專利名稱：一種提高馬鈴薯對卷葉病毒抗性的基因構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及基因的構(gòu)建方法，具體涉及一種提高馬鈴薯對卷葉病毒抗性的基因構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
馬鈴薯卷葉病毒(Potato leaf roll virus, PLRV)是馬鈴薯生產(chǎn)中危害最重的病毒之一,在世界各馬鈴薯產(chǎn)區(qū)均有分布。PLRV靠蚜蟲(主要是桃蚜(Myzus persicae))以持久、循環(huán)增殖型方式傳播。馬鈴薯感染PLRV后，正常的生理功能受到破壞，葉片呈現(xiàn)卷曲、黃化，葉質(zhì)厚而脆，枝條僵化，植株矮縮，塊莖網(wǎng)狀壞死，嚴(yán)重影響產(chǎn)量和品質(zhì)。為了提高馬鈴薯對卷葉病毒的抗性，生產(chǎn)上采取莖尖脫毒組織培養(yǎng)措施生產(chǎn)病毒含量很低的種薯，但成本高、環(huán)節(jié)多、工作量大，需要專門的脫毒組培設(shè)施，脫毒后的種薯在栽培過程中會受耕作措施及蚜蟲的侵染而重新感染病毒，種植兩三年后產(chǎn)量又會嚴(yán)重下降；而馬鈴薯為同·源四倍體作物，無性繁殖，以常規(guī)育種改良品種，過程復(fù)雜需時較長，利用基因工程培育抗病毒馬鈴薯是從根本上解決病毒侵染的有效途徑。隨著本領(lǐng)域技術(shù)的發(fā)展，人們把PLRV的基因轉(zhuǎn)入馬鈴薯，發(fā)現(xiàn)能提高抗病性，如張鶴齡(1995)、南相日(2007)分別將PLRV的外殼蛋白基因CP轉(zhuǎn)入馬鈴薯，Kaniewski等(1994)把PLRV的復(fù)制酶基因NIb轉(zhuǎn)入馬鈴薯，董江麗等(1999)把PLRV的基因間隔序列IS轉(zhuǎn)化馬鈴薯，都獲得了抗病性比非轉(zhuǎn)基因馬鈴薯提高的植株，但抗病株率較低，抗病水平也不高，難以用于生產(chǎn)。由于這些轉(zhuǎn)基因在馬鈴薯體內(nèi)轉(zhuǎn)錄的RNA是完整的，有可能與侵入馬鈴薯體內(nèi)的其它病毒的RNA發(fā)生同源重組或異源包裝，引發(fā)生物風(fēng)險。RNA干擾是近年來發(fā)現(xiàn)的生物對病毒的重大抗性機(jī)制。將病毒的某一序列設(shè)計成反向重復(fù)結(jié)構(gòu)，轉(zhuǎn)入植物體后，轉(zhuǎn)錄出的RNA會形成雙鏈結(jié)構(gòu)，被植物體內(nèi)的核酸酶切割成21-23nt的小干擾RNA。如果供體病毒侵染植物體,這些小干擾RNA就會介導(dǎo)病毒mRNA與之同源的部分降解，阻斷病毒的繁殖，賦予轉(zhuǎn)基因植株穩(wěn)定遺傳的抗病毒性狀。由于轉(zhuǎn)基因表達(dá)的mRNA會降解，也就規(guī)避了與入侵病毒發(fā)生同源重組的潛在風(fēng)險。RNA干擾已用于作物的抗病毒育種，但是，也有一些研究發(fā)現(xiàn)RNA干擾抗病效率不高甚至達(dá)不到抗病的效果。通過大量研究，人們發(fā)現(xiàn)RNA干擾的效率與形成的雙鏈RNA的長度和同源性有密切關(guān)系。Wesley等(2001)發(fā)現(xiàn)，雙鏈RNA的長度為400-800 bp時，基因沉默的效率最為穩(wěn)定。Helliwell等(2003)發(fā)現(xiàn)，50-1000 bp的基因片段均能誘發(fā)基因沉默，但基因片段越短，基因沉默的效率越低，并認(rèn)為片段長度為300-600 bp時是合適的，可以獲得最高的基因沉默效率。較長的雙鏈RNA可能誘發(fā)更高的沉默效率，但是在進(jìn)行基因體外操作時將給基因的轉(zhuǎn)化以及表達(dá)等產(chǎn)生不利的影響。RNA干擾效率也高度依賴于序列的同源性。植物病毒容易發(fā)生變異，形成不同的小種，因此選擇病毒基因組中最為保守的區(qū)域進(jìn)行基因沉默會提高抗病效率。也有研究表明，在同一載體中設(shè)計針對多個基因的靶位點的RNA干擾的途徑對艾滋病毒具有很好的抑制效果。PLRV病毒是單鏈正義RNA病毒，屬黃化病毒組iUiteovirus)，基因組全長6. O kb,中間有一段197 bp的非編碼區(qū)，也稱之為基因間隔區(qū)IS。IS將基因組分為5’和3’兩個編碼區(qū)。IS序列在PLRV基因組中比較保守，可能為PLRV亞基因組啟動子，控制其下游亞基因組的表達(dá)。