專(zhuān)利名稱(chēng)：豬乙腦疫苗及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物制藥領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及豬乙腦疫苗及其制備方法。
背景技術(shù)：
乙型腦炎簡(jiǎn)稱(chēng)乙腦，是由乙型腦炎病毒引起的一種人畜共患傳染病。本病最早發(fā)現(xiàn)于日本，所以又稱(chēng)日本乙型腦炎。乙腦是人畜共患的自然疫源性疾病，人與許多動(dòng)物都可以成為本病的傳染源，乙腦是嚴(yán)重威脅人類(lèi)和動(dòng)物健康的傳染性疾病，對(duì)畜牧業(yè)造成嚴(yán)重的危害。在動(dòng)物中，豬是主要的乙腦病毒的主要宿主，乙腦病毒必須依靠吸血雌蚊作媒介進(jìn)行傳播，流行環(huán)節(jié)是豬-蚊-豬。自然環(huán)境中，豬的感染率很高，仔豬經(jīng)過(guò)一個(gè)流行季以后幾乎100%感染。豬感染乙腦后多出現(xiàn)高熱，精神沉郁或有神經(jīng)癥狀，食欲減退，有的出現(xiàn)麻痹癥狀。
由于乙型腦炎是由蚊子叮咬而引起的，我們無(wú)法完全消滅蚊子也無(wú)法阻止豬只不被蚊子咬，因此，注射疫苗成為預(yù)防乙型腦炎的首選。然而，目前的乙腦疫苗制備方法效率低，制備的乙腦疫苗病毒含量低、免疫效力低、免疫效果不穩(wěn)定。因此，目前制備乙腦疫苗的方法仍有待改進(jìn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是基于發(fā)明人的下列發(fā)現(xiàn)而完成的現(xiàn)階段，我國(guó)使用豬乙型腦炎活疫苗(SA14-14-2株)進(jìn)行豬預(yù)防接種，注射后3周可產(chǎn)生堅(jiān)強(qiáng)的免疫力，能有效預(yù)防豬乙腦的發(fā)生。目前商業(yè)化的豬乙型腦炎活疫苗采用原代地鼠腎細(xì)胞轉(zhuǎn)瓶工藝進(jìn)行生產(chǎn)，由于原代細(xì)胞制備過(guò)程復(fù)雜，并且使用轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)細(xì)胞，整個(gè)生產(chǎn)過(guò)程完全采用人工手工操作，容易造成制品的污染以及產(chǎn)品質(zhì)量的不穩(wěn)定，不適合乙腦疫苗工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)。本發(fā)明旨在至少解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)問(wèn)題之一。為此，本發(fā)明的申請(qǐng)人經(jīng)過(guò)艱苦的努力尋找并發(fā)現(xiàn)了可解決上述技術(shù)問(wèn)題的關(guān)鍵因素一BHK-21細(xì)胞。BHK-21細(xì)胞是一種可連續(xù)傳代培養(yǎng)的地鼠腎細(xì)胞，已經(jīng)成功用于豬口蹄疫疫苗、犬狂犬病疫苗的生產(chǎn)，是一種良好的疫苗生產(chǎn)用細(xì)胞。與原代地鼠腎細(xì)胞比較，使用BHK-21細(xì)胞制備疫苗，由于BHK-21細(xì)胞可連續(xù)傳代培養(yǎng)，經(jīng)多代擴(kuò)增培養(yǎng)后可得到大量細(xì)胞用于制備疫苗，因此克服了細(xì)胞來(lái)源限制問(wèn)題。同時(shí)由于BHK-21細(xì)胞可采用生物反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)，在嚴(yán)格可控的培養(yǎng)條件下，細(xì)胞能在最適合的條件下生長(zhǎng)繁殖，細(xì)胞生長(zhǎng)迅速且狀態(tài)良好，培養(yǎng)獲得的細(xì)胞密度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)，更適合工業(yè)化生產(chǎn)。此外，本發(fā)明的發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，BHK-21細(xì)胞對(duì)乙腦病毒敏感，接種乙腦病毒后3-4天出現(xiàn)細(xì)胞病變，適于乙腦病毒的培養(yǎng)。由此，本發(fā)明提出了一種乙腦疫苗及其制備方法。