專利名稱：一種應用自誘導培養基和雙溫度調控策略生產胞外普魯蘭酶的方法
技術領域：
一種應用自誘導培養基和雙溫度調控策略生產胞外普魯蘭酶的方法，屬于微生物發酵生產普魯蘭酶的技術領域。
背景技術：
普魯蘭酶(pullulanase，EC 3. 2. I. 41)是專ー性分解普魯蘭、淀粉、支鏈淀粉和相應分支低聚糖中α-1，6-糖苷鍵的ー種脫支 酶。與其他普魯蘭水解酶相比，普魯蘭酶特異地水解普魯蘭中α-1，6-糖苷鍵，生成以麥芽三糖為主的末端產物。該性質決定了它在改善淀粉酶對淀粉的作用效果、提高淀粉利用率、降低糧耗、提高產品質量及開發新的產品方面有著相當巨大的價值，在淀粉加工エ業、食品、洗滌劑、紡織等中有著重要的用途和良好的市場前景。普魯蘭酶最早是Bender在出芽短梗霉的發酵液中發現并對其酶學性質做了研究。此后，科研工作者從自然界中分離得到了大量產普魯蘭酶的微生物及植物。這些來源的酶性質差別較大，如來源于planticola，最適pH在5. O,最適溫度在40°C ;而來源于植物的普魯蘭酶(稱R-enzyme),最適的pH和溫度分別是5. 6和37°C。盡管如此，從普魯蘭酶的發現到20世紀70年代末，普魯蘭酶的研究一直處于產酶微生物的篩選和酶學性質的鑒定上，并沒有出現普魯蘭酶的規模化生產。直到20世紀80年代初，丹麥諾維信公司從馬來西亞的土壌中篩選到一株可以產普魯蘭酶的芽孢桿菌(ガadVAAs acidopulIulytics、。該菌株所生產的普魯蘭酶具有耐熱耐酸的特性(60°C，pH4.5)比較適合于淀粉糖化エ業的需要。此后，諾維信公司投入巨資對該普魯蘭酶進行研究，并于1983年在日本和歐洲市場同時推出商品化的普魯蘭酶(商品名為PiOmozyme)。目前，諾維信公司占據了中國乃至世界的普魯蘭酶市場。直到1995年杰能科公司利用地衣芽孢桿菌異源表達了 Bacillus deramificans的普魯蘭酶,其酶學性質與ガ.acidopullulytics普魯蘭酶相近,從而使杰能科成為了普魯蘭酶的第二大生產商。由于普魯蘭酶エ業化生產菌株較少，我國在普魯蘭酶上的研究主要集中在產普魯蘭酶菌株的篩選、誘變及優化等方面，效果均不太理想。如1998年山東大學肖敏等人從白酒發酵現場分離得到一株產普魯蘭酶的微生物，其生產的普魯蘭酶耐熱性較差，當溫度大于50°C后迅速失活，但是pH穩定性較好，在中性和微酸性條件下可于冰箱中長期保存。2001年唐寶英等人從土壤中分離得到一株產普魯蘭酶的芽孢桿菌，其產普魯蘭酶有較好的酶學性質(75°C，pH 4. 6)，但是野生菌株的產酶能力不高，只有1.6 U/mL，經過誘變育種最終才使其產酶水平提高到8. 8 U/mL。近年來隨著分子生物學發展，人們開始利用基因工程手段表達外源普魯蘭酶基因，如2006年夏子芳等利用大腸桿菌表達系統表達海棲熱袍菌的普魯蘭酶基因，但僅獲得胞內酶活；2008年張明炎等將來源于ガaciBiAs Iicheniformis的普魯蘭酶編碼基因克隆到大腸桿菌中進行表達，但是最終的酶活也只有5. 6 U/mL ；2010年，王淑軍等利用大腸桿菌的表達系統實現了來源于深海古菌sicuIi HJ21的普魯蘭酶編碼基因的異源表達，但是異源表達的效果較差，且僅獲得胞內酶活。綜上所述，在普魯蘭酶的微生物發酵生產過程中，不論是野生菌還是工程菌，主要存在的問題就是胞外酶活較低，造成了普魯蘭酶的生產成本上升，形成エ業化生產的障礙。自誘導(auto-induction)是最早由紐約厄普頓的布魯克黑文國家實驗室的Studier等提出的ー種利用培養基中碳源轉換而誘導外源基因表達的方法，即首先以葡萄糖為碳源支持大腸桿菌生長至飽和，待葡萄糖消耗殆盡，培養基中另ー種成分乳糖在Iac Y與lac Z的基因產物透過酶(lactose permease)和β -半乳糖苷酶(β-galactosidase)的協助下，乳糖穿過細胞膜并部分轉化為異乳糖開啟T7表達系統的方法。