IS的5’端連接復(fù)制酶基因Nib，3’端連接外殼蛋白基因CP。利用RNA干擾沉默PLRV病毒多個基因尚未見報道。本發(fā)明利用RT-PCR克隆PLRV病毒的一段序列，該序列包含復(fù)制酶基因3’端、基因間隔區(qū)和外殼蛋白基因5’端。將克隆是這段序列構(gòu)建成反向重復(fù)基因結(jié)構(gòu)，以PLRV病毒的復(fù)制酶基因、基因間隔區(qū)序列和外殼蛋白基因為靶位點進(jìn)行沉默，以期獲得多基因沉默的抗PLRV病毒的馬鈴薯，提高抗病效率。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是為了解決現(xiàn)有提高馬鈴薯抗卷葉病毒的方法中存在的問題，提供了一種提高馬鈴薯對卷葉病毒抗性的基因構(gòu)建方法。本發(fā)明是采用如下技術(shù)方案實現(xiàn)的· 一種提高馬鈴薯對卷葉病毒抗性的基因構(gòu)建方法，包括以下步驟
(1)從感染PLRV病毒的馬鈴薯植物體內(nèi)提取總RNA，通過RT-PCR擴(kuò)增和基因克隆工序得到PLRV病毒的一段序列NiblsCp，該序列包括復(fù)制酶基因NIB的3’端、基因間隔區(qū)IS和外殼蛋白基因CP的5’端，位于卷葉病毒基因組的第3422至3790個核苷酸之間；
(2)將序列NibISCp以正向和反向連接到一個內(nèi)含子的兩側(cè)，構(gòu)建成I個反向重復(fù)基因結(jié)構(gòu) RNAiNibIsCp ；
(3)反向重復(fù)基因結(jié)構(gòu)RNAiNibIsCp兩端分別連接啟動子和終止子。進(jìn)一步地，所述的RT-PCR擴(kuò)增，是取感染PLRV病毒的馬鈴薯塊莖的RNA2PL，再加入 ΙΟμΜ 的反向引物 2PL，10mM dNTP 2μ , ddH20 12μ , 65°C水浴 5min，冰浴 2min，再加Λ 5XRT 緩沖液 5μ , RNasin^L(5U)，M-MLRV 酶 μ (100U)，混勻后，42°C 60min，再 85°CIOmin,終止反應(yīng)。本發(fā)明所基于的理論基礎(chǔ)是把源自病毒的基因構(gòu)建成反向重復(fù)序列導(dǎo)入植物體，其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物會通過分子內(nèi)序列互補(bǔ)形成雙鏈RNA結(jié)構(gòu)，這些雙鏈RNA會被植物體內(nèi)的核酸酶切割成小干擾RNA，如果供體病毒侵入植物體，這些小干擾RNA會介導(dǎo)病毒mRNA中與其同源的部分降解，阻止了病毒的復(fù)制和擴(kuò)散，從而使轉(zhuǎn)基因植物獲得抗病性。將本發(fā)明構(gòu)建好的抗PLRV病毒的基因RNAiNibIsCp通過DNA重組技術(shù)連接到可在細(xì)菌細(xì)胞或植物細(xì)胞中自我復(fù)制的植物表達(dá)載體上，例如衍生于大腸桿菌的質(zhì)粒載體pUC18、pUC19，以及經(jīng)過不同的修飾而造成不同的多克隆位點的一系列通稱為pGEM的質(zhì)粒載體(由Promega公司生產(chǎn))和pBS_T載體(由天根公司生產(chǎn)),尤其是植物表達(dá)載體PCAMBIA3301、pBinl9、pROKII和pBI121系統(tǒng)等，在本發(fā)明的一系列優(yōu)選實施方案中，選用pBS-T、pCAMBIA3301等，后者特別適于作為制備植物表達(dá)載體的工具質(zhì)粒載體；然后將植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)入并整合到馬鈴薯基因組中，而抗病基因RNAiNibIsCp在馬鈴薯中的表達(dá)可賦予該植物對PLRV病毒的抗性，同時馬鈴薯的后代及任何部分的組織均具有抗性。上述將攜帶外源基因的表達(dá)載體導(dǎo)入宿主植物或其細(xì)胞內(nèi)的許多方法都是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。這些方法包括a、農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、b、物理法，如基因槍法、電擊融合法、顯微注射法、超聲波法等；c、化學(xué)法，如PEG介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化法、脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法等；d、種植系統(tǒng)轉(zhuǎn)化法，如花粉管通道法、子房注射法、浸泡法等；e、以花椰菜花葉病毒(CaMV)、雙生病毒(Geminiviruses)或RNA病毒等病毒載體所介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化法。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點