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，本發(fā)明提出了一種制備豬乙腦疫苗的方法。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該方法包括以下步驟利用生物反應(yīng)器將BHK-21細(xì)胞進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，以便獲得BHK-21細(xì)胞懸浮液；將SA14-14-2株乙腦病毒接種于BHK-21細(xì)胞懸浮液中進(jìn)行培養(yǎng)，以便獲得富集乙腦病毒的培養(yǎng)液；以及將富集乙腦病毒的培養(yǎng)液依次進(jìn)行凍融和離心，以便收集富集的乙腦病毒，獲得豬乙腦疫苗。發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，利用該方法，能夠以工業(yè)化規(guī)模、高效地生產(chǎn)豬乙腦疫苗，并且獲得的豬乙腦疫苗質(zhì)量?jī)?yōu)良，病毒含量比現(xiàn)有商業(yè)化轉(zhuǎn)瓶制備的疫苗高10倍，能夠有效地用于豬乙腦預(yù)防接種，且免疫效力高、免疫效果穩(wěn)定。此外，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該方法還具有設(shè)備體積小、節(jié)省空間，放大容易，工藝可控性好，對(duì)操作人員要求不高等優(yōu)點(diǎn)。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，在本發(fā)明的制備豬乙腦疫苗的方法中，利用生物反應(yīng)器將BHK-21細(xì)胞進(jìn)行懸浮培養(yǎng)的方法不受特別限制，只要能夠?qū)HK-21種子細(xì)胞進(jìn)行連續(xù)傳代擴(kuò)增培養(yǎng)，獲得大量可用于疫苗制備的細(xì)胞即可。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，利用生物反應(yīng)器將BHK-21細(xì)胞進(jìn)行懸浮培養(yǎng)可以進(jìn)一步包括于搖瓶中，利用含10體積％新生牛血清的MD611培養(yǎng)基將BHK-21種子細(xì)胞依次進(jìn)行第一懸浮培養(yǎng)和轉(zhuǎn)種培養(yǎng)，以便獲得第一 BHK-21細(xì)胞懸浮液，其中經(jīng)過(guò)第一懸浮培養(yǎng)的BHK-21種子細(xì)胞的細(xì)胞密度不小于 2X IO6細(xì)胞/ml，優(yōu)選不小于2. 3 X IO6細(xì)胞/ml，第一 BHK-21細(xì)胞懸浮液中細(xì)胞密度不小于2. 5 X IO6細(xì)胞/ml ;將第一 BHK-21細(xì)胞懸浮液接種于第一生物反應(yīng)器中，并添加含2體積％新生牛血清的MD611培養(yǎng)基，進(jìn)行第二懸浮培養(yǎng)，以便獲得第二BHK-21細(xì)胞懸浮液，該第二BHK-21細(xì)胞懸浮液中細(xì)胞密度不小于2X IO6細(xì)胞/ml，優(yōu)選不小于3. 4X IO6細(xì)胞/ml ;將第二 BHK-21細(xì)胞懸浮液接種于第二生物反應(yīng)器中，并添加含2體積％新生牛血清的MD611培養(yǎng)基，進(jìn)行第三懸浮培養(yǎng)，以便獲得前述的BHK-21細(xì)胞懸浮液，該BHK-21細(xì)胞懸浮液中細(xì)胞密度不小于I. 5X IO6細(xì)胞/ml，其中，第二生物反應(yīng)器的容量大于第一生物反應(yīng)器，第一生物反應(yīng)器的容量大于搖瓶。由此，能夠有效地將BHK-21種子細(xì)胞進(jìn)行連續(xù)傳代擴(kuò)增培養(yǎng)，從而能夠獲得大量可用于疫苗制備的細(xì)胞。此外,根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，前述的第一懸浮培養(yǎng)、轉(zhuǎn)種培養(yǎng)、第二懸浮培養(yǎng)以及第三懸浮培養(yǎng)的培養(yǎng)條件以及所采用的設(shè)備均不受特別限制，只要適于將BHK-21種子細(xì)胞進(jìn)行連續(xù)傳代擴(kuò)增培養(yǎng)即可。