本發明涉及的是一種微生物發酵工藝，尤其涉及的是一種利用瘤胃液生產維生素B12的稻草發酵培養基及其方法和應用。
背景技術：
瘤胃是反芻動物獨特的消化器官，瘤胃內營養豐富，溫度適宜，且瘤胃液中含有大量的微生物，因此反芻動物瘤胃是一個天然的發酵罐。瘤胃微生物對營養物質的分解和合成作用稱為瘤胃發酵，產物主要是氨基酸、NH3、揮發性脂肪酸、B族維生素等，瘤胃微生物依靠瘤胃內飼料的營養物質生存和繁殖，而反芻動物又依靠瘤胃微生物的發酵物進行生存。反芻動物與瘤胃微生物之間形成密切的共生關系，而瘤胃微生物相互之間相互制約，維持著微生物區系生態系統的協調(司振書,江成,瘤胃微生物對纖維素的降解及其應用,微生物學雜志,2003)。瘤胃微生物主要有厭氧細菌、原蟲、真菌等。通過微生物純培養，可以分離得到純種菌株，并可以獲得其生長代謝的詳細資料，然而純培養并沒有考慮微生物群居生活方式及相互影響的重要性。一般而言，降解有機物質，尤其是植物細胞壁成分，如纖維素，需要微生物間的相互作用，其降解過程是由高度分化的專性微生物群對底物協同降解的過程。菌種之間的協同作用和相互依賴程度并不相同，它們可以從極簡單的養分的交差，如維生素、碳源和能源到極特殊的完全依賴，電子傳遞就是瘤胃微生物相互作用的典型例子。
維生素B12又稱為鈷胺素或氰鈷素，是一種由含鈷的卟啉類化合物組成的B族維生素。自然界中的維生素B12都是由微生物合成的，高等動植物自身不能合成。維生素B12是幾種變位酶的輔酶，常以輔酶的形式參與多種代謝過程，促進蛋白質和核酸的合成，促進紅細胞的發育和成熟，促進脂肪、碳水化合物和蛋白質的代謝，維持神經系統功能的健全，臨床上可以用于預防和治療惡性貧血、末梢神經炎、脊髓炎等(王華等,維生素B12功能及營養作用研究,中國食物與營養,2007)。在飼料工業方面，大多數動物的植物性飼料中不含維生素B12，其生長發育所需的維生素B12，一方面來源于消化道中的微生物的合成，另一方面來源于外界的添加。豬、雞等非反芻動物缺乏維生素B12主要表現在生長發育停滯、貧血、繁殖率降低等。飼料維生素B12能預防懷孕母豬貧血，促進家禽家畜，特別是幼禽幼畜的生長發育，提高飼料蛋白的利用率，預防和治療由于維生素B12缺乏引起的非反芻動物的貧血和生長發育不良，缺鈷地區反芻動物的地方性消瘦病等。
目前在工業制造中，微生物發酵法是獲得微生素B12的主要途徑，且大部分產品被用于動物飼料添加劑。瘤胃微生物有很強的分解纖維素的能力(李莉,侯先志,瘤胃纖維素分解菌的研究進展,黃牛雜志,2002)，而且能合成維生素B12。植物秸稈資源豐富，目前不能被充分利用，不但造成資源浪費，還對環境造成一定的污染。目前，可利用植物秸稈等資源進行微生物發酵生產維生素等，將植物秸稈變廢為寶，實現廢物利用，具有重要的應用價值。但是，目前，利用植物秸稈生產維生素時，收率較低，而目前尚無利用植物秸稈定向生產維生素B12的方法。
技術實現要素：
本發明的目的在于克服現有技術的不足，提供了一種利用瘤胃液生產維生素B12的稻草發酵培養基及其方法和應用，以提供一種利用稻草等廢棄物定向生產維生素B12的方法，提高維生素B12的得率。
本發明是通過以下技術方案實現的：