(1)本發(fā)明所述的方法構(gòu)建的多基因融合的反向重復(fù)序列的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物會形成一種序列自我互補(bǔ)的雙鏈RNA結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)會激發(fā)植株體內(nèi)的RNAi機(jī)制，把該雙鏈結(jié)構(gòu)降解成小片段，因此轉(zhuǎn)基因的mRNA不存在或存在量很少，也不會翻譯成蛋白質(zhì)，避免了常規(guī)抗病毒轉(zhuǎn)基因方式可能引起病毒與轉(zhuǎn)基因發(fā)生同源重組或異源包裝的潛在生物風(fēng)險；
(2)克隆的序列NibISCp由復(fù)制酶基因NIB的3’端序列、基因間隔區(qū)IS和外殼蛋白基因CP的5’端序列組成，在植物體內(nèi)能同時沉默PLRV病毒的這3個基因，提高對PLRV病毒的抗性。


圖I為馬鈴薯卷葉病毒基因片段的RT-PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果；·
圖2為本發(fā)明所述的抗性基因RNAiNibIsCp的構(gòu)建過程示意圖。
具體實施例方式以下是本發(fā)明的一個具體實施例
步驟一馬鈴薯卷葉病毒多基因融合序列的獲得CCGACACGATCGTGAGCTCG
I、根據(jù)PLRV的基因組序列(Accession :NC_001747)，設(shè)計PCR引物
正向引物 I :5’-GCATCGATTCCGACACGATCGTGAGCTCGT-3’，其 5’端人工加有 ClaI 酶切位占.
反向引物 I :5’-CGTGGTTACCTGAACTGTTAGCGCGCCT-3’，其 5’端人工加有 BstEII 酶切位占.
正向引物 2 :5’-CTGGTACCGACACGATCGTGAGCTCGT-3’，其 5’端人工加有 KpnI 酶切位點； 反向引物 2 :5’ -TCAGATCTGAACTCTGTTAGCGCGCCT-3’，其 5’ 端人工加有 BglII 酶切位點。引物由北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成。2、cDNA第一鏈合成提取感染PLRV病毒的馬鈴薯塊莖的RNA，取2μ ，再加入ΙΟμΜ的反向引物 I 2PL，10mM dNTP 2μ , ddH20 12μ , 65°C水浴 5min，冰浴 2min，再加入 5XRT緩沖液 5μ , RNasin^L (5U) ,M-MLRV 酶 μ (100U)，混勻后，42°C 60min，再 85°C IOmin,終止反應(yīng)。3、PCR擴(kuò)增以步驟2反轉(zhuǎn)錄合成的第一鏈cDNA為模板，在正向引物I和反向引物I的引導(dǎo)下，PCR擴(kuò)增PLRV的融合基因片段。PCR擴(kuò)增得到的多基因融合序列兩側(cè)分別含有人工加上的ClaI酶切位點和BstEII酶切位點，該序列命名為BsCl。以步驟2反轉(zhuǎn)錄合成的第一鏈cDNA為模板，在正向引物2和反向引物2的引導(dǎo)下，PCR擴(kuò)增PLRV的一段序列，該序列是一段多基因融合序列，由復(fù)制酶基因、基因間隔區(qū)和外殼蛋白基因組成。PCR擴(kuò)增得到的多基因融合序列兩側(cè)分別含有人工加上的KpnI酶切位點和BglII酶切位點，該序列命名為BgKp。PCR反應(yīng)程序是94°C變性 5min ;94°C變性 45s，58°C復(fù)性 lmin，72°C延伸 lmin，30個循環(huán)；然后70°C延伸lOmin。反應(yīng)結(jié)束后，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，用柱式回收試劑盒(博邁德)回收約370bp的擴(kuò)增產(chǎn)物。