根據(jù)本發(fā)明的一些優(yōu)選實(shí)施例，搖瓶的容量為250ml，第一生物反應(yīng)器的容量為10L，第二生物反應(yīng)器的容量為100L，由此，能夠逐步、有效地將BHK-21種子細(xì)胞進(jìn)行連續(xù)傳代擴(kuò)增培養(yǎng)，從而能夠獲得大量可用于疫苗制備的細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的具體示例，第一懸浮培養(yǎng)是在37°C溫度，120rpm轉(zhuǎn)速下培養(yǎng)3_4天，由此，能夠有效地使經(jīng)過(guò)第一懸浮培養(yǎng)的BHK-21種子細(xì)胞的細(xì)胞密度不小于2. 3X IO6細(xì)胞/ml，以便進(jìn)行后續(xù)的轉(zhuǎn)種培養(yǎng)，進(jìn)而能夠進(jìn)行后續(xù)的傳代擴(kuò)增培養(yǎng)。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，轉(zhuǎn)種培養(yǎng)是按I :4的體積比例進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)種，在37°C溫度，120rpm轉(zhuǎn)速下培養(yǎng)3-4天，由此，能夠有效地使第一 BHK-21細(xì)胞懸浮液中的細(xì)胞密度不小于2. 5 X IO6細(xì)胞/ml，進(jìn)而能夠進(jìn)行后續(xù)的傳代擴(kuò)增培養(yǎng)，以便實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的擴(kuò)增。根據(jù)本發(fā)明的另一些實(shí)施例，第二懸浮培養(yǎng)是在36-37°C溫度，80-100rpm轉(zhuǎn)速，pH 7. 1-7. 2，溶氧濃度40-60%下培養(yǎng)4-5天，優(yōu)選在36. 5°C溫度，90rpm轉(zhuǎn)速，pH 7. 15，溶氧濃度50%下培養(yǎng)4天，由此，能夠有效地使第二 BHK-21細(xì)胞懸浮液中的細(xì)胞密度不小于3. 4X IO6細(xì)胞/ml，進(jìn)而能夠進(jìn)行后續(xù)的第三懸浮培養(yǎng)，從而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的傳代擴(kuò)增。根據(jù)本發(fā)明的一些具體示例，第三懸浮培養(yǎng)是在36-37°C溫度，80-100rpm轉(zhuǎn)速，pH 7. 1-7. 2，溶氧濃度40-60%下培養(yǎng)2-3天，優(yōu)選在36. 5°C溫度，90rpm轉(zhuǎn)速，pH 7. 15，溶氧濃度50%下培養(yǎng)3天，由此，能夠有效地獲得細(xì)胞密度不小于I. 5 X IO6細(xì)胞/ml放入BHK-21細(xì)胞懸浮液，從而能夠成功地通過(guò)連續(xù)傳代擴(kuò)增獲得大量可用于疫苗制備的細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，在本發(fā)明的制備豬乙腦疫苗的方法中，SA14-14-2株乙腦病毒的病毒滴度不小于108_°TCID5(l/ml。由此，能夠使SA14-14-2株乙腦病毒有效地感染BHK-21細(xì)胞，并能夠通過(guò)培養(yǎng)高效地生產(chǎn)富集乙腦病毒，從而能夠有效地獲得富集乙腦病毒的培養(yǎng)液。其中，需要說(shuō)明的是，本文中所使用的術(shù)語(yǔ)“病毒滴度”是指病毒的含量，衡量病毒滴度的單位有最小致死量(MLD)、最小感染量(MID)、半數(shù)致死量(LD50)，以感染發(fā)病作指標(biāo)的半數(shù)感染量(ID50)，雞胚半數(shù)致死量(ELD50)、雞胚半數(shù)感染量(EID50)，以及試驗(yàn)的材料是細(xì)胞時(shí)所用的組織細(xì)胞培養(yǎng)半數(shù)感染量(TCID5tl),而本文中即是采用組織細(xì)胞培養(yǎng)半數(shù)感染量(TCID5tl)作為病毒滴度的單位。此外，還需要說(shuō)明的是，本發(fā)明中是采用96孔細(xì)胞板測(cè)定乙腦病毒和疫苗的病毒滴度的。具體地用含0. 3重量％牛血清白蛋白的MD611培養(yǎng)基將待檢病毒液和疫苗進(jìn)行10倍系列稀釋?zhuān)?0-6、10-7、10_83個(gè)稀釋度，接種于長(zhǎng)滿(mǎn)BHK-21細(xì)胞的96孔細(xì)胞板中，每稀釋度接種4孔，每孔接種30 yl，于37°C下孵育Ih
