專利名稱：志賀菌分離、鑒定的試劑盒、制備和應用的制作方法
技術領域：
本發明是針對腸道病原菌中志賀菌屬的試劑盒和使用方法，特別涉及志賀菌屬(包括A群痢疾志賀、B群福氏志賀、C群鮑氏志賀、D群宋內志賀)的同步分離和鑒定試劑盒、制備和應用，利用選擇性分離培養基對應生長的典型菌落形態、簡易生化和特異性酶-底物反應組合試驗鑒定所有志賀菌。
背景技術：
志賀菌屬目前分4個群，常見的為福氏志賀菌和宋內志賀菌，由于其在遺傳學、生物學特征上和諸多腸桿菌科內的多數非病原菌或 條件病原菌存在生物學和遺傳學相似性導致許多實驗室在實際工作中無法通過簡單的微生物常規分離方法達到分離到所有志賀菌的預期效果；其次，從不同技術屬性和分工的實驗室能力要求角度考量，存在對志賀菌屬(包括A群痢疾志賀、B群福氏志賀、C群鮑氏志賀、D群宋內志賀)在不同檢材中分離的技術要求和方法的敏感性要求。中國專利申請201010550372. 3公開了“沙門菌和志賀菌同步分離、鑒定的試劑盒、制備和應用”，具體說是一種對沙門菌和志賀菌同時進行分離、檢測和鑒定的程序，可應用于食品和其它糞便類樣品中沙門菌和志賀菌的同步檢測。但是該方法篩選病原菌的檢測流程還存在一定局限性，無法滿足不同類型實驗室的專業實驗室的特殊的技術要求；在處理不同類型的標本上沒有使實驗室的材料與方法的績效比達到預期效果。

發明內容
本發明目的是提供一種一次可同步分離A-D群志賀菌并利用生化和酶反應試驗鑒定的試劑盒、制備和應用。主要解決現有志賀菌分離方法存在的漏檢率高、鑒定步驟繁復且成本較高、篩選結果不夠直觀的技術難題。本發明適用不同類型實驗室(臨床實驗室和公共衛生實驗室)對不同類型標本選擇不同的檢測流程，通過對標本有效增菌的預處理或直接專一性分離平板配合簡單的糖生化發酵反應模式和細菌特異性酶-底物反應特征建立一套行之有效的分離和特異性鑒別試驗，達到對A-D群志賀菌同步篩選分離和簡易鑒定的效果。本發明的技術方案為志賀菌分離、鑒定的試劑盒試劑盒，包括
I、通用型非選擇性增菌液胰酪胨大豆胨肉湯(TSB)。成分胰化酪蛋白胨17.0g，植物蛋白胨3. Og,氯化鈉5. Og, K2HPO4 2. 5g,葡萄糖2. 5g,蒸懼水1000ml,加熱溶解后矯正pH至7·3±0·2 (按冷卻至25°C后測量值為標準)。經15磅壓力15分鐘(121°C )滅菌后分裝225mL/瓶備用。2、10倍濃縮通用型非選擇性增菌液胰酪胨大豆胨肉湯(TSB)。成分胰化酪蛋白胨17. Og,植物蛋白胨3. Og,氯化鈉5. Og, K2HPO4 2. 5g,葡萄糖2. 5g,蒸懼水100ml,加熱溶解后矯正pH至7. 3±0. 2 (按冷卻至25°C后測量值為標準)。經15磅壓力15分鐘(121°C)滅菌后分裝IOmL/瓶備用。3、志賀菌增菌液胰化酪蛋白胨20. 0g，氯化鈉5. Og, K2HPO4 2. Og, KH2PO4 2. Og,葡萄糖l.Og，吐溫-80 I. 5ml，蒸餾水1000ml，15磅壓力15分鐘，121 °C滅菌，新生霉素50mg (分裝前加入)，ρΗ7. 0±0· 2,分裝9mL/無菌試管備用。4、液體石蠟油商品化化學純礦物油或液體石蠟油分裝12ml/管，置65°C烘烤滅菌2h備用，用以營造相對厭氧的環境有利志賀菌的增殖。5、木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂平板(XLD):成分瓊脂13. 5g，乳糖7. 5g，蔗糖
