新穎乳發酵產物及其用途
【專利摘要】本發明揭示了一種新穎乳發酵產物，其組成至少包含一個勝肽群，其中，該勝肽群為圖11至圖18中的任一圖中標號1至7所組成的勝肽群。該新穎乳發酵產物用以于生物體上提供降低骨質流失的效果，而可應用于食品、營養補充品及醫藥制品，以達到預防或治療骨質疏松癥以及補充骨質所需營養的功效。
【專利說明】新穎乳發酵產物及其用途
【技術領域】
[0001]本發明與具生物活性的勝肽有關，特別指一種新穎乳發酵產物及其用途。
【背景技術】
[0002]按，全球人口結構已逐步邁向高齡化的社會，銀發族除了面對癌癥、腦中風、心肌梗塞等疾病的威脅外，骨質疏松癥(osteoporosis)也逐漸受到重視。詳言之，人體的骨骼質量自出生后逐漸增加，直到三十歲前為最高峰，爾后則逐年下降，尤其停經后的婦女因大幅減少可促骨質生成的荷爾蒙雌激素，骨質流失速率更快。而患有骨質疏松癥者，骨骼變得松脆，很容易發生骨骼碎裂等情形，尤其是老年人跌倒時容易引起大腿骨、頸部骨折，造成從此臥床或經常性腰痛，并且骨骼碎裂極難治愈。根據統計，臺灣地區因骨質疏松癥而發生骨折的機率，約為腦中風的2至4倍。估計到2050年，全世界因骨質疏松癥引起的骨折發生率將比現在增加六倍，其中以亞洲地區為最多。臺灣的健保局于2009的數據顯示，臺灣地區停經后婦女的骨質疏松癥發生率約為25%，而男性也無可幸免，至少每五位將有一位會罹患骨質疏松癥。再者，統計顯 示，約10-20%的髖骨骨折病人在第一年會死亡，幾乎和乳癌末期的死亡率相當。此外，骨質疏松癥患者有50%無法獨立生活，20-25%無法獨立行動，換言之，醫療體系及社會必須付出龐大的社會成本與醫療資源。因此，正視骨質疏松的預防保健，為刻不容緩的重要研究議題。
[0003]骨質疏松癥造成骨折的因素主要決定于骨密度，因此，治療的目標在于防堵骨質流失或補強已流失的骨質量。目前已有數種治療藥劑具有減緩骨質流失速度的效果，包含抑鈣素(calcitonin)、荷爾蒙療法(hormone therapy)和雙憐酸鹽藥物(bisphosphonate)等，其作用原理主要為降低骨骼吸收作用(bone resorption);另一類是「同化性」藥物,如以副甲狀腺素(簡稱PTH)刺激骨母細胞，加速骨質生成(Riggs and Melton, 1988)。此二類藥物主要用于治療已發生骨質疏松癥的患者，但，仍具有以下缺失，其一、對于年過三十骨質開始流失但未達骨質疏松標準者，則無法使用藥物；其二、服用雙磷酸鹽藥物會使患者產生顎骨壞死的副作用。而為了避免上述缺失，市面上亦推出眾多用以補充鈣質的營養品，目的在于防止骨質流失且補充骨骼鈣質，然營養補充品對于骨骼流失的控制并無實際效用，且無法有效地使人體吸收鈣質，難以補充骨骼鈣質。
[0004]近年來,天然物中生物活性肽(bioactive peptide)的研究發展快速,研究的結果已指出許多來自牛乳蛋白質的勝肽系具有生理活性，如抗高血壓(antihypertensive)、類嗎啡(opioid-like)、免疫調節(immunomodulating)、抗血栓(antithromobotic)、抗菌(antimicrobial)、與促進?丐質吸收(calcium-absorption enhancing)等(Zinn, 1998; Yamamoto, 1998; Shan，2000)。是以，若干研究皆致力于自天然物中獲得能夠具有改善骨質疏松癥的蛋白質，但，天然物中雖具有不同生理活性的勝肽，并不具有如化學合成藥物所產生的副作用，然，大部分的生物活性肽，包含ACE抑制肽、抗菌勝肽以及抗高血壓肽，都需要從原先的蛋白質被酵素水解成小片段的寡肽后，方能發揮其生理活性作用(Meisel，1999)，且發酵食品或非發酵食品經適當的酵素水解后可增進其功能性(Vermeirssen et al., 2003 ；Hernandez-Ledesma et al., 2004)。