后，每孔再補(bǔ)加含0. 3體積％牛血清白蛋白的MD611培養(yǎng)基70iU，于36-37°C下培養(yǎng)5天，觀(guān)察細(xì)胞病變，并計(jì)算TCID5Q。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，在本發(fā)明的制備豬乙腦疫苗的方法中，將SA14-14-2株乙腦病毒接種于所述BHK-21細(xì)胞懸浮液中進(jìn)行培養(yǎng)的方法和具體步驟不受特別限制，只要能夠有效地進(jìn)行病毒培養(yǎng)和生產(chǎn)，獲得富集乙腦病毒的培養(yǎng)液即可。根據(jù)本發(fā)明的一些具體示例，將SA14-14-2株乙腦病毒接種于所述BHK-21細(xì)胞懸浮液中進(jìn)行培養(yǎng)可以進(jìn)一步包括將SA14-14-2株乙腦病毒按照I :100的比例接種于BHK-21細(xì)胞懸浮液中，并于36-37°C溫度，80-100rpm轉(zhuǎn)速，pH7. 2-7. 4，溶氧濃度40-60%下培養(yǎng)3天，優(yōu)選于35°C溫度，90rpm轉(zhuǎn)速，PH7. 3，溶氧濃度50%下培養(yǎng)3天。由此，能夠有效地進(jìn)行病毒培養(yǎng)，獲得富集乙腦病毒的培養(yǎng)液。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，富集乙腦病毒的培養(yǎng)液中細(xì)胞的密度不受特別限制，根據(jù)本發(fā)明的一些具體示例，采用前述培養(yǎng)方法培養(yǎng)3天后，獲得的富集乙腦病毒的培養(yǎng)液中細(xì)胞密度不小于3. 3X IO6細(xì)胞/ml。此外，獲得富集乙腦病毒的培養(yǎng)液后，需要從中分離培養(yǎng)富集的乙腦病毒。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，在本發(fā)明的制備豬乙腦疫苗的方法中，從富集乙腦病毒的培養(yǎng)液中收集富集的乙腦病毒的方法不受特別限制，可以通過(guò)將富集乙腦病毒的培養(yǎng)液依次進(jìn)行凍融和離心來(lái)實(shí)現(xiàn)。根據(jù)本發(fā)明的一些具體示例，于_20°C下進(jìn)行所述凍融兩次，由此，能夠使細(xì)胞充分裂解破碎，方便病毒的分離。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，于2000rpm轉(zhuǎn)速下進(jìn)行離心，并棄去沉淀，由此，能夠有效地收集富集的乙腦病毒。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，在本發(fā)明的制備豬乙腦疫苗的方法中，富集的乙腦病毒的病毒滴度不小于107_ 5TCID5(l/ml，優(yōu)選為108_ 3TCID5(l/ml。由此，本發(fā)明富集的乙腦病毒能夠有效地進(jìn)行豬乙腦疫苗的制備。具體地，根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，本發(fā)明的制備豬乙腦疫苗的方法還可以包括于搖瓶中，在37 °C溫度，120rpm轉(zhuǎn)速下，利用含10體積％新生牛血清的MD611培養(yǎng)基將BHK-21種子細(xì)胞進(jìn)行第一懸浮培養(yǎng)3-4天，至細(xì)胞密度不小于2. 3 X IO6細(xì)胞/ml時(shí)，按照I :4的比例，于37°C溫度，120rpm轉(zhuǎn)速下進(jìn)行轉(zhuǎn)種培養(yǎng)3_4天，以便獲得第一 BHK-21細(xì)胞懸浮液，其中第一 BHK-21細(xì)胞懸浮液中細(xì)胞密度為2. 5 X IO6細(xì)胞/ml ;將第一 BHK-21細(xì)胞懸浮液接種于的第一生物反應(yīng)器中，并添加含2體積％新生牛血清的MD611培養(yǎng)基，于36. 5°C溫度，90rpm轉(zhuǎn)速，pH 7. 15，溶氧濃度50%下進(jìn)行第二懸浮培養(yǎng)4天，以便獲得第二BHK-21細(xì)胞懸浮液，該第二 BHK-21細(xì)胞懸浮液中細(xì)胞密度不小于3. 4X IO6細(xì)胞/ml ;將第二 BHK-21細(xì)胞懸浮液接種于第二生物反應(yīng)器中，并添加含2體積％新生牛血清的MD611培養(yǎng)基，于36. 5°C溫度，90rpm轉(zhuǎn)速，pH 7. 