專利名稱：一種產色葡萄球菌gap基因序列及其引物的獲取方法
技術領域：
本發明涉及一種基因序列，具體涉及一種產色葡萄球菌gap基因序列及其引物的獲取方法，屬生物檢測技術領域。
背景技術：
葡萄球菌廣泛分布于自然界及人體與動物皮膚黏膜表面，是最常見的化膿性球菌，常引起各種化膿性感染、敗血癥和泌尿道感染等，是醫院感染和社區獲得性感染的重要病原菌之一。葡萄球菌屬至少包含39個已知種，其中11種又可以分為兩個或更多的亞種，目前發現的種類已超過了 50種。葡萄球菌屬的細菌是一類球形菌，革蘭氏染色反應呈陽性。關于葡萄球菌引起魚類疾病未見報道，許多報道發現葡萄球菌屬的細菌為一些魚類 腸道細菌的優勢菌群。趙慶新發現團頭魴腸道菌群中有葡萄球菌屬細菌的存在，有研究發現草魚腸道中的優勢菌群為葡萄球菌屬細菌；孫云章等報道稚魚消化道的優勢菌有葡萄球菌等。魚腸道正常菌群是腸道的重要組成部分，對魚本身沒有致病性，但對其他生物有可能有致病性。由于葡萄球菌有極高的相似性(90% 99%)，用16S rDNA不能將其在種的水平上準確鑒定，以往人們使用hsp60, sodA, rpoB, tuf等保守基因對葡萄球菌進行種間判定。葡萄球菌gap基因編碼甘油醒-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase),是一種管家基因,研究表明，該基因至少可以在12株葡萄球菌亞種檢測至IJ。Yugueros等人采用雜交的方法，用279bpDNA片段檢測在所有PCR-gap陽性基因，結果均呈陽性；應用該引物擴增其他菌種，結果都沒有出現目的條帶。產色葡萄球菌是一類不運動，不產生孢子的革蘭氏陽性菌，在環境中廣泛存在，并且表現出很強的適應性與異質性，是人與動物的機會致病菌，與豬的滲出性皮炎、膿毒性多關節炎及奶牛的乳腺炎有關。迄今為止，針對淡水魚類及其水產品中產色葡萄球菌的快速檢測方法，國內外尚未見文獻報道和發明專利
發明內容

本發明的目的是為了能快速檢測淡水魚類腸道及其水產品中的產色葡萄球菌，提供一種產色葡萄球菌gap基因序列及其引物的獲取方法，從已知序列基因的保守序列引物來對gap基因進行PCR檢測的方法。主要內容為采取平板劃線和稀釋涂布相結合的方法對淡水魚腸道細菌在甘露醇高鹽瓊脂(MSA)培養基上進行分離篩選，獲得I株菌株，通過專用培養基培養后進行形態學觀察、生理生化特征和基因序列分子鑒定等系統研究，確定該菌株為產色葡萄球菌；通過培養提取該株菌的基因組DNA后，根據該保守序列進行BLAST核苷酸序列比對，參照葡萄球菌屬保守序列設計的用于擴增gap基因片段的特異性，利用引物設計軟件primer5. 0設計引物；將設計好的引物送交公司合成，利用PCR技術擴增產色葡萄球菌的基因組gap序列，篩選的這對引物獲得了用于檢測該菌PCR擴增片段大小為931bp的引物，引物序列為正向 gap-F (5 ’ -3 ’) ATGGTTTTGGTAGAATTGGTCGTTTA，反向 gap-R(5’ -3’) GACATTTCGTTATCATACCAAGCTG。本發明是以如下技術方案實現的一種產色葡萄球菌gap基因序列的獲取方法，其特征是采取平板劃線和稀釋涂布相結合的方法對淡水魚腸道細菌在甘露醇高鹽瓊脂(MSA)培養基上進行分離篩選，獲得I株菌株，通過形態學觀察、生理生化特征和基因序列分子鑒定等系統研究，確定該菌株為產色葡萄球菌。