[0005]據此，如何自天然物中獲得具有生理活性的小分子勝肽，使該勝肽于生物體發揮其生理活性作用而能夠確切地具有改善骨質疏松癥的癥狀，實為目前生醫藥學研究的重要課題。

【發明內容】
[0006]本發明的主要目的即在于提供一種新穎乳發酵產物，其組成至少包含一個勝肽群，其中，該勝肽群為圖11至圖18中的任一圖中標號I至7所組成的勝肽群。
[0007]更進一步而言，該新穎乳發酵產物是以動物乳經克弗爾(kefir)菌元或至少一個由克弗爾菌元所分離的菌株于預定發酵條件下進行發酵反應而得。
[0008]其中，該動物乳可取自牛、羊、綿羊、豬、馬等動物。
[0009]本發明的次一目的在于提供一種營養補充品，其成份至少包含一個勝肽群及一種預定營養成份，其中，該營養成份為一礦物元素，例如鈣離子，其中，該勝肽群為圖11至圖18中的任一圖中標號I至7所組成的勝肽群。
[0010]本發明的另一目的在于提供一種食品，如發酵乳制品，其成份至少包含一個勝肽群及一種食品成份，其中，該勝肽群為圖11至圖18中的任一圖中標號I至7所組成的勝肽群。
[0011]本發明的再一目的在于提供一種治療骨質疏松癥的醫藥組合物，其包含胡有效成份及醫藥上可接受的載體和/或賦形劑，而得以口服方式給予，其中，該有效成份為圖11至圖18中的任一圖中標號I至7所組成的勝肽群。
[0012]本發明的又一目的在于提供一種用以抑制骨質流失的醫藥組合物，其包含有有效成份及醫藥上可接受的載體和/或賦形劑，而得以口服方式給予，其中，該有效成份為圖11至圖18中的任一圖中標號I至7所組成的勝肽群。
[0013]該新穎乳發酵產物用以于生物體上提供降低骨質流失的效果，而可應用于食品、營養補充品及醫藥制品，以達到預防或治療骨質疏松癥以及補充骨質所需營養的功效。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]圖1為各組小鼠分別飼養不同周數的體重變化圖。
[0015]圖2A為第一組小鼠的膝蓋端生長板橫向截面μ -CT掃描影像圖。
[0016]圖2Β為第二組小鼠的膝蓋端生長板橫向截面μ -CT掃描影像圖。
[0017]圖2C系為第三組小鼠的膝蓋端生長板橫向截面μ -CT掃描影像圖。
[0018]圖2D系為第四組小鼠的膝蓋端生長板橫向截面μ -CT掃描影像圖。
[0019]圖3Α為第一組小鼠的膝蓋端生長板μ -CT掃描3D影像圖。
[0020]圖3Β為第二組小鼠的膝蓋端生長板μ -CT掃描3D影像圖。
[0021]圖3C為第三組小鼠的膝蓋端生長板μ -CT掃描3D影像圖。
[0022]圖3D為第四組小鼠的膝蓋端生長板μ -CT掃描3D影像圖。
[0023]圖4Α為第一組小鼠的膝蓋端生長板縱向截面μ -CT掃描影像圖。
[0024]圖4Β為第二組小鼠的膝蓋端生長板縱向截面μ -CT掃描影像圖。
[0025]圖4C為第三組小鼠的膝蓋端生長板縱向截面μ -CT掃描影像圖。[0026]圖4D為第四組小鼠的膝蓋端生長板縱向截面μ -CT掃描影像圖。
[0027]圖5Α為圖4Α的局部放大圖。
[0028]圖5Β為圖4Β的局部放大圖。
[0029]圖5C為圖4C的局部放大圖。
[0030]圖為圖4D的局部放大圖。
[0031]圖6A為第一組小鼠的膝蓋端生長板縱向截面電子顯微鏡掃描影像圖。
[0032]圖6B為第二組小鼠的膝蓋端生長板縱向截面電子顯微鏡掃描影像圖。
[0033]圖6C為第三組小鼠的膝蓋端生長板縱向截面電子顯微鏡掃描影像圖。
[0034]圖6D為第四組小鼠的膝蓋端生長板縱向截面電子顯微鏡掃描影像圖。
[0035]圖7為各組小鼠的骨占組織體積的統計柱形圖。
[0036]圖8為各組小鼠的骨小梁骨礦物質密度的統計柱形圖。