15，溶氧濃度50%下進(jìn)行第三懸浮培養(yǎng)3天，以便獲得BHK-21細(xì)胞懸浮液，該BHK-21細(xì)胞懸浮液中細(xì)胞密度不小于I. 5X IO6細(xì)胞/ml，其中，第二生物反應(yīng)器的容量大于第一生物反應(yīng)器，第一生物反應(yīng)器的容量大于轉(zhuǎn)瓶；將SA14-14-2株乙腦病毒按照I :100的比例接種于BHK-21細(xì)胞懸浮液中，并于35°C溫度，90rpm轉(zhuǎn)速，pH 7. 3，溶氧濃度50%下培養(yǎng)3天，以便獲得富集乙腦病毒的培養(yǎng)液；以及將富集乙腦病毒的培養(yǎng)液于_20°C下進(jìn)行凍融兩次，然后于2000rpm轉(zhuǎn)速下進(jìn)行離心，并棄去沉淀，以便收集富集的乙腦病毒，經(jīng)過(guò)配制、凍干后獲得豬乙腦疫苗。
此外，需要說(shuō)明的是，相比現(xiàn)階段的采用原代地鼠腎細(xì)胞轉(zhuǎn)瓶工藝生產(chǎn)豬乙腦疫苗的方法，本發(fā)明的制備豬乙腦疫苗的方法至少具有以下優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明所采用的BHK-21細(xì)胞，可連續(xù)傳代擴(kuò)增獲得大量的細(xì)胞用于疫苗的制備，細(xì)胞來(lái)源不受限制；本發(fā)明所采用的BHK-21細(xì)胞，適于乙型腦炎病毒的培養(yǎng)，病毒產(chǎn)量高；本發(fā)明采用生物反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)BHK-21細(xì)胞，獲得的細(xì)胞密度比轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)工藝高5-10倍，并且能夠精確控制細(xì)胞和病毒的培養(yǎng)條件，實(shí)現(xiàn)了生產(chǎn)過(guò)程工藝化控制，能制備高病毒含量的產(chǎn)品，可實(shí)現(xiàn)豬乙型腦炎病毒的工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)；并且，本發(fā)明利用生物反應(yīng)器進(jìn)行疫苗生產(chǎn)，具有設(shè)備體積小，節(jié)省空間，放大容易，工藝可控性好，對(duì)人員要求不高等優(yōu)點(diǎn)。根據(jù)本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明還提出了一種豬乙腦疫苗。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該豬乙腦疫苗是通過(guò)本發(fā)明的制備豬乙腦疫苗的方法制備的。發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的豬乙腦疫苗質(zhì)量?jī)?yōu)良，病毒含量比現(xiàn)有商業(yè)化轉(zhuǎn)瓶制備的疫苗高10倍，能夠有效地用于豬乙腦預(yù)防接種，并且免疫效力高、免疫效果穩(wěn)定。具體地，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，本發(fā)明的豬乙腦疫苗可以包含病毒滴度不小于107_ 5TCID5Q/ml，優(yōu)選為l(f3TCID5(l/ml的SA14-14-2株乙腦病毒；1重量％的明膠；以及5重
量％的鹿糖。此外，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，本發(fā)明的豬乙腦疫苗的形式不受特別限制，根據(jù)本發(fā)明的一些具體示例，豬乙腦疫苗呈凍干狀態(tài)。需要說(shuō)明的是，相比現(xiàn)有的商業(yè)化轉(zhuǎn)瓶工藝制備的豬乙腦疫苗，本發(fā)明的豬乙腦疫苗至少具有以下優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明的豬乙腦疫苗，病毒含量比現(xiàn)有商業(yè)化轉(zhuǎn)瓶制備的疫苗高10倍，質(zhì)量?jī)?yōu)良，免疫效力高，免疫效果穩(wěn)定，有效填補(bǔ)了國(guó)內(nèi)空白。此外，還需要說(shuō)明的是，本發(fā)明的制備豬乙腦疫苗的方法生產(chǎn)的豬乙腦疫苗為豬乙型腦炎活疫苗，能夠有效地用于豬乙腦預(yù)防接種。本發(fā)明的附加方面和優(yōu)點(diǎn)將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過(guò)本發(fā)明的實(shí)踐了解到。