一種產色葡萄球菌gap基因序列的PCR特異引物設計方法，其特征是通過BLAST核苷酸序列比對，找到該物種需要檢測的目的基因的保守序列；根據該保守序列，設計用于擴增gap基因片段的特異性引物，用引物設計軟件primerf.O設計引物；將引物再通過核苷酸序列比對，確保引物3’端的高度保守性；具體步驟如下 (1)產色葡萄球菌的引物篩選將設計好的引物送交生工生物工程(上海)有限公司合成，對獲得的引物利用PCR技術擴增產色葡萄球菌的基因組DNA，檢測各對引物是否可用，即能否擴增出清晰、單一、有規則的條帶，在篩選的這些引物中，獲得了用于檢測該菌PCR擴增片段大小為931bp的引物，gap基因編碼氨基酸序列310aa，引物序列為正向 gap-F (5，-3，) ATGGTTTTGGTAGAATTGGTCGTTTA，反向 gap-R (5，-3，):GACATTTCGTTATCATACCAAGCTG ；
(2)產色葡萄球菌的PCR擴增條件優化對獲得的該屬分離菌株的gap基因專用引物進行PCR條件優化，獲得最佳的PCR擴增體系和擴增條件如下最佳的PCR擴增體系為25 yl，包含 2. 5 ii I IOX Reaction Buffer (with Mg2+) ,0. 5u I dNTP (包括 dATP、dITP、dCTP、dGTP，各2. 5mM)，正反向引物(10剛)各0. 5iU，Taq酶0. 3 yl，提取的細菌基因組DNA模板
2.OiU，用滅菌雙蒸水ddH20 17. 2 u I補足25iU總體積；最佳的PCR反應條件為94°C預變性5min ；94°C變性30s，52°C退火50s，72°C延伸45s，30個循環后72°C再次延伸IOmin,PCR產物4°C保存備用；
(3)產色葡萄球菌的分子測序鑒定采用10g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，切下目的帶，膠回收試劑盒回收，回收產物克隆后，挑選陽性克隆送上海生工測序；測序后利用BLAST和ClustalX程序進行序列比對分析,并用Neighbor-joining方法構建系統發育樹表明該菌株與產色葡萄球菌(Ste/成cAroffiogefles)模式菌株(CCM 3387)同源性為98. 82%，由此鑒定該菌為產色葡萄球菌。本發明通過PCR擴增技術篩選出葡萄球菌屬的專用引物，建立一個適合于檢測淡水魚源產色葡萄球菌分子檢測技術，更具有如下優點
I、成本底，實驗操作安全、可靠。該菌株是采取平板劃線和稀釋涂布相結合的方法從淡水魚腸道細菌分離篩選，并通過專用培養基培養后獲得，在一般的微生物實驗室都可以進行；對菌株進行分子鑒定時，采用普通PCR方法，使用常規的試劑和儀器，不需要探針和構建基因文庫，所以避免使用同位素污染。2、技術簡單可行。本發明充分利用生物信息學提供的已有信息，通過BLAST核苷酸序列比對，找到該物種需要檢測的目的基因的保守序列；根據該保守序列，設計用于擴增gap基因片段的特異性引物，用引物設計軟件primerf.O設計引物；將引物再通過核苷酸序列比對，確保引物3’端的高度保守性。3、快速、準確、可靠。與傳統檢測方法相比，避免了與基因組進行大規模測序，節省了大量的時間和財力，只要找到基因的保守序列，就可以對任何物種的該基因進行跨物種PCR檢測；同時本發明引物特異性強，使得擴增特異性和效率大大增強。


下面結合附圖及實施例對本發明作進一步詳細說明。圖I為本發明gap基因PCR產物電泳圖片。圖I 中M 為 DL-2000 DNA marker, gap 片段長度為 931bp。
具體實施例方式本發明可以通過以下幾個操作步驟實現
I、產色葡萄球菌的分離培養
