專利名稱：棉大卷葉螟吐絲基因片段及其克隆方法和應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域，具體涉及棉大卷葉螟絲素輕鏈蛋白基因的核苷酸序列和氨基酸序列，并涉及該基因的用途。
背景技術：
棉大卷葉螟(Sylepta derogata Fabricius)是一種分布極廣且寄主廣泛的多食性害蟲。屬鱗翅目螟蛾科，曾是棉田中重要的食葉性害蟲，大發生時，卷食棉葉，影響棉花的結鈴和最終產量。由于有機磷殺蟲劑的大量使用，該蟲的為害漸輕。但近些年隨著轉基因棉花的大面積種植，化學殺蟲劑用量的大幅度下降等原因，棉大卷葉螟在一些棉田的種群數量呈現上升趨勢，為害日漸嚴重，甚至造成整株葉片卷曲或被食光，棉株僅留下枝、莖，嚴重影響棉花的現蕾開花及最后的產量，成為近幾年我國長江中下游棉區棉花上較為重要的食葉性害蟲。
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棉大卷葉螟在5月上、中旬平均氣溫達20°C時開始化蛹羽化。一、二代主要在木槿、苘麻等植物上繁殖為害，第三代開始遷移到棉田。8月中旬至9月下旬是棉大卷葉螟為害棉田的盛期，也是棉花受害最嚴重的時期。棉大卷葉螟具有很強的繁殖能力，每頭雌蛾平均產卵180 260粒，最高達400粒，卵大多數散產于棉葉背面，以葉脈邊緣分布較多。幼蟲多在下午及夜間孵化，幼蟲歷期約為25天，初孵幼蟲喜歡群集在葉片背面取食葉肉，留下表皮；進入2、3齡以后開始分散吐絲，將棉葉卷成喇叭狀，并躲藏于卷葉內取食。大發生時，一張棉葉可被卷成2 3個喇叭筒，一般一個卷筒內僅有I頭幼蟲，且喜轉移危害。在食源充足時棉大卷葉螟幼蟲常不食光被卷的葉片即轉移，食源匱乏或蟲量較大時整株葉片被卷曲，大發生時葉片可被全部食光。由于棉大卷葉螟有吐絲卷葉為害的特性，普通農藥對棉大卷葉螟的防治效果不甚理想，使得棉大卷葉螟的為害逐年加重。因此，能克隆到與卷葉螟吐絲相關的基因序列，對棉大卷葉螟的防治有重要的現實意義。

發明內容
本發明的目的在于闡明了昆蟲絲腺泌絲因子的一種基因序列、氨基酸序列。本發明根據以往報道的外米綴蛾和大蠟螟輕鏈基因序列，設計引物，采用同源基因克隆策略和PCR技術，擴增中間片段，再根據測序結果，設計3’和5’引物，使用RACE法，分別擴增出3’和5’區段，測定序列后拼接成完整的基因序列，再使用ORF Finder分析得到棉大卷葉螟絲素蛋白基因輕鏈基因部分的開放閱讀框。本發明所述的棉大卷葉螟絲素輕鏈基因序列如SEQ ID NO. I所示；該基因cDNA全長1087bp，自46bp至849bp區段為其開放閱讀框，編碼267個氨基酸(SEQ ID NO. 2)，5，非編碼區長45個堿基，3’非編碼區長238個氨基酸，有多聚核苷酸尾巴。由上述基因碼蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。所述的棉大卷葉螟絲腺中的輕鏈基因序列,可在減輕棉大卷葉螟的吐絲卷葉危害中得到應用。所述的棉大卷葉螟絲腺中的輕鏈基因序列，可在靶標作物中導入該基因，作為轉
基因素材。所述的棉大卷葉螟絲腺中的輕鏈基因序列，可作為其它眾多農林吐絲害蟲目的基因的參考。


圖I是中間產物PCR檢測結果；圖2是中間片段膠回收結果；圖3是菌液PCR檢測結果； 圖4是3 ’ RacePCR檢測結果；圖5是3’ Race膠回收結果；圖6是3 ’ Race菌液PCR檢測結果；圖7是5 ’ RacePCR檢測結果；圖8是5’ Race膠回收結果；圖9是5 ’ Race菌液PCR檢測結果；圖10是RT-PCR擴增結果；圖11是酶切后結果的檢測；圖12 是 CTE927-1 表達 SDS-PAGE 圖像；圖13 是 CTE927-1SDS-PAGE 圖像；圖14 是 CTE927-1 轉膜后 SDS-PAGE 圖；圖15 是 CTE927-1PVDF 膜圖像。圖I — 9中M為DL2000DNA分子量標準。