本發(fā)明的上述和/或附加的方面和優(yōu)點(diǎn)從結(jié)合下面附圖對(duì)實(shí)施例的描述中將變得明顯和容易理解，其中圖I顯示了根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例的制備豬乙腦疫苗的方法的流程示意圖。
具體實(shí)施例方式下面詳細(xì)描述本發(fā)明的實(shí)施例，所述實(shí)施例的示例在附圖中示出，其中自始至終相同或類(lèi)似的標(biāo)號(hào)表示相同或類(lèi)似的元件或具有相同或類(lèi)似功能的元件。下面通過(guò)參考附圖描述的實(shí)施例是示例性的，僅用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對(duì)本發(fā)明的限制。一般方法參考圖1，本發(fā)明的制備豬乙腦疫苗的方法可以包括(I)生物反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)BHK-21細(xì)胞于搖瓶中，在37 °C溫度，120rpm轉(zhuǎn)速下，利用含10體積％新生牛血清的MD611培養(yǎng)基將BHK-21種子細(xì)胞進(jìn)行第一懸浮培養(yǎng)3-4天，至細(xì)胞密度不小于2. 3 X IO6細(xì)胞/ml時(shí)，按照I :4的比例，于37°C溫度，120rpm轉(zhuǎn)速下進(jìn)行轉(zhuǎn)種培養(yǎng)3_4天，以便獲得第一 BHK-21細(xì)胞懸浮液，其中第一 BHK-21細(xì)胞懸浮液中細(xì)胞密度為2. 5 X IO6細(xì)胞/ml ;將第一 BHK-21細(xì)胞懸浮液接種于的第一生物反應(yīng)器中，并添加含2體積％新生牛血清的MD611培養(yǎng)基，于36. 5°C溫度，90rpm轉(zhuǎn)速，pH 7. 15，溶氧濃度50%下進(jìn)行第二懸浮培養(yǎng)4天，以便獲得第二BHK-21細(xì)胞懸浮液，該第二 BHK-21細(xì)胞懸浮液中細(xì)胞密度不小于3. 4X IO6細(xì)胞/ml ;將第二 BHK-21細(xì)胞懸浮液接種于第二生物反應(yīng)器中，并添加含2體積％新生牛血清的MD611培養(yǎng)基，于36. 5°C溫度，90rpm轉(zhuǎn)速，pH 7. 15，溶氧濃度50%下進(jìn)行第三懸浮培養(yǎng)3天，以便獲得BHK-21細(xì)胞懸浮液，該BHK-21細(xì)胞懸浮液中細(xì)胞密度不小于I. 5X IO6細(xì)胞/ml，其中，第二生物反應(yīng)器的容量大于第一生物反應(yīng)器，第一生物反應(yīng)器的容量大于轉(zhuǎn)瓶。
(2) SA14-14-2株病毒接種與培養(yǎng)將SA14-14-2株乙腦病毒按照I :100的比例接種于BHK-21細(xì)胞懸浮液中，并于35°C溫度，90rpm轉(zhuǎn)速，pH 7. 3，溶氧濃度50%下培養(yǎng)3天，以便獲得富集乙腦病毒的培養(yǎng)液。(3)分離病毒將富集乙腦病毒的培養(yǎng)液于_20°C下進(jìn)行凍融兩次，然后于2000rpm轉(zhuǎn)速下進(jìn)行離心，并棄去沉淀，以便收集富集的乙腦病毒，獲得豬乙腦疫苗。實(shí)施例I :豬乙腦疫苗的制備I)生物反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)BHK-21細(xì)胞取液氮保存的BHK-21種子細(xì)胞2ml，37度水浴迅速融化，IOOOrpm離心5分鐘，棄去上清液，用含10體積％新生牛血清的MD611培養(yǎng)基50ml重懸浮，轉(zhuǎn)移至250ml搖瓶中，于37°C、120rpm下進(jìn)行第一懸浮培養(yǎng)3_4天，至細(xì)胞密度達(dá)到2. 3 X IO6細(xì)胞/ml時(shí)，按照I 4的比例，于37°C溫度，120rpm轉(zhuǎn)速下進(jìn)行轉(zhuǎn)種培養(yǎng)3_4天，將細(xì)胞擴(kuò)增至800ml體積，使細(xì)胞密度達(dá)到2. 5X IO6細(xì)胞/ml，以便獲得第一 BHK-21細(xì)胞懸浮液。