將淡水魚體表用75%的酒精消毒，無菌操作取其腸道中部，置于盛有IOmL的無菌生理鹽水的離心管中，剪碎混勻，取適量均勻涂布于甘露醇高鹽瓊脂培養基上，保持培養基內的溫度為恒溫37°C，培養18-24h ;挑選典型菌落轉種到新的甘露醇高鹽瓊脂培養基平皿上，反復傳代2-3次，篩選出目的菌接種到斜面備用；菌落在平皿上生長成為形態單一的菌落，菌落特征表現為圓形凸起，邊緣整齊，表面光滑，濕潤，不透明的菌落，顯微鏡形態觀察該菌呈現葡萄串狀球菌；所述的甘露醇高鹽瓊脂培養基的成分及制備方法為(g/L):蛋白胨10.0，牛肉粉1.0，D-甘露醇10.0，氯化鈉100. 0，酚紅0.025，瓊脂13.0，pH值7.4±0.2 ;制備時稱取本品109. Og,加入IOOOml蒸懼水中，121°C高壓滅菌15 min,冷至45-50°C左右時，傾入無菌平皿。2、產色葡萄球菌的生理生化鑒定
對已培養好的該菌株進行4項生理生化特性鑒定后，表明該菌株氧化酶陰性，過氧化氫酶陽性，不能運動，硝酸鹽還原陽性，查閱《伯杰氏系統細菌學手冊》，該菌株的形態學特征和各項生理生化檢測結果基本符合葡萄球菌屬特性,初步確定為葡萄球菌屬。一種產色葡萄球菌gap基因序列的PCR特異引物設計方法，其特征是通過BLAST核苷酸序列比對，找到該物種需要檢測的目的基因的保守序列；根據該保守序列，設計用于擴增gap基因片段的特異性引物，用引物設計軟件primerf.O設計引物；將引物再通過核苷酸序列比對，確保引物3’端的高度保守性；具體步驟如下
(1)產色葡萄球菌的引物篩選將設計好的引物送交生工生物工程(上海)有限公司合成，對獲得的引物利用PCR技術擴增產色葡萄球菌的基因組DNA，檢測各對引物是否可用，即能否擴增出清晰、單一、有規則的條帶，在篩選的這些引物中，獲得了用于檢測該菌PCR擴增片段大小為931bp的引物，gap基因推測編碼氨基酸序列310aa，引物序列為正向 gap-F (5，-3，) ATGGTTTTGGTAGAATTGGTCGTTTA，反向 gap-R (5，-3，):GACATTTCGTTATCATACCAAGCTG ；
(2)產色葡萄球菌的PCR擴增條件優化對獲得的該屬分離菌株的gap基因專用引物進行PCR條件優化，獲得最佳的PCR擴增體系和擴增條件如下最佳的PCR擴增體系為25 yl，包含 2. 5 ii I IOXReaction Buffer (with Mg2+), 0. 5 u I dNTP (包括 dATP、dITP、dCTP、dGTP，各2. 5mM )，正反向引物(10剛)各0. 5 yl，Taq酶0. 3 yl，提取的細菌基因組DNA模板 2.OiU，用滅菌雙蒸水ddH20 17. 2 u I補足25iU總體積；最佳的PCR反應條件為94°C預變性5min，94°C變性30s，52°C退火50s，72°C延伸45s，30個循環后72°C再次延伸IOmin,PCR產物4°C保存備用；
(3)產色葡萄球菌的分子測序鑒定采用10g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，切下目 的帶，膠回收試劑盒回收，回收產物克隆后，挑選陽性克隆送上海生工測序；測序后利用BLAST和ClustalX程序進行序列比對分析,并用Neighbor-joining方法構建系統發育樹表明該菌株與產色葡萄球菌(5模式菌株(CCM 3387)同源性為98. 82%，由此鑒
定該菌為產色葡萄球菌。
權利要求
1.一種產色葡萄球菌gap基因序列的獲取方法，其特征是采取平板劃線和稀釋涂布相結合的方法對淡水魚腸道細菌在甘露醇高鹽瓊脂(MSA)培養基上進行分離篩選，獲得I株菌株，通過形態學觀察、生理生化特征和基因序列分子鑒定等系統研究，確定該菌株為產色葡萄球菌。
