專利名稱：一種人外周血免疫細胞庫的構建方法
技術領域：
本發明涉及一種細胞庫的構建方法，尤其涉及一種人外周血免疫細胞庫的構建方法。
背景技術：
免疫細胞是指與免疫應答有關的所有細胞，主要包括T細胞、B細胞、殺傷細胞、自然殺傷細胞、單核細胞等。近年來腫瘤和病毒的免疫治療技術已經慢慢的應用到了臨床。如腫瘤疫苗和過繼免疫療法，這些方法主要是通過自體的免疫細胞經體外刺激、培養、擴增然后回輸來提高患者的免疫力，目前該類細胞主要有DC，CIK, NK, DC-CIK等。這些免疫細胞治療都主要是取自患者自己的外周血，通過得到外周血單個核細胞然后經過一系列的操作來實現的，但是一般接受免疫細胞治療的群體主要是腫瘤或病毒感染人群，一般此類人的年齡較大，并且患有疾病，其本身的免疫細胞的機能已經十分低下，此時分離出的免疫細胞的活性非常不理想。所以，在年輕時免疫能力強的時候分離出免疫細胞并保存起來具有非常大的意義。為了便于人們有效儲存和使用組織和細胞資源，目前在世界范圍內已經有多種細胞庫或組織庫建立，比如臍血造血干細胞庫，間充質干細胞庫等細胞庫。所謂細胞庫是在約為-196°C液氮中儲存細胞及搜集相關資料的場所。然而，檢索表明目前尚無人自體外周血免疫細胞庫建立，因此，構建人成體外周血免疫細胞庫，將人健康或者年輕時的免疫細胞通過一定方法建庫，是充分保存和利用現有免疫細胞資源的有效方法，它為存儲者本人在需要采用免疫細胞治療技術時提供有力的支持，具有重要意義。目前，要凍存人外周血免疫細胞，通常是直接凍存人外周血單個核細胞。但是，人外周血單個核細胞成分復雜，既有免疫細胞又有非免疫細胞，即使是免疫細胞，也是多種類型細胞的組合，這些細胞對凍存條件要求各有不同，若將它們直接一起凍存，因凍存條件不是最適，凍存的單個核細胞復蘇時活率十分不理想，不能滿足臨床要求。同時，目前凍存細胞的凍存液，一般都含有胎牛血清，胎牛血清含有多種蛋白，且和人體相比屬于異種蛋白，應用上存在隱患。也有報道使用無血清凍存液，但無血清凍存液價格昂貴，且成分復雜，難以臨床推廣。

發明內容
針對現有技術的不足，本發明的目的是提供一種人外周血免疫細胞庫的構建方法。本發明所述人外周血免疫細胞庫的構建方法，步驟包括采集人外周血，分離自體血漿，分離外周血單個核細胞，由外周血單個核細胞分離單核細胞并凍存，由外周血單個核細胞分離T淋巴細胞并凍存，由外周血單個核細胞分離B淋巴細胞并凍存，由外周血單個核細胞分離NK細胞并凍存，編碼入庫；其特征在于所述人外周血采集前,供體應查體符合獻血標準；、
所述分離自體血漿的方法是將采集的外周血轉到離心管中，以1000-2500轉/分鐘離心5 15分鐘，取上清液得到自體血漿，56°C滅活30分鐘后，置_20°C凍存，備用；所述分離外周血單個核細胞的方法是將上述去除自體血漿后的沉淀物按體積量計用生理鹽水或PBS稀釋I倍，再加入其0. 5 2倍體積量的lwt% 6wt%的羥乙基淀粉溶液，混勻后靜置10 40分鐘，分離出上清，并將上清液加入到等體積量的淋巴細胞分離液液面上，2000 5000轉/分離心10 30分鐘，離心后管內分三層，取中間層細胞即得到外周血單個核細胞；所述分離單核細胞并凍存的方法是將得到的外周血單個核細胞按照0. I IOXlOVml的密度懸浮在組分為10 wt%FBS+90 wt%1640的培養基中，并按照30ml/瓶的量分裝在滅菌的150cm2細胞培養瓶中，靜置Ih 5h，然后吸取上清液，備用；剩余貼壁細胞即為單核細胞，用生理鹽水或PBS將貼壁的單核細胞吹打下來，800 1500轉/分離心5 10分鐘后，以I IOX IO5的密度進行分裝并液氮凍存，凍存液配方為10 wt%DMSO+6wt9^5乙基淀粉+84 wt%自體血漿； 所述分離T淋巴細胞的方法是采用免疫磁珠法對分離單核細胞收集的上清液進行T淋巴細胞分選，免疫磁珠法采用正分選法，抗體選用CD3抗體，分離出T淋巴細胞后800 