具體實施例方式實施例一l、Total RNA 的提取RNA的提取使用的是Promega公司的SV Total RNA Isolation System試劑盒,具體方法如下I)在一個無菌小離心管中加入ImL的RNA Lysis Buffer (加BME)。2)取越冬老熟棉大卷葉螟幼蟲，放入裝有液氮的研缽中，用研棒迅速研磨，研磨成白色粉末，等液氮揮發完后，立即把粉末轉移到裝有300 ii L的RNA Lysis Buffer的離心管中，顛倒幾次，徹底混勻。3)向 300 ii L 裂解物中加入 350 y L 的 RNA Dilution Buffer (藍色)，顛倒 3 — 4次混合。70°C，金屬浴2. 5分鐘。4) 12000rpm 離心 10 分鐘。5)準備一個新的免RNA酶的離心管，用移液槍將離心好的澄清裂解液移到新的離心管中，避免吸到沉淀。6)向澄清裂解液中加入200 u L 95%乙醇，用移液槍吸放3_4次以混合。將此混合液轉移到離心柱裝配體中。12000rpm離心I分鐘。7)從離心柱裝配體上拿下離心柱，棄去收集管中液體，將離心管柱裝回收集管。加A 600 Ii L RNA Wash Solution于離心柱裝配體，12000rpm離心I分鐘。8)在無菌離心管中按順序混合 40 U L Yellow Core Buffer, 5 U L0. 09M MnCl2,5 U LDNase I，像前次一樣清空收集管，然后再裝配體中加入50 y L配好的孵育液。9)于 20_25°C孵育 15 分鐘。然后，向離心柱中加入 200ii L DNase Stop Solution,12000rpm離心I分鐘。10)加入 600 u L RNA Wash Solution, 12000rpm 離心 I 分鐘。11)清空收集管，向離心柱內加入250 ii L RNA Wash Solution于離心柱裝配體.12000rpm離心2分鐘。12)為每一個樣品從袋中取出一個I. 5mL帶蓋洗脫管，從離心柱上扭掉蓋子，放入I. 5mL帶蓋洗脫管中，向膜上加入50 ii L無核酸酶水。12000rpm離心I分鐘。13)將離心柱轉移到新的I. 5mL帶蓋洗脫管，向膜上加上50 y L無核酸酶水再洗一次。12000rpm離心I分鐘。14)用分光光度計檢測并進行電泳檢測合格后，提取的Total RNA樣品在_70°C低
溫保存。2、RNA的反轉錄RNA 的反轉錄使用的是 TaKaRa 公司的 PrimeScript II 1st StrandcDNASynthesis Kit試劑盒,具體方法如下
I)在Microtube中配制下列混合液
Oligo tlT Primer C50|iM) I ^iLdNTP Mixture (I OmM each) ITotal RNA2
RNase free dH206 pL2) 65°C保溫5min后置于冰上急冷(此處理可使模板RNA變性，提高反轉錄效率)3)在上述Microtube管中配制下列反轉錄反應液
Jl述變性、退火后反應液IOnL
5 X PrimeScript Buffer4 pL
RNase Inhibitor (40U/J1L)O.SuL
PrimeScript II RTase (200U/|iL) IpL RNase Free dH204.5 pL4)緩慢混勻5)按下列條件進行反轉錄反應42 0C 60min70 °C 15min
6)取出所得的cDNA樣品，冰上迅速冷卻，_20°C保存，以備使用。3、引物的設計利用BLAST分析NCBI上已經登錄的外米綴蛾(Corcyra cephalonica)和大臘螟(Galleria mellonella)輕鏈基因的保守區域，設計簡并引物，Fib_L_Fl:5’ -AATGCTGCCCTTCGTTTT-3’(SEQIDN0. 6)，Fib-L-Rl: 5，-CACCWACGTTGTTACTGCG-3’ (SEQ ID NO. 7)用于擴增輕鏈的核心區域。4、基因中間片段的擴增基因中間片段擴增的反應體系為25y L :
cDNA (山笫.—JJ/所得)2,0|iL
IOpM I:游*jI物 Fib-L-Fl1.25|iL
IOpM I、'游丨物 Fib-L-Rl1,2.%L
2.5mM dNTP2 pL
IOxPCR Buffer Mg2' plus4.5pL