乳糖除了作為誘導物之外，其代謝產物葡萄糖和半乳糖(半乳糖在gal操縱子的作用下也將轉化成葡萄糖)也可作為細菌生長的碳源。與傳統的IPTG (異丙基-β-D-硫代半乳糖苷)誘導方法相比，在接種之后自誘導表達過程不需要對細胞的生長情況進行監測，從而減少了在培養過程中對培養物的處理，極大地方便了高通量篩選。而且，以價格低廉、無毒的乳糖替代價格高昂的IPTG可以大大地降低生產的成本，在重組蛋白的發酵生產中有著重要的意義。此外，針對重組蛋白的誘導分泌表達，采用雙溫度分階段調控策略已成功用于葡萄糖基轉移酶分泌 蛋白的活性表達，如先在37°C條件下培養增加菌體量，然后降低溫度到25°C減緩重組蛋白的合成速率以促進其分泌至胞外。然而，目前自誘導培養基主要應用于核磁共振分析的同位素標記重組蛋白的表達，尚無將自誘導培養基用于重組普魯蘭酶發酵生產的報道。而且，將自誘導培養方式和雙溫度調控的聯合策略用于重組普魯蘭酶發酵生產也鮮有報道。本發明將自誘導培養基和雙溫度調控方式成功應用于普魯蘭酶基因工程菌的培養和酶蛋白表達，與傳統的LB培養基和IPTG誘導方法相比，胞外重組普魯蘭酶的發酵酶活從 11 U/mL 提升到 70 U/mL。

發明內容
( I)要解決的技術問題
本發明的目的是提供一種應用自誘導培養基和雙溫度調控策略生產胞外普魯蘭酶的方法。本發明目的不僅僅在于通過微生物菌株發酵生產胞外普魯蘭酶，而是將普魯蘭酶基因在大腸桿菌中重組表達，而且利用自誘導培養基和雙溫度調控方式進ー步提高重組大腸桿菌生產胞外普魯蘭酶的能力和產量，從而開發新型重組普魯蘭酶的生產エ藝和應用價值。(2)技術方案
本發明首先將來源于黑座克雷伯氏菌(variicola) CCTCC NO M 2012108的普魯蘭酶基因在大腸桿菌中進行重組表達，在此基礎上，將自誘導培養基和雙溫度調控方式用于重組菌的培養和重組普魯蘭酶的發酵生產。一、普魯蘭酶基因的獲得
黑座克雷伯氏菌GWeZwieWa variicola ) CCTCC NO M 2012108培養基可溶性淀粉10 g/L，蛋白胨 15 g/L，酵母膏 5 g/L，KH2PO4 5 g/L，MgSO4 · 7H20 O. I g/L，NH4Cl 0. 5 g/L, FeSO4 · 7H20 0. I g/L, pH 6. 5。將黑座克雷伯氏菌(Z/e/wieBa variicola) CCTCC NO M 2012108菌種接種于培養基裝液量為10%的250 mL搖瓶中，于37°C、200 rpm振蕩培養72 h。培養結束后，將菌體離心并用生理鹽水洗漆兩次，收集細胞利用基因組DNA提取試劑盒Genomic DNA ExtractionMiniprep System (VI0GENE 公司)提取基因組。合成引物I :5’_ CGG CTA GCA TGC TCA GAT ATA CCT GTC ATG G -3’，合成引物2 :5，_ CCG GAA TTC CGT TTA CTG CTC ACC GGC G -3’。引物 I 含有MeI 限制性酶切位點，引物2含有EcoRl限制性酶切位點。PCR 反應體系ddH20 37 μ L，10 X Reaction Buffer 5 μ L,dNTP(25 mmol/L)0. 5yL，引物 I (50 pmol/μ L) I yL，引物 2 (50 pmol/μ L) I μ L，基因組 DNA 5 μ L，Taq DNA polymerase (5 U/μ L) 0. 