將上述獲得的800ml第一 BHK-21細(xì)胞懸浮液，接種于已滅菌的IOL第一生物反應(yīng)器中，加入含2體積％新生牛血清的MD611培養(yǎng)基8L，控制細(xì)胞培養(yǎng)溫度36. 5°C，Ph 7. 15，攪拌轉(zhuǎn)速90rpm，溶解氧濃度50%，進(jìn)行第二懸浮培養(yǎng)4天，至細(xì)胞密度達(dá)到3. 4 X IO6細(xì)胞/ml,以便獲得第二 BHK-21細(xì)胞懸浮液。將上述獲得的第二 BHK-21細(xì)胞懸浮液，接種于已滅菌的100L第二生物反應(yīng)器中，加入含2體積％新生牛血清的MD611培養(yǎng)基80L，控制細(xì)胞培養(yǎng)溫度36. 5°C，pH 7. 15，攪拌轉(zhuǎn)速90rpm，溶解氧濃度50%，進(jìn)行第三懸浮培養(yǎng)3天，至細(xì)胞密度達(dá)到I. 5X IO6細(xì)胞/ml，以便獲得BHK-21細(xì)胞懸浮液。其中，所采用的MD611培養(yǎng)基購(gòu)自清大天一公司(批號(hào)110704)。2) SA14_14_2株病毒接種與培養(yǎng)直接向第二生物反應(yīng)器中接種SA14-14-2株乙腦病毒(病毒滴度> IO80TCID50/ml)，病毒接種量為0. 8L，控制培養(yǎng)溫度35°C，pH 7. 3，攪拌轉(zhuǎn)速90rpm，溶解氧濃度50%，進(jìn)行病毒培養(yǎng)3天，至細(xì)胞密度達(dá)到3. 3X IO6細(xì)胞/ml，以便獲得富集乙腦病毒的培養(yǎng)液。
3)分離病毒將富集乙腦病毒的培養(yǎng)液于_20°C進(jìn)行凍融2次，然后于2000rpm轉(zhuǎn)速下進(jìn)行離心10分鐘，并棄去細(xì)胞沉淀物，以便收集獲得富集的乙腦病毒。然后，將獲得的富集的乙腦病毒(病毒滴度為108 3TCID5(l/ml)，添加I重量％的明膠、5重量％的蔗糖，制成半成品，并分裝凍干，以便獲得豬乙腦疫苗。實(shí)施例2 按照《中華人民共和國(guó)獸藥典(三部2010版)》(通過(guò)參照將其全文并入本文)中的檢定方法和標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)實(shí)施例I制備獲得的豬乙型腦炎活疫苗和市售的地鼠腎細(xì)胞豬乙型腦炎活疫苗進(jìn)行檢定、比較，結(jié)果見(jiàn)下表。
權(quán)利要求
1.一種制備豬こ腦疫苗的方法，其特征在于，包括以下步驟 利用生物反應(yīng)器將BHK-21細(xì)胞進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，以便獲得BHK-21細(xì)胞懸浮液； 將SA14-14-2株こ腦病毒接種于所述BHK-21細(xì)胞懸浮液中進(jìn)行培養(yǎng)，以便獲得富集こ腦病毒的培養(yǎng)液；以及 將所述富集こ腦病毒的培養(yǎng)液依次進(jìn)行凍融和離心，以便收集富集的こ腦病毒，獲得所述豬こ腦疫苗。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，利用生物反應(yīng)器將BHK-21細(xì)胞進(jìn)行懸浮培養(yǎng)進(jìn)ー步包括 于搖瓶中，利用含10體積％新生牛血清的MD611培養(yǎng)基將BHK-21種子細(xì)胞依次進(jìn)行第一懸浮培養(yǎng)和轉(zhuǎn)種培養(yǎng)，以便獲得第一 BHK-21細(xì)胞懸浮液,其中經(jīng)過(guò)第一懸浮培養(yǎng)的BHK-21種子細(xì)胞的細(xì)胞密度不小于2. 3X IO6細(xì)胞/ml，所述第一 BHK-21細(xì)胞懸浮液中細(xì)胞密度不小于2. 5 X IO6細(xì)胞/ml ； 將所述第一 BHK-21細(xì)胞懸浮液接種于第一生物反應(yīng)器中，并添加含2體積％新生牛血清的MD611培養(yǎng)基，進(jìn)行第二懸浮培養(yǎng)，以便獲得第二BHK-21細(xì)胞懸浮液，所述第二BHK-21細(xì)胞懸浮液中細(xì)胞密度不小于3. 4X IO6細(xì)胞/ml ；以及 將所述第二 BHK-21細(xì)胞懸浮液接種于第二生物反應(yīng)器中，并添加含2體積％新生牛血清的MD611培養(yǎng)基，進(jìn)行第三懸浮培養(yǎng)，以便獲得所述BHK-21細(xì)胞懸浮液，所述BHK-21細(xì)胞懸浮液中細(xì)胞密度不小于I. 