Taq 酶0.2pL
ddHiO13.8|iL將反應液混勻，放入PCR儀進行擴增，擴增參數為94°C預變性5min ;94°C變性30sec，根據引物確定各組引物的退火溫度，退火30sec，72°C延伸2min，設定30個循環；最后72°C延伸IOmin0PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果如圖I所示。5、膠回收切出的目的DNA片段放入I. 5mL的Microtube中，加入600 ii L的DR- I Buffer(Img凝膠視為I y L)，65°C加熱使膠塊完全融化，再加入DR- I Buffer量的1/2體積量的DR- II Buffer,均勻混合，離心，最后洗脫DNA，回收產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果如圖2所示。。6、體外連接和轉化在Microtube中配制下列混合液回收產物 4. 5 ii L連接載體pMD18-T0. 5u LSolution I5 U L混合液用槍頭打勻后置于4°C冰箱中，反應4h后進行轉化，轉化產物均勻打在培養基平板上，37 °C培養箱過夜培養。7、菌落篩選和測序挑取單克隆，在LB液體培養基中過夜培養后，經菌液PCR檢測后含有特異目的基因的陽性克隆菌液，結果如圖3所示，樣品送檢測。8、序列分析利用DNAMAN和Primer5. 0對測序所得的中間片段序列進行分析，得到中間片段的序列 SEQ IDN0. 3 為
9、RACE法獲取基因的3’和5’末端9. 13’和5’端引物的設計3’端上游特異性引物直接使用中間片段的前引物Fib-L-Fl 5’ -AATGCTGCCCTTCGTTTT-3’ (SEQ ID NO. 6)，5’端則重新設計了兩條下游特異性引物，夕卜側特異性引物 Fib-R-O :5’-GGCGACTTGAGCGATGAGG-3’ (SEQ ID NO. 8)，內側特異性引物 Fib-R-I:5’ -TGGTCACCTCCATCTACGG-3’ (SEQ ID NO. 9)。9. 2RACE 法獲取 3’ 端3’端的獲得是通過TAKARA的3’ -Fu LI RACE Core Set Ver. 2. 0試劑盒所獲得的，具體方法如下I)以第I步所得的棉大卷葉螟Total RNA為模板，使用3’RACE Adaptor引物(含有由TaKaRa獨特設計的dT區域及Adaptor Primer部分)進行反轉錄反應,合成1st StrandcDNA。反應體系
權利要求
1.棉大卷葉螟絲素輕鏈基因，其特征在于，它的序列如SEQID NO. I所示。
2.一種棉大卷葉螟絲素蛋白，其特征在于它的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
3.權利要求I所述的棉大卷葉螟絲素輕鏈基因在調控棉大卷葉螟的吐絲卷葉危害中的應用。
4.權利要求I所述的棉大卷葉螟絲素輕鏈基因在制備轉基因作物中的應用。
5.權利要求I所述的棉大卷葉螟絲素輕鏈基因在克隆其它農林吐絲昆蟲同源基因中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種調控鱗翅目昆蟲——棉大卷葉螟(Syleptaderogata)的吐絲基因片段序列及用途。根據已報道的外米綴蛾(Corcyracephalonica)和大蠟螟(Galleriamellonella)絲素輕鏈基因序列，設計引物，通過RACE法，擴增出目的基因片段。該基因片段cDNA全長1087bp，自46bp至849bp區段為其開放閱讀框，編碼267個氨基酸。5’非編碼區長45個堿基，3’非編碼區長238個堿基。該基因片段對棉大卷葉螟的吐絲有重大影響，它的成功克隆及基因序列的測定為今后進一步研究與控制卷葉螟的吐絲卷葉為害奠定了重要基礎。
文檔編號C12N15/12GK102719442SQ20121023178
公開日2012年10月10日 申請日期2012年7月5日 優先權日2012年7月5日
發明者周勇, 楊益眾, 梁國華, 王中陽, 蘇宏華, 陳小軍, 陳春霞 申請人:揚州大學