5 μ L。PCR 反應過程94°C 預變性 5 min ；98°C 10 s，55°C I min，72°C 4 min，進行 30個循環；72°C延伸10 min。利用3S Spin Agarose Gel DNA Purification Kit(上海申能博彩生物科技有限公司)純化DNA片斷。DNA溶液中加入1/10體積的こ酸鈉溶液(3 mol/L, pH 5. 2)和2倍體積無水こ醇，-20°C沉淀I小時。12000 rpm于4°C離心30 min。加入75%こ醇500 μ L洗滌，12000
rpm于4°C離心30 min，無菌操作臺吹干后溶于適量TE緩沖液中，立即使用或_20°C保存。ニ、含有普魯蘭酶基因的重組大腸桿菌的構建 目的基因及質粒pET28a(+)的酶切
利用質粒提取試劑盒Mini-Plasmid Rapid Isolation Kit (北京博大泰克生物基因技術有限公司)提取質粒pET28a(+)。按照水、緩沖液、PCR產物或質粒DNA、酶的順序加到Eppendorf管中，蓋好管蓋，振蕩使液體充分混勻，置于離心機內離心2 s使液體集中于管底，37°C水浴3 h，在管中加入1/10的Loading Buffer或將管置于65°C保溫10 min，終止酶切反應。酶切產物進行瓊脂糖凝膠電泳分析并切膠回收目的片段，濃縮。反應體系組成10XHBuffer 4 μ L, DNA 10 μ L，NheI 2 μ L，EcoRI 2 μ L,ddH20將體系補足40 μし目的基因與質粒pET28a(+)的連接
將外源基因與質粒pET28a(+)連接，反應體系組成如下質粒pET28a(+) 0.8 yL，外源基因4. 2 μ L，Ligation Solution 5 μ L，ddH20將體系補足10 μし混合連接液，將其置于16°C培養箱中連接12 h。利用限制性內切酶NheI和EcoRI對擴增得到的CCTCC NO M 2012108普魯蘭酶編碼基因與載體pET28a(+)進行雙酶切處理，處理后DNA片斷通過粘性末端連接獲得帶有目的基因片斷的重組質粒pET28a(+)-pul A ；
重組質粒轉化大腸桿菌
在100 μ L大腸桿菌^: cWi BL21(DE3)感受態細胞懸液中加入10 μ L連接產物，輕輕混勻，冰浴中靜置30 min。轉入42°C水浴中，熱擊90 S。快速轉移至冰浴中，冷卻2min。加入700 μ L LB液體培養基，37°C 100 rpm搖床溫育培養I h。培養后菌液3000rpm離心2 min,棄上清600 μ L，剩余菌液混勻后涂布到含有50 μ g/mL卡那霉素的LB平板上，37°C倒置培養。獲得含有目的普魯蘭酶基因的重組大腸桿菌萬.coli BL21 (DE3)/pET28a (+)-pul A。
誘導表達培養
LB培養基胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L, NaCl 10 g/L, pH7. O。需要時使用前加入卡那霉素(50 μ g/mL),固體培養基添加I. 5%瓊脂粉。挑取陽性克隆單菌落接種于3 mL含50 μ g/mL卡那霉素的LB液體培養基中，于37°C, 200 rpm振蕩培養過夜。取I mL培養液轉接于50 mL含50 μ g/mL氨芐青霉素的LB液體培養基中，于37で、200 rpm振蕩培養至OD6tltl約為O. 6。向培養物中加入誘導物IPTG至終濃度(Tl mmol/L，在培養溫度3(T37°C下進行誘導培養12小時。培養結束后，將發酵液于10000 rpm離心10分鐘后得發酵上清用于菌株胞外酶活的測定。利用LB培養基和IPTG誘導方式，獲得胞外重組普魯蘭酶活力為11 U/mL。普魯蘭酶測定方法