7.5g,硫代硫酸鈉6. 8g, L-賴氨酸5. Og,氯化鈉5. Og,木糖3. 5g,酵母浸出物3. Og,脫氧膽酸鈉2. 5g，枸櫞酸鐵銨O. 8g，酚紅O. 08g，蒸餾水1000ml，加熱溶解后矯正pH至7. 5±0· 2(按冷卻至25°C后測量值為標準)。經15磅壓力15分鐘(121°C)滅菌后傾注無菌平皿置冰箱中，備用。
6、酶顯色瓊脂平板成分瓊脂17. 0g，胰化酪蛋白胨lO.Og，蛋白胨10. 0g，酵母浸出物3. Og,氯化鈉5. Og, 5-溴-4-氯-3-吲哚-β -D-吡喃半乳糖苷250mg,辛酸鹽250mg,磺胺抑制劑0. 5g,蒸懼水1000ml。酶顯色瓊脂平板配方的配制取瓊脂粉5g、胰蛋白胨10g、蛋白胨10g、酵母粉3g、氯化鈉5g置990ml蒸餾水中加熱溶解煮沸2次后，稱取5-溴-4-氯-3-吲哚-β -D-吡喃半乳糖苷250mg溶解于5mlTri. HCl (ρΗ8· 0)，稱取辛酸鹽250mg溶解于5ml蒸餾水中，待加熱培養基冷卻至50°C—并加入酶底物溶液后混勻，調整pH至7.2 (按冷卻至25°C后測量值為標準)。傾注無菌平板置冰箱中，備用。7、志賀菌生化鑒定管配方
第一管成分瓊脂14. Og,牛肉膏2. Og,酵母浸出物2. Og,葡萄糖I. Og,蛋白胨15. Og,甘露醇10. Og,尿素10. Og,重量百分濃度為0. 2%麝香草酚藍溶液10ml，重量百分濃度為
0.2%溴麝香草酚藍溶液12. 5ml，重量百分濃度為0. 2%甲酚紅溶液4ml，蒸餾水1000ml ； 第一管配制
I)、取瓊脂14. 0g、牛肉膏2. Og及蒸餾水1000ml，混合后加熱溶解，并用數層紗布過濾。2)、再取酵母浸出粉2. 0g、葡萄糖I. 0g、蛋白胨15. 0g、甘露醇10. Og及尿素
10.0g，混入已溶解的瓊脂中。充分搖勻，使全部溶解。再加入重量百分濃度為15%氫氧化鈉約I. 5ml，矯正pH至7. I (按冷卻至25°C后測量值為標準)。3)、然后加入指示劑重量百分濃度為0. 2%溴麝香草酚藍溶液12. 5ml、重量百分濃度為0. 2%甲酚紅溶液4ml、重量百分濃度為0. 2%麝香草酚藍溶液10ml。4)、混合后,充分搖勻。分裝于13X IOOmm的試管內，每管約3ml。5)、置高壓滅菌器內，經10磅壓力10分鐘的滅菌。6)、滅囷后,制成斜面,底部宜厚。待凝固后，直于冰箱中，備用。表I指示劑所需量及其配制
指示劑名稱 I所需重量I加N/20氫氧化鈉溶液I蒸餾水量I敏感范圍(pH) I色澤改變(酸一堿)
溴麝香草酉分藍 O- 2g 6. 4ml_93. 6ml 6. Q-7. 6_黃一藍_
甲酚紅10.6ml89.4ml~ 7.2-8.8黃一紅
麝香草g分藍 |o.2g |8.6ml|91.4ml |l. 2-2.8I紅一黃—
第二管成分瓊脂3. 0g，胰化酪蛋白胨10. 0g，蛋白胨10. 0g，氯化鈉5. 0g，重量百分濃度為10%Na2HP042. 5ml，蔗糖10. 0g，重量百分濃度為1%硫代硫酸鈉溶液2. 5ml，重量百分濃度為0. 2%溴麝香草酚藍溶液5ml，蒸餾水1000ml。第二管的配制
I)、取瓊脂3. 0g，加入IOOOrnl的蒸餾水中，加熱溶解，并用數層紗布過濾。