本發明提供了一種利用瘤胃液生產維生素B12的稻草發酵培養基，所述稻草發酵培養基包括干稻草粉和營養鹽溶液，所述營養鹽溶液的配方包括：尿素為50g/L，ZnCl2·2H2O為0.25g/L，MnCl2·4H2O為0.04g/L，CoCl2·6H2O為0.5g/L，NH4HCO3為5g/L，NaHCO3為0.5g/L，Na2HPO4·12H2O為0.45g/L，KH2PO4為0.32g/L，MgSO4·7H2O為0.06g/L。
進一步地，每10L營養鹽溶液中，干稻草粉的添加量為6kg。
本發明提供了一種利用上述稻草發酵培養基生產維生素B12的方法，包括以下步驟：
(1)將稻草干燥后粉碎，獲得干稻草粉；
(2)按配方進行稱取，制備營養鹽溶液，所述配方包括：尿素為50g/L，ZnCl2·2H2O為0.25g/L，MnCl2·4H2O為0.04g/L，CoCl2·6H2O為0.5g/L，NH4HCO3為5g/L，NaHCO3為0.5g/L，Na2HPO4·12H2O為0.45g/L，KH2PO4為0.32g/L，MgSO4·7H2O為0.06g/L：
(3)將干稻草粉與營養鹽溶液混合，獲得稻草發酵培養基；
(4)取健康牛的瘤胃液，加入稻草發酵培養基中進行厭氧發酵，所述厭氧發酵的條件為：溫度為38-39℃，發酵時間為168h，即制備獲得富含維生素B12的發酵基。
進一步地，所述瘤胃液的制備方法，包括以下步驟：
Ⅰ)選擇1頭健康的皖北黃牛作為試驗動物，禁食24h，禁水12h，無菌法安裝瘺管并術后護理；
Ⅱ)每次飼喂前向安裝瘺管的皖北黃牛瘤胃取內容物，迅速攪拌并用四層紗布過濾，濾液保存于充滿二氧化碳的塑料瓶中，即得瘤胃液；此步操作要迅速，盡量減少瘤胃液與氧氣的接觸。
本發明還提供了一種飼料添加劑，所述飼料添加劑為利用上述稻草發酵培養基生產維生素B12的方法制備獲得的富含維生素B12的發酵產物，該飼料添加劑中不僅還有豐富的維生素B12還含有多種益生菌，將其直接添加在畜禽飼料中，可以作為生血劑，預防和治療畜禽貧血癥，也可以促進畜禽，特別是幼禽幼畜的生長發育，提高飼料蛋白的利用率，預防和治療由于維生素B12缺乏引起的非反芻動物的貧血和生長發育不良等。
本發明還提供了上述飼料添加劑在預防和治療畜禽貧血病中的應用。
本發明相比現有技術具有以下優點：本發明提供了一種利用瘤胃液生產維生素B12的稻草發酵培養基及其方法和應用，該發明利用反芻動物瘤胃的生理特點(即其中的微生物菌群能夠消化分解纖維素，轉化為能夠被宿主動物利用的糖類及維生素等物質),利用瘤胃液中的微生物菌群來發酵稻草粉，將其轉化為富含維生素B12的發酵飼料。與維生素B12的傳統生產相比，本發明生產的維生素B12不需要提純，可以在發酵飼料中直接使用，簡化了生產工藝。同時該發明將稻草秸稈轉化為可被動物直接利用的營養物質，原料來源廣泛，變廢為寶，降低了生產成本，保護了環境。
具體實施方式
下面對本發明的實施例作詳細說明，本實施例在以本發明技術方案為前提下進行實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，但本發明的保護范圍不限于下述的實施例。
實施例1
1、材料
本實施例所用方法如無特別說明均為本領域的技術人員所知曉的常規方法，所用的試劑等材料，如無特別說明，均為市售購買產品。
2、方法
2.1稻草粉的制備
將稻草干燥后，獲得干稻草，將干稻草粉碎，過40目篩，獲得稻草粉。
2.2營養鹽溶液的制備
分別稱取尿素500g，ZnCl2·2H2O為2.5g；MnCl2·4H2O為0.4g，CoCl2·6H2O為5.0g，NH4HCO3為50g，NaHCO3為5.0g,Na2HPO4·12H2O為4.45g，KH2PO4為3.2g MgSO4·7H2O為0.6g，溶于10L蒸餾水中，得營養鹽溶液。