取100 μ L用100 mM、pH 5. O的醋酸緩沖適當稀釋的酶液與等體積的溶于100 mM、pH5. O醋酸緩沖中的10 g/L普魯蘭相混合于50で水浴中保溫30分鐘。加入DNS試劑300μ L搖勻，置于沸水中煮沸15分鐘，取出以流動流動水迅速冷卻后，于540 nm波長處，以O. 5cm比色杯,測定反應液的吸光度值。酶活單位定義在上述指定的條件下，每分鐘催化分解普魯蘭多糖生成相當于Iμ mo I葡萄糖的還原糖所需的醒為I個酶活単位(U)。三、重組大腸桿菌的自誘導培養和雙溫度調控發酵產酶
自誘導培養基α-乳糖10 -20g /L，葡萄糖0.5-1 g /L，甘油5 g /L，KH2PO4 6.8g /L, MgSO4 O. 24 g/L，蛋白胨 10 g /L，Na2HPO4 · 12H20 17. 9 g/L，Na2SO4 O. 71 g/L，NH4Cl2.67 g/L,痕量元素溶液200 yL/L,用超純水配置。痕量元素溶液
50 μ M FeCl3, 20 μ M CaCl2 · 2Η20,10 μ M MnCl2 · 4Η20,10 μ M ZnSO4 · 7Η20, 2 μ MCoCl2 · 6Η20, 2 μ M CuCl2, 2 μ M NiCl2, 2 μ M Na2Mo7O24, 2 μ M Na2SeO3, 2 μ M H3B4O7,用超純水配置。將重組大腸桿菌^:coli BL21 (DE3) / pET28a (+)-pul A 于含有 50 μ g/mL 卡那霉素的LB固體培養上過夜活化培養，從固體平板上挑取單個菌落接種于3 mL含有50 μ g/mL卡那霉素的液體LB培養基中于37°C，200 rpm振蕩培養，隨時監測培養基中0D_的變化情況。待OD6tltl達到2 3吋，按5% 10%接種量接種于50 mL含50 μ g/mL卡那霉素的自誘導培養基中。將接種之后的自誘導培養基于37°C，200 rpm培養2 4小時后，將培養的溫度降低到25°C繼續培養48 72小吋。培養結束后，10000 rpm離心去除菌體，收集發酵上清液為普魯蘭酶的粗酶液。自誘導培養基成分及發酵條件的優化
分別考察了碳源、氮源及培養基添加物對工程菌^: coli BL21/pET28a(+)-pulA生 長及分泌重組普魯蘭酶的影響，最終確定了發酵生產胞外普魯蘭酶的優化自誘導培養基組成
α-乳糖 20 g/L，葡萄糖 I g/L，甘油 5 g/L, KH2PO4 6.8 g/L, MgSO4 O. 24 g/L，蛋白胨，10 g/L, Na2HPO4 · 12H20 17. 9g/L, Na2SO4 0. 71 g/L, NH4Cl 2. 67 g/L, Tween-80 9 g/L,痕量元素溶液200 μ L/Lo分別考察了起始pH、裝液量、溫度、培養時間對胞外酶活的影響，最終確定了工程菌^: coli BL21/pET28a(+)-pulA產酶的培養條件為起始ρΗ5· O，裝液量10% 20%，培養溫度為37°C先培養4小時后，再轉入25°C培養56小吋。采用優化自誘導培養基和雙溫度發酵條件后，胞外普魯蘭酶酶活可以達到6(Γ70U/mL ο(3)有益效果