[0037]圖9為各組小鼠的骨小梁數量的統計柱形圖。
[0038]圖10為各組小鼠的骨小梁分離度的統計柱形圖。
[0039]圖11為第一批次的發酵乳的HPLC層析圖。
[0040]圖12為第二批次的·發酵乳的HPLC層析圖。
[0041]圖13為第三批次的發酵乳的HPLC層析圖。
[0042]圖14為第四批次的發酵乳的HPLC層析圖。
[0043]圖15為第五批次的發酵乳的HPLC層析圖。
[0044]圖16為第六批次的發酵乳的HPLC層析圖。
[0045]圖17為第七批次的發酵乳的HPLC層析圖。
[0046]圖18為第八批次的發酵乳的HPLC層析圖。
[0047]圖19為蛋白質標準品的HPLC層析圖。
[0048]圖20A 為圖 11。
[0049]圖20B 為圖 19。
[0050]圖21為未經發酵的原料乳的HPLC層析圖。
[0051]圖22A 為圖 12。
[0052]圖22B 為圖 21。
[0053]圖23為經噴霧干燥處理的發酵乳的HPLC層析圖。
[0054]圖24A 為圖 23。
[0055]圖24B 為圖 12。
【具體實施方式】
[0056]本發明所揭示的一種新穎乳發酵產物，其由動物乳以克弗爾菌元或是由該克弗爾菌元所分離出的菌株經由發酵而產制成，組成至少包含一個勝肽群，其中，該勝肽群是圖11至圖18中的任一圖中標號I至7所組成的勝肽群。更進一步而言，經由發酵反應能有效地將該動物乳中的大分子蛋白質分解為如圖11至圖18中的任一圖中標號I至7所示的小片段勝肽群，并各該勝肽未被發現于未經發酵反應的動物乳中。
[0057]而由先前文獻(ZEYNEP B.⑶ZEL-SEYD.IM et al.2011)中可知，由克弗爾菌元所分離出的菌株包含有乳酸菌及酵母菌，其中，乳酸菌的菌屬更包含有乳酸桿菌屬(Lactobacillus),乳酸球菌屬(Lactococcus),鏈球菌屬(Streptococcus),明串球菌屬(Leuconostoc)及醋酸菌屬(Acetobacter);酵母菌的菌屬更包含有酵母真菌屬(Saccharomyces),假絲酵母屬(Candida),克魯維酵母菌屬(Kluyveromyces),伊薩酵母屬(Issatchenkia),畢赤氏酵母屬(Pichia)及球擬酵母屬(Torulopsis)。
[0058]再者，該新穎乳發酵產物于生物體中具有良好地改善骨質疏松癥、防止骨質流失、促進鈣質吸收等功效。[0059]因此，該新穎乳發酵產物得以直接應用于生物體中，亦得經由純化分離而可得到如圖11至圖18中的任一圖中標號I至7所示的勝肽群。該勝肽群得以作為一種食品的組成成份，如發酵乳制品；或該勝肽群得以搭配至少一種營養成份，作為營養補充品，如含有鈣離子的營養補充品；或將該勝肽群與至少一種醫藥上可接受的載體以傳統已知方法，制備成醫藥組合物，用以治療骨質疏松癥或是抑制骨質流失。
[0060]其中，該醫藥組合物可依據口服投予的需要而選擇適合的形式，如顆粒狀、丸型、錠劑、粉末、液體等。
[0061]以下，將藉由若干實施例搭配圖式更詳細地說明本發明。
[0062]實施例一:制備新穎乳發酵產物
[0063]取一定量的動物乳作為原料乳,并以一定量的克弗爾菌元(kefir grain)進行發酵反應，而產制出發酵乳，此即為本發明所揭示的新穎乳發酵產物。
[0064]實施例二:骨質疏松癥小鼠動物模式的試驗
[0065]本實施例采用復數只雌性C57BL/6J純品系的黑鼠，其購自臺大實驗動物中心。
[0066]將該小鼠于八周齡時分別以手術操作切除卵巢，用以作為模擬停經后的骨質疏松癥小鼠。再將該骨質疏松癥小鼠分為三組，并增加一組經手術處理但未切除卵巢的小鼠做為假手術對照組，而各該組小鼠皆以不同條件處理，其中，第一組為僅喂食水的假手術對照組；第二組為僅喂食水的骨質疏松癥小鼠；第三組為喂食該發酵乳的骨質疏松癥小鼠；第四組為喂食該發酵乳加鈣的骨質疏松癥小鼠。各該組小鼠分別生長至一定周齡后予以犧牲，而各組小鼠的每周體重變化如圖1所示。