2)、再取胰化酪蛋白胨lO.Og、蛋白胨lO.Og、氯化鈉5. Og、重量百分濃度為10%Na2HP042. 5ml、蔗糖10. Og及硫代硫酸鈉溶液2. 5ml，混合后，加入已溶解的瓊脂中，充分搖勻，使全部溶解，再加入重量百分濃度為15%氫氧化鈉溶液約I. 5ml左右，矯正pH至7. 6(按冷卻至25°C后測量值為標準)。3)、溴麝香草酚藍的配制取溴麝香草酚藍0. 2g、N/10氫氧化鈉溶液5ml及蒸餾水95ml,混合后，放在掠色瓶中，備用。4)、加重量百分濃度為0. 2%溴磨香草酹藍5ml。充分搖勻，分裝于13X IOOmm的試管內，每管約3ml。5)、置高壓滅菌器內，經10磅壓力10分鐘的滅菌，取出后，置于冰箱中，備用。8、硫化氫濾紙條硫化氫濾紙條的制備選取細薄的濾紙剪成3X 50mm的長條，浸在飽和的醋酸鉛溶液中(重量百分濃度為35%醋酸鉛飽和)，取出后放于平皿中，置56°C烘箱中約3h，烤干備用。如硫化氫陽性，此紙條在試管內懸掛末端顯黑色。
9、吲哚濾紙條Π引哚濾紙條的制備濾紙條(同上述大小)浸于對一二甲氨基苯甲醒5. 0g、甲醇50ml、磷酸IOml的混合液中，取出后放于平皿中，置56°C烘箱中約4h,稍微烤干即取出，保存室溫內備用。此紙條經對一二甲氨基苯甲醛染成淡黃色，如靛基質陽性，此紙條在試管內懸掛末端顯紅色。志賀菌分離、鑒定的試劑盒使用方法
I、標本采集和處理
I)、糞便挑取糞便標本直接接種木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂平板，36°c培養18h-24h觀察菌落生長結果；若有典型菌落生長者分別挑選2-3個單個菌落同時于接種志賀菌生化鑒定管和酶顯色瓊脂平板，36°C培養18h-24h觀察，判斷依據見表2 :
表2簡易生化和特異性酶-底物反應試驗結果
權利要求
1.志賀菌同步分離、鑒定的試劑盒，包括通用型非選擇性增菌液、10倍濃縮通用型非選擇性增菌液、志賀菌增菌液、木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂平板、酶顯色瓊脂平板、志賀菌生化鑒定管、硫化氫濾紙條和吲哚濾紙條，其特征是還包括液體石蠟油。
2.權利要求I所述志賀菌同步分離、鑒定的試劑盒制備方法，首先包括通用型非選擇性增菌液、10倍濃縮通用型非選擇性增菌液、志賀菌增菌液、木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂平板、酶顯色瓊脂平板、志賀菌生化鑒定管、硫化氫濾紙條和吲哚濾紙條制備，其特征是還包括使用液體石蠟油營造相對厭氧的環境有利志賀菌的增殖步驟液體石蠟油商品化化學純礦物油或液體石蠟油分裝12ml/管，置65°C烘烤滅菌2h備用。
3.權利要求I所述試劑盒在水中志賀菌同步分離、鑒定中的應用。
4.權利要求I所述試劑盒在食品中志賀菌同步分離、鑒定中的應用。
全文摘要
本發明是針對腸道病原菌中志賀菌屬的試劑盒和使用方法，主要解決現有志賀菌分離方法存在的漏檢率高、鑒定步驟繁復且成本較高、篩選結果不夠直觀的技術難題。本發明試劑盒包括通用型非選擇性增菌液、10倍濃縮通用型非選擇性增菌液、志賀菌增菌液、木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂平板、酶顯色瓊脂平板、志賀菌生化鑒定管、硫化氫濾紙條和吲哚濾紙條，其特征是還包括液體石蠟油。利用選擇性分離培養基對應生長的典型菌落形態、簡易生化和特異性酶-底物反應組合試驗鑒定所有志賀菌。
文檔編號C12R1/01GK102816828SQ20121026844
公開日2012年12月12日 申請日期2012年8月1日 優先權日2012年8月1日
發明者許學斌, 袁政安, 金匯明 申請人:上海市疾病預防控制中心