成功克隆了黑座克雷伯氏菌variicola ) CCTCC NO M 2012108普魯蘭酶編碼基因，該基因全長3309 bp，編碼1102個氨基酸殘基，其基因的核苷酸序列為SEQ IDNO :1，其氨基酸組成為SEQ ID NO :2。將黑座克雷伯氏菌(Z/e/wieBa variicola) CCTCC NO M 2012108普魯蘭酶編碼基因插入表達載體pET28a(+)中并轉化入相應表達宿主萬.coli BL21(DE3)中成功構建帶有目的基因的重組菌株^: coli BL21 (DE3) / pET28a (+)-pul A。將自誘導培養基和雙溫度調控方式用于重組大腸桿菌^: coli BL21 (DE3)/pET28a(+)-pul A的培養和普魯蘭酶的發酵產酶，優化自誘導培養基和雙溫度發酵條件后，胞外普魯蘭酶酶活可以達到6(T70 U/mL。這些工作為重組大腸桿菌生產胞外普魯蘭酶的能カ和產量的提高提供了有效策略，對于今后開發新型重組普魯蘭酶的生產エ藝和應用價值具有重要意義。生物材料樣品保藏黑座克雷伯氏菌(J1 ebsi ella vari I cola ) SHN-1 ;保藏單位中國典型培養物保藏中心，簡寫CCTCCJii :中國武漢武漢大學，保藏編號CCTCC NO M2012108，保藏日期為2012年4月11日。
具體實施例方式實施例I
自誘導培養基α-乳糖10 g/L，葡萄糖0.5 g/L，甘油5 g/L, KH2PO4 6.8 g/L, MgSO4O. 24 g/L，蛋白胨 10 g/L，Na2HPO4 · 12H20 17. 9 g/L，Na2SO4 0. 71 g/L，NH4Cl 2. 67 g/L，痕量元素溶液200 μ L/Lo將重組大腸桿菌^: coli BL21 (DE3)/ pET28a(+)-pul A的菌種劃線于含有50μ g/mL卡那霉素的LB固體培養基上于37°C培養箱中培養過夜。從平板上挑取單個菌落接種于裝有50 mL LB培養基(50 μ g/mL卡那霉素)的250 mL三角瓶中，置于37°C、200 rpm搖床中震蕩培養，至0D_達到2. (Γ3. O左右。將此種子培養液以5%的接種量接種于裝有50mL上述自誘導培養基的250 mL三角瓶中，于37°C培養60小時(此時OD6tltl達到15左右)，結束發酵。
通過此重組菌培養和發酵產酶エ藝，發酵上清中胞外普魯蘭酶的酶活達到15 U/mL。實施例2
自誘導培養基α-乳糖20 g/L，葡萄糖I g/L，甘油5 g/L, KH2PO4 6.8 g/L, MgSO4O. 24 g/L，蛋白胨 10 g/L，Na2HPO4 · 12H20 17. 9 g/L，Na2SO4 0. 71 g/L，NH4Cl 2. 67 g/L，痕量元素溶液200 μ L/Lo將重組大腸桿菌^: coli BL21 (DE3)/ pET28a(+)-pul A的菌種劃線于含有50μ g/mL卡那霉素的LB固體培養基上于37°C培養箱中培養過夜。從平板上挑取單個菌落接種于裝有50 mL LB培養基(50 μ g/mL卡那霉素)的250 mL三角瓶中，置于37°C、200 rpm搖床中震蕩培養，至OD_達到2. (Γ3. O左右。將此種子培養液以5%的接種量接種于裝有50mL上述自誘導培養基的250 mL三角瓶中，于25°C培養60小時(此時OD_達到15左右)，結束發酵。通過此重組菌培養和發酵產酶エ藝，發酵上清中胞外普魯蘭酶的酶活達到35 U/mL。實施例3
自誘導培養基α-乳糖20 g/L，葡萄糖I g/L，甘油5 g/L, KH2PO4 6.8 g/L, MgSO4O. 24 g/L，蛋白胨 10 g/L，Na2HPO4 · 12H20 17. 9 g/L，Na2SO4 0. 71 g/L，NH4Cl 2. 67 g/L，痕量元素溶液200 μ L/Lo將重組大腸桿菌^: coli BL21 (DE3)/ pET28a(+)-pul A的菌種劃線于含有50μ g/mL卡那霉素的LB固體培養基上于37°C培養箱中培養過夜。