2.—種產色葡萄球菌gap基因序列的PCR特異引物設計方法，其特征是通過BLAST核苷酸序列比對，找到該物種需要檢測的目的基因的保守序列；根據該保守序列，設計用于擴增gap基因片段的特異性引物，用引物設計軟件primerf. O設計引物；將引物再通過核苷酸序列比對，確保引物3’端的高度保守性；具體步驟如下 (1)產色葡萄球菌的引物篩選將設計好的引物送交生工生物工程(上海)有限公司合成，對獲得的引物利用PCR技術擴增產色葡萄球菌的基因組DNA，檢測各對引物是否可用，即能否擴增出清晰、單一、有規則的條帶，在篩選的這些引物中，獲得了用于檢測該菌PCR擴增片段大小為931bp的引物，gap基因編碼氨基酸序列310aa，引物序列為正向 gap-F (5，-3，) ATGGTTTTGGTAGAATTGGTCGTTTA，反向 gap-R (5，-3，):GACATTTCGTTATCATACCAAGCTG ； (2)產色葡萄球菌的PCR擴增條件優化對獲得的該屬分離菌株的gap基因專用引物進行PCR條件優化，獲得最佳的PCR擴增體系和擴增條件如下最佳的PCR擴增體系為25 yl，包含 2. 5 ii I IOX Reaction Buffer (with Mg2+) ,0. 5u I dNTP (包括 dATP、dITP、dCTP、dGTP，各2. 5禮)，正反向引物(10剛)各0.5111，1&9酶0. 3 yl，提取的細菌基因組DNA模板2. OiU，用滅菌雙蒸水ddH20 17. 2 u I補足25iU總體積；最佳的PCR反應條件為94°C預變性5min，94°C變性30s，52°C退火50s，72°C延伸45s，30個循環后72°C再次延伸IOmin,PCR產物4°C保存備用； (3)產色葡萄球菌的分子測序鑒定采用10g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，切下目的帶，膠回收試劑盒回收，回收產物克隆后，挑選陽性克隆送上海生工測序；測序后利用BLAST和ClustalX程序進行序列比對分析,并用Neighbor-joining方法構建系統發育樹表明該菌株與產色葡萄球菌(Ste/成cAroffiogefles)模式菌株(CCM 3387)同源性為·98. 82%，由此鑒定該菌為產色葡萄球菌。
全文摘要
本發明涉及一種基因序列，具體涉及一種產色葡萄球菌gap基因序列及其引物的獲取方法，它采取平板劃線和稀釋涂布相結合的方法對淡水魚腸道細菌在甘露醇高鹽瓊脂(MSA)培養基上進行分離篩選，獲得1株菌株，通過專用培養基培養后進行形態學觀察、生理生化特征和基因序列分子鑒定等系統研究，確定該菌株為產色葡萄球菌；通過培養提取該株菌的基因組DNA后，根據該保守序列進行BLAST核苷酸序列比對，參照葡萄球菌屬保守序列設計的用于擴增gap基因片段的特異性，利用PCR技術擴增產色葡萄球菌的基因組gap序列，篩選的這對引物獲得了用于檢測該菌PCR擴增片段大小為931bp的引物，引物序列為正向gap-F(5’-3’):ATGGTTTTGGTAGAATTGGTCGTTTA，反向gap-R(5’-3’):GACATTTCGTTATCATACCAAGCTG。
文檔編號C12R1/44GK102703592SQ20121018826
公開日2012年10月3日 申請日期2012年6月9日 優先權日2012年6月9日
發明者呂愛軍, 王藝, 胡秀彩 申請人:江蘇師范大學