5X IO6細(xì)胞/ml， 其中，所述第二生物反應(yīng)器的容量大于所述第一生物反應(yīng)器，所述第一生物反應(yīng)器的容量大于所述搖瓶， 優(yōu)選地，所述搖瓶的容量為250ml，所述第一生物反應(yīng)器的容量為10L，所述第二生物反應(yīng)器的容量為100L。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述第一懸浮培養(yǎng)是在37°C溫度，120rpm轉(zhuǎn)速下培養(yǎng)3-4天， 任選地，所述轉(zhuǎn)種培養(yǎng)是按I :4的體積比例進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)種，在37°C溫度，120rpm轉(zhuǎn)速下培養(yǎng)3-4天， 任選地，所述第二懸浮培養(yǎng)是在36. 5°C溫度，90rpm轉(zhuǎn)速，pH 7. 15，溶氧濃度50%下培養(yǎng)4天， 任選地，所述第三懸浮培養(yǎng)是在36. 5°C溫度，90rpm轉(zhuǎn)速，pH 7. 15，溶氧濃度50%下培養(yǎng)3天。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述SA14-14-2株こ腦病毒的病毒滴度不小于 108 0TCID50/mlo
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述將SA14-14-2株こ腦病毒接種于所述BHK-21細(xì)胞懸浮液中進(jìn)行培養(yǎng)進(jìn)一歩包括 將SA14-14-2株こ腦病毒按照I :100的比例接種于所述BHK-21細(xì)胞懸浮液中，并于35°C溫度，90rpm轉(zhuǎn)速，pH 7. 3，溶氧濃度50%下培養(yǎng)3天， 任選地，所述富集こ腦病毒的培養(yǎng)液中細(xì)胞密度不小于3. 3X IO6細(xì)胞/ml。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，于_20°C下進(jìn)行所述凍融兩次， 任選地，于2000rpm轉(zhuǎn)速下進(jìn)行所述離心，并棄去沉淀。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述富集的こ腦病毒的病毒滴度不小于IO7.5TCID50/ml，優(yōu)選為 IO8.3TCID50/ml。
8.—種豬こ腦疫苗，其是通過(guò)權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)所述的方法制備的。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的豬こ腦疫苗，其特征在于，所述豬こ腦疫苗包含 病毒滴度不小于107_5TCID5ciAil，優(yōu)選為108_3TCID5tZml的SA14-14-2株こ腦病毒； I重量％的明膠；以及 5重量％的鹿糖。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的豬こ腦疫苗，其特征在于，所述豬こ腦疫苗呈凍干狀態(tài)。
全文摘要
本發(fā)明涉及豬乙腦疫苗及其制備方法。其中，制備豬乙腦疫苗的方法包括利用生物反應(yīng)器將BHK-21細(xì)胞進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，以便獲得BHK-21細(xì)胞懸浮液；將SA14-14-2株乙腦病毒接種于BHK-21細(xì)胞懸浮液中進(jìn)行培養(yǎng)，以便獲得富集乙腦病毒的培養(yǎng)液；以及將富集乙腦病毒的培養(yǎng)液依次進(jìn)行凍融和離心，以便收集富集的乙腦病毒，獲得豬乙腦疫苗。利用該方法，能夠以工業(yè)化規(guī)模、高效地生產(chǎn)豬乙腦疫苗，并且獲得的豬乙腦疫苗質(zhì)量?jī)?yōu)良，病毒含量高，能夠有效地用于豬乙腦預(yù)防接種，且免疫效力高、免疫效果穩(wěn)定。
文檔編號(hào)C12N5/071GK102793917SQ20121025883
公開(kāi)日2012年11月28日 申請(qǐng)日期2012年7月24日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月24日
發(fā)明者熊煒, 高楊, 劉俊生, 劉延亭 申請(qǐng)人:北京中聯(lián)康生物科技有限公司