從平板上挑取單個菌落接種于裝有50mL LB培養基(50 μ g/mL卡那霉素)的250 mL三角瓶中，置于37°C、200 rpm搖床中震蕩培養，至0D_達到2. (Γ3. O左右。將此種子培養液以5%的接種量接種于裝有50 mL上述自誘導培養基的250 mL三角瓶中，先于37°C、200 rpm搖床中培養4小時后，再將搖床的溫度調低到25°C繼續培養56小時(此時OD6tltl達到15左右)，結束發酵。通過此重組菌培養和發酵產酶エ藝，發酵上清中胞外普魯蘭酶的酶活達到50 U/mL。實施例4
自誘導培養基α-乳糖20 g/L，葡萄糖I g/L，甘油5 g/L, KH2PO4 6.8 g/L, MgSO4
O.24 g/L，蛋白胨 10 g/L, Na2HPO4 · 12H20 17. 9 g/L, Na2SO4 0. 71 g/L, NH4Cl 2. 67 g/L,Tween-80 9 g/L,痕量元素溶液 200 μ L/L。將重組大腸桿菌^: coli BL21 (DE3)/ pET28a(+)-pul A的菌種劃線于含有50μ g/mL卡那霉素的LB固體培養基上于37°C培養箱中培養過夜。從平板上挑取單個菌落接種于裝有50 mL LB培養基(50 μ g/ml卡那霉素)的250 mL三角瓶中，置于37°C、200 rpm搖床中震蕩培養，至0D_達到2. (Γ3. O左右。將此種子培養液以5%的接種量接種于裝有25 mL上述自誘導培養基的250 mL三角瓶中，先于37°C、200 rpm搖床中培養4小時后，再將搖床的溫度調低到25°C繼續培養56小時(此時OD6tltl達到15左右)，結束發酵。通過此重組菌培養和發酵產酶エ藝，發酵上清中胞外普魯蘭酶的酶活達到70 U/mL。
權利要求
1.一種應用自誘導培養基和雙溫度調控策略生產胞外普魯蘭酶的方法，其特征在于將重組大腸桿菌萬.COli BL21 (DE3)/ pET28a(+)-pul A接種于自誘導培養基中，并采用雙溫度調控方式，即將接種之后的自誘導培養基于37°C、200 rpm培養2 4小時后，將培養的溫度降低到25°C繼續培養48 72小吋，培養結束后，收集發酵上清液獲得胞外普魯蘭酶；步驟為 (I)將來源于黑座克雷伯氏菌OWe/wieBa variicola) CCTCC NO M 2012108的普魯蘭酶基因在大腸桿菌中進行重組表達 a、普魯蘭酶基因的獲得 CCTCC NO M 2012108培養基可溶性淀粉10 g/L，蛋白胨15 g/L，酵母膏5 g/L，KH2PO4 5 g/L, MgSO4 · 7H20 O. I g/L, NH4Cl 0. 5 g/L, FeSO4 · 7H20 0. I g/L，用超純水配制，pH 6. 5 ； CCTCC NO M 2012108菌種接種于培養基裝液量為10%的250 mL搖瓶中，于37°C、·200 rpm振蕩培養72 h ;培養結束后，將菌體離心并用生理鹽水洗滌兩次，收集細胞利用VI0GENE 公司的基因組DNA提取試劑盒Genomic DNA Extraction Miniprep System提取基因組DNA ； 黑座克雷伯氏菌OWeAsieWa variicolaXClCC NO M 2012108普魯蘭酶，其基因的核苷酸序列為SEQ ID NO :1，其氨基酸組成為SEQ ID NO 2 ； 合成引物 I :5’_ CGG CTA GCA TGC TCA GAT ATA CCT GTC ATG G -3’，引物 I 含有 MeI限制性酶切位點； 合成引物 2:5’- CCG GAA TTC CGT TTA CTG CTC ACC GGC G -3’，引物 2 含有^bo/PI限制性酶切位點； PCR 反應體系ddH20 37 μ L，10 X Reaction Buffer 5 μ L,25 mmol/L 的 dNTP 0.5μ L,50 ρ θ1/μΙ^|_1:1 μ L, 50 pmol/yL 引物 2:1 μ L，基因組DNA 5 μ L, 5 U/ μ L ^Taq DNA polymerase 0. 