健康3周齡SD大鼠，應用頸椎脫臼法處死大鼠，酒精浸泡消毒30min后，在超凈工作臺內小心分離四肢長管骨，充分暴露股骨頭、脛骨平臺和肩關節處等處軟骨組織，DMEM/F12培養基沖洗干凈后小心剔除軟骨組織，將得到的組織置于EP管中并充分剪碎，以900r/min離心3min，倒掉上清液，加入1ml 0.2%Ⅱ型膠原酶反復吹打，置于37℃的震蕩水浴器中震蕩12小時，取出后以900r/min離心3min，倒掉上清液，加入已配置好的完全培養液反復吹打，接種于25ml培養瓶，將其置于37 °C培養箱中培養。2天后首次換液，以后每2～3天換液一次，待原代細胞鋪滿瓶底80%時傳代。本實驗采用第二代細胞,將軟骨細胞，按照密度為8×10⁵/ml的細胞種植在覆蓋有支架的24孔板中，將其置于37°C培養箱中培養，隔天換液。

（3）共培養7、14、21天取材，對其進行切片并采用免疫熒光染色，發現支架中的細胞表現出很好的活性(如圖1所示)。