1500轉/分離心5 10分鐘，再以0. I IOXlO7的密度進行分裝并液氮凍存，凍存液配方為10 wt%DMS0+6 wt%甲基纖維素400CP+84 wt%自體血漿；所述分離B淋巴細胞的方法是繼續用分離T淋巴細胞的方法對分離單核細胞收集的上清液進行B淋巴細胞分選，同樣采用正分選法，抗體采用CD19或CD20，分離出B淋巴細胞后800 1500轉/分離心5 10分鐘，再以0. I IOXlO7的密度進行分裝并液氮凍存，凍存液配方為10 wt%DMS0+6 wt%S旋糖酐40+84 wt%自體血漿；所述分離NK細胞的方法是繼免疫磁珠法分離T和B淋巴細胞后，剩余的細胞即為NK細胞，將所述細胞800 1500轉/分離心5 10分鐘后，以0. I IOX IO6的密度進行分裝并液氮凍存，凍存液配方為10 wt%DMS0+6 wt%海藻糖+84 wt%自體血漿；所述編碼入庫的方法是對分離并凍存的各種細胞按照每人一組系統編號，并將個人信息包括編號和保存位置信息統一輸入計算機，用于管理與檢索。上述人外周血免疫細胞庫的構建方法中所述分離外周血單個核細胞的方法優選是將去除自體血漿后的沉淀物按體積量計用生理鹽水或PBS稀釋I倍，再加入其0. 5倍體積量的4wt%的羥乙基淀粉溶液，混勻后靜置30分鐘，分離出上清，并將上清液加入到等體積量的淋巴細胞分離液液面上，3000轉/分離心20分鐘，離心后管內分三層，取中間層細胞即得到外周血單個核細胞。本發明提供的人外周血免疫細胞庫的構建方法把健康或青年人的免疫細胞分離出單核細胞、T淋巴細胞、B淋巴細胞和NK樣T細胞，并分別單獨凍存，關聯編號保存入庫，使保存的人免疫細胞具有活性高、純度高、使用方便的特點，并且在制備人外周單個核細胞時，本發明分離出人體血漿，用人自體血漿可以代替胎牛血清使用，避免了引入外源蛋白。本發明與現有技術相比，具有以下優點利用本發明建立的免疫細胞庫，免疫細胞在凍存前處于最佳活性時刻，在保存人使用本庫保存的免疫細胞進行自體免疫細胞治療時，細胞活性比當時采血分離的免疫細胞活性要強。
利用本發明建立的免疫細胞庫，庫中保存的是各免疫細胞亞群，使用時更加方便，可以直接復蘇某一亞群的免疫細胞來進行誘導，擴增。本發明方法具有成本低、實驗室條件要求不高，應用前景廣闊，并為臨床或理論研究提供了大量的細胞資源基礎。


圖I本發明所述人外周血免疫細胞庫的構建方法流程圖。
具體實施方式
·實施例I人外周血免疫細胞庫的構建方法( I )、采集人外周血對供著進行體檢，按照獻血標準對其進行檢查，符合標準者兩天后抽血；(2)、分離自體血漿將抽取的外周血轉移到離心管中，在離心機中以1500轉/分離心10分鐘，取上清液，56°C滅活30分鐘，完成后置_20°C凍存，備用。(3)、分離外周血單個核細胞將上述步驟去除自體血漿后的沉淀物按體積量計用生理鹽水或PBS稀釋I倍，再加入其0. 5倍體積量的4wt%的羥乙基淀粉溶液，混勻后靜置30分鐘，分離出上清，并將上清液加入到等體積量的淋巴細胞分離液液面上，3000轉/分離心20分鐘，離心后管內分三層，取中間層細胞即得到外周血單個核細胞。(4)、分離單核細胞并凍存將步驟3得到的單個核細胞按照0. 1-10XlOVml的密度懸浮在分為10wt%FBS+90wt%1640的培養基中，并按照30ml/瓶的量分裝在滅菌的150cm2細胞培養瓶中，靜置4h 5h，然后吸取上清液，備用；剩余貼壁細胞即為單核細胞。用生理鹽水或PBS將貼壁的單核細胞輕輕吹打下來，1200轉/分離心10分鐘，后以I IOX IO5的密度進行分裝并液氮凍存，凍存液配方為10wt%DMS0+6wt%羥乙基淀粉+84wt%自體血漿。