[0067]實施例三:該發酵乳及其與鈣的組合物具有延緩骨質疏松的活性
[0068]將各組小鼠犧牲后，分別將第一組至第四組小鼠以高解析X-光微型計算機斷層掃描及電子顯微鏡分析各組小鼠的膝蓋端生長板骨小梁(Trabecular bone)。
[0069]各組小鼠的膝蓋端生長板橫向截面μ -CT掃描影像圖及μ _CT掃描3D影像圖分別如圖2及圖3所示，其中，圖2A及圖3A為第一組小鼠，圖2B及圖3B為第二組小鼠，圖2C及圖3C為第三組小鼠，圖2D及圖3D為第四組小鼠。
[0070]各組小鼠的膝蓋端生長板縱向截面μ -CT掃描影像圖及其局部放大μ _CT掃描影像圖分別如圖4及圖5所示，其中，圖4A及圖5A為第一組小鼠，圖4B及圖5B為第二組小鼠，圖4C及圖5C為第三組小鼠，圖4D及圖為第四組小鼠。
[0071]各組小鼠的膝蓋端生長板向縱向截面電子顯微鏡掃描影像圖如圖6所示，其中，圖6A為第一組小鼠，圖6B為第二組小鼠，圖6C為第三組小鼠，圖6D為第四組小鼠
[0072]更進一步以計算機軟件(CTAn)分析圖2至圖6，計算出各組小鼠的骨占組織體積比例、骨小梁礦物質密度(Bone Mineral Density ;BMD)、骨小梁數量(Trabecular Number,Tb.N)及骨小梁分離度(Trabecular Separation/Spacing, Tb.Sp),統計結果依序如圖7至圖10所示。
[0073]由圖2至圖6的比對可知，相較于第一組小鼠，僅喂食水的第二組小鼠的骨質結構明顯松散、骨小梁數量較少，而喂食該發酵乳的第三組小鼠及同時喂食鈣及該發酵乳的第四組小鼠的骨質結構皆與第一組小鼠無顯著差異。
[0074]而再分析圖7至圖10，更可清楚得知僅喂食水的第二組小鼠骨占組織比例、骨小梁礦物質密度及數量顯著降低，而骨小梁分離度提高，皆顯示出第二組小鼠的骨質嚴重流失、骨吸收增加、骨質結構松散；而相對于第二組小鼠，喂食該發酵乳的第三組小鼠及同時喂食該發酵乳及鈣的第四組小鼠不論骨占組織比例、骨小梁礦物質密度及數量皆顯著提升，并有效降低骨小梁分離度，而皆與第一組小鼠的各項數據無顯著差異。
[0075]因此，由該實例可知該發酵乳及其與鈣的組合物確實可以延緩骨質疏松、增加骨礦物質密度。
[0076]實施例四:分離純化該發酵乳
[0077]收集實施例 一中所制備的該發酵乳，分批取一定量以高效能液相層析系統(HPLC)將該發酵乳分離，其中，檢測波長為215nm，分離管柱為SEC管柱，充提液為IOOmM磷酸鹽緩沖液、IM 氯化鈉以及 ImM 乙二胺四乙酸(Ethylenediaminetetraacetic acid ;EDTA),酸喊值 6.5,流速為 0.5ml/min。
[0078]各批發酵乳的分離結果分別如圖11至圖18所示，比對各圖的結果，可知各批發酵乳經高效能液相層析系統分離后可得到圖中標號為I至7的勝肽群，換言之，可知圖11至圖18中任一圖標號I至7的勝肽群于該發酵乳中具有再現性。
[0079]實施例五:標號I至7的各該勝肽為小片段勝肽
[0080]請參閱圖19，其為一定量的蛋白質標準品以高效能液相層析系統，并依據實施例四中的分離條件進行分離所得的圖。
[0081]由于標號I至7的勝肽群于該發酵乳中皆有再現性，因此，于該實施例中僅取圖11為例而與該蛋白質標準品的HPLC圖譜比對。將圖11及圖19相比對的結果如圖20所示，其中，圖20A為圖11，圖20B為圖19。
[0082]由圖20可知該發酵乳中的標號為I至7的勝肽群的分子大小分別小于2kD，換言之，該發酵乳中標號為I至7的各該勝肽皆為小片段的勝肽。