2.3稻草發酵培養基的制備
稱取稻草粉6kg，與10L營養鹽溶液混合均勻，即得稻草發酵培養基。
2.4瘤胃液的制備
2.4.1選擇1頭健康的皖北黃牛作為試驗動物，禁食24h，禁水12h，無菌法安裝瘺管并術后護理；
2.4.2每次飼喂前向安裝瘺管的皖北黃牛瘤胃取內容物，迅速攪拌并用四層紗布過濾，濾液保存于充滿二氧化碳的塑料瓶中，即得瘤胃液；此步操作要迅速，盡量減少瘤胃液與氧氣的接觸。
2.5發酵反應
抽取1L瘤胃液，與8kg稻草發酵培養基一同加入到10L的厭氧發酵罐中，調節發酵溫度為38-39℃進行固體發酵，發酵168h后完成反應，獲得發酵基。
3結果檢測
3.1維生素B12的含量測定：
按照紫外-可見分光光度法進行測定，步驟包括：
3.1.1配置標準溶液：所述標準溶液維生素B12的含量為25μg/ml；
3.1.2配置樣品溶液：避光操作，精密稱取樣品0.02g，用少量的蒸餾水溶解，倒入500ml容量瓶，并定容至刻度線，搖勻，用0.45μm濾膜過濾。將空白液(純化水)與樣品液分別盛于1cm厚的石英比色皿中，用紫外-可見分光光度計測量其在361nm處的吸光值A樣，維生素B12的吸收系數按207計算，即得。
3.1.3計算：根據比爾定律，得出樣品的比吸光系數為：
E樣＝A樣/C樣*L＝A樣/0.0025
樣品中維生素B12的含量(質量百分比)為：
維生素B12的含量％＝E樣/E標×100％＝E樣/207×100％
3.2對照試驗
在上述步驟2方法的基礎上，以步驟2所述方法為實驗組，同時設置對照組，對照組中，用等體積的蒸餾水代替營養鹽溶液，其它條件同實驗組。
試驗設計如下表1所示：
表1：鹽溶液對瘤胃液發酵生產維生素B12的影響設計表
發酵168h后，對實驗組和對照組發酵產物分別取樣，測定其維生素B12的含量。測定結果顯示，實驗組維生素B12的含量為0.0321％，對照組維生素B12的含量為0.0084％。由測定結果可看出，本發明利用瘤胃液體外發酵稻草粉能產生大量的維生素B12，說明營養鹽溶液能顯著提高維生素B12的產量。
4、應用
將步驟2所述方法制備獲得的發酵產物按照每頓飼料中添加10-20g的量加入母豬飼料中，對10頭具有貧血癥的妊娠母豬進行飼喂，連續飼喂1個月后，檢測試驗母豬血液中血紅蛋白含量是否達到正常妊娠母豬血液中血紅蛋白水平。結果證明，該發酵產物作為母豬飼料添加劑，對妊娠母豬的貧血癥具有一定療效，10頭試驗母豬中，有9頭母豬的血液中血紅蛋白含量達到正常妊娠母豬血液中血紅蛋白水平，貧血癥得到緩解。
本發明的發酵產物中富含大量維生素B12(0.0321％)，可直接作為畜禽的飼料添加劑添加至飼料中，具有預防和治療由于維生素B12缺乏引起的非反芻動物的貧血和生長發育不良，及生血等作用，可直接用于預防和治療妊娠母豬貧血癥，也可促進家禽家畜，特別是幼禽幼畜的生長發育。本發明利用發酵技術將稻草秸稈轉化為可被動物直接利用的營養物質，產物不需要提純即可直接作為飼料添加劑使用，簡化了生產工藝，該發酵產物中還含有豐富的益生菌，營養價值豐富，可提高飼料蛋白的利用率。利用稻草發酵，原料來源廣泛，將稻草變廢為寶，降低了生產成本，保護了環境。
以上為本發明一種詳細的實施方式和具體的操作過程，是以發明技術方案為前提下進行實施，但本發明的保護范圍不限于上述的實施例。