圖I為馬鈴薯卷葉病毒基因片段的RT-PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果；圖中M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，I為利用正向引物I與反向引物I通過RT-PCR擴(kuò)增的PLRV基因；2為利用正向引物2和反向引物2通過RT-PCR擴(kuò)增的PLRV基因。4、基因克隆取步驟3回收的PCR產(chǎn)物與pBS-T克隆載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，然后提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，將陽性克隆送三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司進(jìn)行核苷酸序列測定。測序結(jié)果表明，融合基因片段已插入PBS-T載體，得到重組克隆載體。插入了 BsCl序列的重組克隆載體命名為pBS-BsCl，插入了 BgKp序列的重組克隆載體命名為pBS-BgKp
表I是克隆的PLRV的一段序列所在的基因組信息
權(quán)利要求
1.一種提高馬鈴薯對卷葉病毒抗性的基因的構(gòu)建方法，其特征是包括以下步驟 (1)從感染馬鈴薯卷葉病毒的植物體內(nèi)經(jīng)提取總RNA、通過RT-PCR擴(kuò)增和基因克隆工序得到卷葉病毒的一段保守序列，所述保守序列包括復(fù)制酶基因、基因間隔區(qū)和外殼蛋白基因，位于卷葉病毒基因組的第3422至3790個核苷酸之間； (2)將步驟(I)獲得的卷葉病毒的保守序列以正向和反向分別連接到一個內(nèi)含子的兩偵牝構(gòu)建成一個反向重復(fù)序列，即為提高馬鈴薯對卷葉病毒抗性的基因RNAiNibIsCp ； (3)將基因RNAiNibIsCp兩端分別連接啟動子和終止子。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種提高馬鈴薯對卷葉病毒抗性的基因的構(gòu)建方法，其特征是所述的保守序列包括復(fù)制酶基因NIB的3’端、基因間隔區(qū)IS和外殼蛋白基因CP的5’端。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的的一種提高馬鈴薯對卷葉病毒抗性的基因的構(gòu)建方法，其特征是所述的RT-PCR擴(kuò)增，是取感染PLRV病毒的馬鈴薯塊莖的RNA2PL，再加入ΙΟμΜ的 反向引物 2PL，10mM dNTP 2μ , ddH20 12μ , 65°C水浴 5min，冰浴 2min，再加入 5XRT 緩沖液 5μ ，Rnasin μ (5U)，M-MLRV 酶 μ (100U)，混勻后，42°C 60min，再 85°C lOmin，終止反應(yīng)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種提高馬鈴薯對卷葉病毒抗性的基因構(gòu)建方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。包括以下步驟從感染馬鈴薯卷葉病毒的植物體內(nèi)經(jīng)提取總RNA、通過RT-PCR擴(kuò)增和基因克隆工序得到卷葉病毒的一段保守序列,所述保守序列包括復(fù)制酶基因、基因間隔區(qū)和外殼蛋白基因，位于卷葉病毒基因組的第3422至3790個核苷酸之間；將保守序列以正向和反向分別連接到一個內(nèi)含子的兩側(cè)，構(gòu)建成一個反向重復(fù)序列，即基因RNAiNibIsCp，然后在基因兩端分別連接啟動子和終止子。本發(fā)明避免了常規(guī)抗病毒轉(zhuǎn)基因方式可能引起病毒與轉(zhuǎn)基因發(fā)生同源重組或異源包裝的潛在生物風(fēng)險；克隆的序列NibISCp在植物體內(nèi)能同時沉默PLRV病毒的這3個基因，提高對PLRV病毒的抗性。
文檔編號C12N15/113GK102787126SQ20121025861
公開日2012年11月21日 申請日期2012年7月25日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月25日
發(fā)明者張忠梁, 張維鋒, 施俊鳳, 白云風(fēng), 郭志華, 閆建俊 申請人:山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所