(5)、分離T淋巴細胞采用免疫磁珠法分選出步驟4中吸取的上清液中的T淋巴細胞，免疫磁珠法采用正分選法，抗體選用CD3抗體，分離出T淋巴細胞后1200轉/分離心10分鐘，后以0. I IOXlO7的密度進行分裝并液氮凍存，凍存液配方為10wt%DMS0+6wt%甲基纖維素400CP+84wt%自體血漿。(6)、分離B淋巴細胞繼續用分離T淋巴細胞的方法對分離單核細胞收集的上清液進行B淋巴細胞分選，同樣采用正分選法，采用抗體為CD19或CD20，分離出B淋巴細胞后1200轉/分離心10分鐘，后以0. I-IOXlO7的密度進行分裝并液氮凍存，凍存液配方為10wt%DMS0+6wt%右旋糖酐40+84wt%自體血漿。(7)、分離NK細胞繼免疫磁珠法分離T和B淋巴細胞后，剩余的細胞為NK細胞，將所述細胞1200轉/分離心10分鐘后，以0. I IOX IO6的密度進行分裝并液氮凍存，凍存液配方為10wt%DMS0+6wt%海藻糖+84wt%自體血衆。(8)、編碼入庫對分離并凍存的各種細胞按照每人一組系統編號，并將個人信息包括編號和保存位置信息統一輸入計算機，用于管理與檢索。實施例2人外周血免疫細胞庫的構建方法( I )、采集人外周血對供著進行體檢，按照獻血標準對其進行檢查，符合標準者兩天后抽血；
(2)、分離自體血漿將抽取的外周血轉移到離心管中，在離心機中以2500轉/分離心5分鐘，取上清液，56°C滅活30分鐘，完成后置_20°C凍存，備用。(3)、分離外周血單個核細胞將上述步驟去除自體血漿后的沉淀物按體積量計用生理鹽水或PBS稀釋I倍，再加入其I倍體積量的3wt%的羥乙基淀粉溶液，混勻后靜置40分鐘，分離出上清，并將上清液加入到等體積量的淋巴細胞分離液液面上，4000轉/分離心15分鐘，離心后管內分三層，取中間層細胞即得到外周血單個核細胞。(4)、分離單核細胞并凍存將步驟3得到的單個核細胞按照0. 1-10XlOVml的密度懸浮在分為10wt%FBS+90wt%1640的培養基中，并按照30ml/瓶的量分裝在滅菌的150cm2細胞培養瓶中，靜置5h，然后吸取上清液，備用；剩余貼壁細胞即為單核細胞。用生理鹽水或PBS將貼壁的單核細胞輕輕吹打下來，1500轉/分離心5分鐘，后以I 10 X IO5的密度進行分裝并液氮凍存，凍存液配方為10wt%DMS0+6wt%羥乙基淀粉+84wt%自體血漿。(5)、分離T淋巴細胞采用免疫磁珠法分選出步驟4中吸取的上清液中的T淋巴細胞，免疫磁珠法采用正分選法，抗體選用CD3抗體，分離出T淋巴細胞后1500轉/分離心 5分鐘，后以0. I IOX IO7的密度進行分裝并液氮凍存，凍存液配方為10wt%DMS0+6wt%甲基纖維素400CP+84wt%自體血漿。(6)、分離B淋巴細胞繼續用分離T淋巴細胞的方法對分離單核細胞收集的上清液進行B淋巴細胞分選，同樣采用正分選法，采用抗體為CD19或CD20，分離出B淋巴細胞后1500轉/分離心5分鐘，后以0. 1-10 X IO7的密度進行分裝并液氮凍存，凍存液配方為10wt%DMS0+6wt%右旋糖酐40+84wt%自體血漿。(7)、分離NK細胞繼免疫磁珠法分離T和B淋巴細胞后，剩余的細胞為NK細胞，將所述細胞1500轉/分離心5分鐘后，以0. I IOX IO6的密度進行分裝并液氮凍存，凍存液配方為10wt%DMS0+6wt%海藻糖+84wt%自體血衆。(8)、編碼入庫對分離并凍存的各種細胞按照每人一組系統編號，并將個人信息包括編號和保存位置信息統一輸入計算機，用于管理與檢索。
權利要求