5 μ L ； PCR 反應過程94°C 預變性 5 min ；98°C 10 s，55°C I min,72°C 4 min，進行 30 個循環；72°C延伸 10 min ； 利用上海申能博彩生物科技有限公司的3S Spin Agarose Gel DNA Purification Kit純化DNA片斷 DNA溶液中加入1/10體積的3 mol/L、pH 5. 2的こ酸鈉溶液和2倍體積無水こ醇，-20°C沉淀I小時；于4°C、12000 rpm離心30 min ;加入75%こ醇500 “し洗滌，于4で、·12000 rpm離心30 min，無菌操作臺吹干后溶于適量TE緩沖液中，立即使用或-20°C保存； b、含有普魯蘭酶基因的重組大腸桿菌的構建 將CCTCC NO M 2012108普魯蘭酶編碼基因與質粒pET28a(+)連接，重組質粒轉化大腸桿菌萬.coB BL21(DE3)感受態細胞，通過含有50 μ g/mL卡那霉素的LB平板篩選獲得含有目的普魯蘭酶基因的重組大腸桿菌萬.coli BL21 (DE3) / pET28a (+)-pul A ;步驟為: 目的基因及質粒pET28a(+)的酶切 利用質粒提取試劑盒Mini-Plasmid Rapid Isolation Kit,北京博大泰克生物基因技術有限公司提供，提取質粒pET28a(+)； 按照水、緩沖液、PCR產物或質粒DNA、酶的順序加到Eppendorf管中，蓋好管蓋，振蕩使液體充分混勻，置于離心機內離心2 s使液體集中于管底，37°C水浴3 h，在管中加入1/10的Loading Buffer或將管置于65°C保溫10 min，終止酶切反應；酶切產物進行瓊脂糖凝膠電泳分析并切膠回收目的片段，濃縮；反應體系組成10 X H Buffer 4 μ L,DNA 10 μ L,Nhel 2 μ L, EcoRl 2 μ L，ddH20 將體系補足40 μ L ; 目的基因與質粒pET28a(+)的連接 將CCTCC NO M 2012108普魯蘭酶編碼基因與質粒pET28a(+)連接，反應體系組成如下質粒 pET28a(+) O. 8 μ L,外源基因 4. 2 μ L, Ligation Solution 5 μ L ;混合連接液，將其置于16°C培養箱中連接12 h ； 利用限制性內切酶NheI和EcoRI對擴增得到的CCTCC NO M 2012108普魯蘭酶編碼基因與載體pET28a(+)進行雙酶切處理，處理后DNA片斷通過粘性末端連接獲得帶有目的基因片斷的重組質粒pET28a(+)-pul A ； 重組質粒轉化大腸桿菌 在100 μ L大腸桿菌^: cWi BL21(DE3)感受態細胞懸液中加入10 μ L連接產物，輕輕混勻，冰浴中靜置30 min ;轉入42°C水浴中，熱擊90 s ;快速轉移至冰浴中，冷卻2min;加入700 μ L LB液體培養基，37°C 100 rpm搖床溫育培養I h;培養后菌液3000 rpm離心2 min，棄上清600 μ L，剩余菌液混勻后涂布到含有50 μ g/mL卡那霉素的LB平板上，37°C倒置培養；獲得含有目的普魯蘭酶基因的重組大腸桿菌萬.coli BL21 (DE3)/pET28a(+)-pul A ； (2)重組大腸桿菌的自誘導培養和雙溫度調控發酵產酶 自誘導培養基α-乳糖10-20 g /L，葡萄糖0.5-1 g /L，甘油5 g /L，KH2PO4 6.8g /L, MgSO4 O. 24 g/L，蛋白胨 10 g /L，Na2HPO4 · 12H20 17. 