[0083]實施例六:標號I至7小片段勝肽群具有抗骨質疏松癥的活性
[0084]請參閱圖21，其是取實施例一中一定量的未經發酵的該原料乳以高效能液相層析系統，并依據實施例四中的分離條件進行分離所得的圖。
[0085]由于標號I至7的勝肽群于該發酵乳具有再現性，因此，于本實施例中取圖12為例而與的該原料乳的HPLC圖譜相比對。將圖12及圖21相比對的結果如圖22所示，其中，圖22A為圖12，圖22B為圖21。
[0086]據此，由圖22可知未經發酵反應的該原料乳所分離出的蛋白質，相對于該發酵乳，大多屬于大分子，且并未出現如圖22A所示標號I至7的小片段勝肽群。
[0087]藉由實施例四至實施例六的結果可知該發酵乳中所包含的小片段勝肽群I至7為未發酵乳中所沒有，而該發酵乳具有顯著延緩骨質疏松及提升骨礦物質密度的能力，因此，圖11至圖18中任一圖中標號I至7所組成的勝肽群為具有抗骨質疏松癥活性的勝肽群。
[0088]實施例七:噴霧干燥處理的該發酵乳具有標號I至7所組成的勝肽群[0089]于本實施例中，將該發酵乳經噴霧干糙處理后，取一定量以高效能液相層析系統(HPLC)進行分離粉末狀的該發酵乳，其中，分離條件如同實施例四中所述，而得到HPLC圖譜，如圖23所示。
[0090]由于實施例二中各批次的該發酵乳中皆含有標號I至7的勝肽群，因此，僅取圖12為例而與圖23相比對，結果如圖14所示，其中，圖24A為圖23，圖24B為圖12。[0091]由圖24可知，即使將該發酵乳以噴霧干燥處理后，仍會具有標號為I至7的小片段勝肽群。換言之，該小片段勝肽群不會因為該發酵乳的處理方式而被破壞。
[0092]由上述各該實施例的說明，可知本發明所揭示的新穎乳發酵產物中至少包含有圖11至圖18中任一圖的標號I至7所組成的勝肽群，而該勝肽群分別為小片段而具有抗骨質疏松癥的活性，用以增加骨占組織比例、骨礦物質密度及數量、降低骨小梁分離率。再者，將該發酵乳添加鈣后，亦仍具有上述功效。
[0093]以上僅是藉由各該實施例詳細說明本發明，熟知該【技術領域】者于不脫離本發明精神下，而對于說明書中的實施例所做的任何簡單修改或是變化，均應為本案申請專利范圍所涵攝。
【權利要求】
1.一種新穎乳發酵產物，其組成至少包含一個勝肽群，其特征在于:該勝肽群選自于由圖11至圖18所組成的群的其中一圖內標號I至7所組成的勝肽群。
2.依據權利要求1所述新穎乳發酵產物，其特征在于:其由動物乳經由選自克弗爾菌元及至少一個自克弗爾菌元所分離的菌株所組成的群所發酵而得。
3.依據權利要求2所述新穎乳發酵產物，其特征在于:該動物乳來自于由牛、羊、綿羊、豬及馬所組成的群。
4.一種食品，其成份至少包含一個勝肽群及至少一種食物成份，其特征在于:該勝肽群選自于由圖11至圖18所組成的群的其中一圖內標號I至7所組成的勝肽群。
5.依據權利要求4所述的食品，其特征在于:為一種發酵乳制品。
6.一種營養補充品，其成份至少包含一個勝肽群及一種預定營養成份，其特征在于:該勝肽群選自于由圖11至圖18所組成的群的其中一圖內標號I至7所組成的勝肽群。
7.依據權利要求6所述營養補充品，其特征在于:該營養成份為鈣離子。
8.一種治療骨質疏松癥的醫藥組合物，其包含有效成份以及醫藥上可接受的載體和/或賦形劑，其特征在于:該有效成份選自由圖11至圖18所組成的群的其中一圖內標號I至7所組成的勝肽群。
9.一種用以抑制骨質流失的醫藥組合物，其包含有效成份以及醫藥上可接受的載體和/或賦形劑，其特征在于:該有效成份為選自由圖11至圖18所組成的群的其中一圖內標號1至7所組成的勝肽群。
【文檔編號】A23L1/30GK103566352SQ201210254328
【公開日】2014年2月12日 申請日期:2012年7月20日 優先權日:2012年7月20日
【發明者】陳全木, 陳小玲 申請人:李德財