1.一種人外周血免疫細胞庫的構建方法，步驟包括采集人外周血，分離自體血漿，分離外周血單個核細胞，由外周血單個核細胞分離單核細胞并凍存，由外周血單個核細胞分離T淋巴細胞并凍存，由外周血單個核細胞分離B淋巴細胞并凍存，由外周血單個核細胞分離NK細胞并凍存，編碼入庫；其特征在于 所述人外周血采集前，供體應查體符合獻血標準； 所述分離自體血漿的方法是將采集的外周血轉到離心管中，以1000-2500轉/分鐘離心5 15分鐘，取上清液得到自體血漿，56°C滅活30分鐘后，置_20°C凍存，備用； 所述分離外周血單個核細胞的方法是將上述去除自體血漿后的沉淀物按體積量計用生理鹽水或PBS稀釋I倍，再加入其0. 5 2倍體積量的lwt% 6wt%的羥乙基淀粉溶液，混勻后靜置10 40分鐘，分離出上清，并將上清液加入到等體積量的淋巴細胞分離液液面上，2000 5000轉/分離心10 30分鐘，離心后管內分三層，取中間層細胞即得到外周血單個核細胞； 所述分離單核細胞并凍存的方法是將得到的外周血單個核細胞按照0. I 10X107/ml的密度懸浮在組分為10 wt%FBS+90 wt%1640的培養基中，并按照30ml/瓶的量分裝在滅菌的150cm2細胞培養瓶中，靜置Ih 5h，然后吸取上清液，備用；剩余貼壁細胞即為單核細胞，用生理鹽水或PBS將貼壁的單核細胞吹打下來，800 1500轉/分離心5 10分鐘后，以I IOXlO5的密度進行分裝并液氮凍存，凍存液配方為10 Wt%DMS0+6Wt°/c^5乙基淀粉+84 wt%自體血楽； 所述分離T淋巴細胞的方法是采用免疫磁珠法對分離單核細胞收集的上清液進行T淋巴細胞分選，免疫磁珠法采用正分選法，抗體選用CD3抗體，分離出T淋巴細胞后800 1500轉/分離心5 10分鐘，再以0. I IOXlO7的密度進行分裝并液氮凍存，凍存液配方為10 wt%DMSO+6 wt%甲基纖維素400CP+84 wt%自體血漿； 所述分離B淋巴細胞的方法是繼續用分離T淋巴細胞的方法對分離單核細胞收集的上清液進行B淋巴細胞分選，同樣采用正分選法，抗體采用⑶19或⑶20，分離出B淋巴細胞后800 1500轉/分離心5 10分鐘，再以0. I IOX IO7的密度進行分裝并液氮凍存，凍存液配方為10 wt%DMSO+6 wt%S旋糖酐40+84 wt%自體血漿； 所述分離NK細胞的方法是繼免疫磁珠法分離T和B淋巴細胞后，剩余的細胞即為NK細胞，將所述細胞800 1500轉/分離心5 10分鐘后，以0. I IOX IO6的密度進行分裝并液氮凍存，凍存液配方為10 wt%DMSO+6 wt%海藻糖+84 wt%自體血漿； 所述編碼入庫的方法是對分離并凍存的各種細胞按照每人一組系統編號，并將個人信息包括編號和保存位置信息統一輸入計算機，用于管理與檢索。
2.如權利要求I所述人外周血免疫細胞庫的構建方法，其特征在于所述分離外周血單個核細胞的方法是將去除自體血漿后的沉淀物按體積量計用生理鹽水或PBS稀釋I倍，再加入其0. 5倍體積量的4wt%的羥乙基淀粉溶液，混勻后靜置30分鐘，分離出上清，并將上清液加入到等體積量的淋巴細胞分離液液面上，3000轉/分離心20分鐘，離心后管內分三層，取中間層細胞即得到外周血單個核細胞。
全文摘要
本發明公開了一種人外周血免疫細胞庫的構建方法，步驟包括采集人外周血，分離自體血漿，分離外周血單個核細胞，由外周血單個核細胞分離單核細胞并凍存，由外周血單個核細胞分離T淋巴細胞并凍存，由外周血單個核細胞分離B淋巴細胞并凍存，由外周血單個核細胞分離NK細胞并凍存，編碼入庫。本發明把健康或青年人的免疫細胞分離出，并分別單獨凍存，關聯編號保存入庫，使保存的人免疫細胞具有活性高、純度高、使用方便的特點，并且用人自體血漿可以代替胎牛血清使用，避免了引入外源蛋白。同時本發明方法具有成本低、實驗室條件要求不高，應用廣的優勢。
文檔編號C12N5/0783GK102758259SQ20121026973
公開日2012年10月31日 申請日期2012年7月30日 優先權日2012年7月30日
發明者李財新, 王肇光, 田甜, 蔡平平, 薛書奎, 邢曉, 陳莉 申請人:濟南賽爾生物科技有限公司