9 g/L，Na2SO4 O. 71 g/L，NH4Cl2.67 g/L，痕量元素溶液200 yL/L，用超純水配制；痕量元素溶液含 50 μ M FeCl3, 20 μ M CaCl2 · 2H20，10 μ M MnCl2 · 4Η20，10 μ MZnSO4 · 7Η20,2 μ M CoCl2 · 6Η20，2 μ M CuCl2, 2 μ M NiCl2, 2 μ M Na2Mo7O24, 2 μ M Na2SeO3和2 μΜ H3B4O7，用超純水配制； 產酶的培養條件為將重組大腸桿菌^: coli BL21 (DE3)/ pET28a(+)-pul A于含有50 μ g/mL卡那霉素的LB固體培養基上過夜活化培養，從固體平板上挑取單個菌落接種于3 mL含有50 μ g/mL卡那霉素的液體LB培養基中于37°C、200 rpm振蕩培養，隨時監測培養基中OD6tltl的變化情況，待OD6tltl達到2 3吋，按5% 10%接種量接種于50 mL含50 μ g/mL卡那霉素的自誘導培養基中，將接種之后的自誘導培養基于37で、200 rpm培養2 4小時后，將培養的溫度降低到25°C繼續培養48 72小時，培養結束后，10000 rpm離心去除菌體，收集發酵上清液為普魯蘭酶的粗酶液。
2.根據權利要求I所述應用自誘導培養基和雙溫度調控策略生產胞外普魯蘭酶的方法，其特征在于發酵生產胞外普魯蘭酶的優化自誘導培養基組成為 α-乳糖 20 g/L，葡萄糖 I g/L，甘油 5 g/L, KH2PO4 6.8 g/L, MgSO4 O. 24 g/L，蛋白胨 10 g/L, Na2HPO4 · 12H20 17. 9g/L, Na2SO4 0. 71 g/L, NH4Cl 2. 67 g/L, Tween-80 9 g/L,痕量元素溶液200 yL/L，用超純水配制； 工程菌^: coli BL21/pET28a(+)-pulA產酶的優化培養條件為起始ρΗ5· 0 8· 0，裝液量10% 20%，培養溫度為37°C、200 rpm先培養4小時后，再轉入25°C培養56小時； 采用優化自誘導培養基和雙溫度發酵條件后，胞外普魯蘭酶酶活達到6(T70 U/mL。
全文摘要
一種應用自誘導培養基和雙溫度調控策略生產胞外普魯蘭酶的方法，屬于微生物發酵生產普魯蘭酶的技術領域。本發明將黑座克雷伯氏菌(Klebsiellavariicola)CCTCC NOM2012108普魯蘭酶編碼基因插入表達載體pET28a(+)中構建重組質粒，并轉化大腸桿菌獲得含有目的普魯蘭酶基因的重組菌株E.coliBL21(DE3)/pET28a(+)-pulA。利用自誘導培養基，并采用先37℃培養2~4小時后25℃繼續培養48~72小時的雙溫度調控方式，將重組大腸桿菌E.coliBL21(DE3)/pET28a(+)-pulA進行培養和發酵產酶。采用優化后的自誘導培養基和雙溫度發酵條件后，胞外普魯蘭酶酶活可以達到60~70U/mL。本發明為重組大腸桿菌生產胞外普魯蘭酶提供了有效策略，對于今后開發新型重組普魯蘭酶的生產工藝和應用價值具有重要意義。
文檔編號C12N15/56GK102676480SQ20121018706
公開日2012年9月19日 申請日期2012年6月8日 優先權日2012年6月8日
發明者徐巖, 聶堯, 陳文波 申請人:江南大學