專利名稱：一種小肽螯合鋅復合物的制備方法與應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及ー種小肽螯合鋅復合物的制備方法與應用。
背景技術：
動物為了保證每ー個細胞，組織，器官，腺體及系統的正常功能需要特定的微量元素，微量元素是動物不可缺少的營養物質，日糧中添加一定高質量、高利用率的微量元素對動物健康和最大限度發揮其生產潛カ具有十分重要的作用(NRC，1998 ；Richards,2008)。鋅是動物體內很多酶的組成成分，也是某些酶的激活劑。例如鋅參與糖代謝，每一個胰島素分子內含有兩個鋅原子，鋅與胰島素的產生、分泌、貯存以及胰島素的活性有密切的關系；參與紅細胞運送氧氣和ニ氧化碳有關的酶中也有鋅。鋅與核酸及蛋白質的合成 及對細胞的生長有密切的關系。含鋅酶參與骨骼生長與營養物質代謝；鋅還是維持皮膚正常生長所必需的元素。缺鋅影響生長發育，缺鋅可使毛發色素變淡、指甲上出現白斑。由于無機微量元素之間存在相互拮抗作用，比如銅、鋅之間，鐵、鋅之間，導致吸收利用率降低。人們多超量添加希望解決缺乏問題，但不僅效果有限，還產生了對環境的污染(Cao，1997)。微量元素的缺乏能夠導致許多動物代謝甚至臨床疾病的發生。在家畜和禽類生產過程中，微量元素的缺乏直接導致生長緩慢和飼料轉化效率下降(NRC，1998)。現在有機微量元素已成為國內外飼料及養埴行業研究的熱點。有機微量元素的生物及經濟價值已經在動物養殖業得到體現，特別是在母豬、奶牛、種禽上，對提高種用畜禽繁殖率、延長利用年限(母豬至少ー胎)、解決蹄病、改善健康、提升外賣動物表觀價值等具有特殊貢獻(Cao et al.,2000;敖志剛譯，2010 ;刁其玉，2010)。研究顯示母豬飼喂有機鐵可通過胎盤轉送到胚胎中，可顯著提高胎兒血液的鐵含量(王學梅2002 ；Peters and Mahan, 2008)。Nollet等(2007)在仔雞日糧中添加有機微量元素，其飼料利用率顯著提高，糞便中微量元素的排泄量降低，Mn、Zn、Fe和Cu的排泄量可以分別降低54，37，27，和45%。Castillo等(2008)將有機鋅用于乳豬教槽料，提高了飼料的利用效率。Andrieu (2009)綜述強調使用有機鋅、銅和硒能有效地降低反芻動物乳房炎發病率，減少蹄病發生，提高繁殖性能。大量研究表明，在不同動物中使用有機微量元素均可提聞動物的生長、繁通性能，提聞動物抵御疾病的能力。目前，市場上常見的有機微量元素主要為有機酸類微量元素和氨基酸螯合微量元素。從上世紀80年代開始出現以富馬酸鐵，葡萄糖酸鋅等為代表的有機酸類微量元素。第ニ代的簡單有機鹽，雖然穩定性好，但與部分營養物質仍會發生拮抗作用。在消化吸收過程中受影響的因素也較多，生物學利用率仍較低。金屬離子與氨基酸分子通過配位鍵結合后，使其分子內電荷趨于中性，形成了較穩定的化學結構(黃雪等，2008 ;)。但在瘤胃或單胃內酸環境下的穩定性問題一致沒有很好地解決(梁建光等，2008)。因此，研發ー類生物學利用率高，在瘤胃或單胃內酸環境下的穩定性好的有機微量元素具有十分重要的市場意義。

發明內容
本發明的目的在于提供ー種小肽螯合鋅復合物的制備方法。本發明所采用的技術方案是
ー種小肽螯合鋅復合物的制備方法，包括如下步驟
1)將蛋白原料、碳源和水配制成培養液，滅菌；
2)將芽孢菌接種到滅菌后的培養液中，30 37°C下振蕩培養18 30h后，加入蛋白酶，35 50°C，pH6. O 7. 5，繼續酶解6 12h，得到小肽發酵液；或者是往培養液中加入蛋白酶，35 50°C，pH6. O 7. 5，酶解6 12h后，接種芽孢菌，30 37°C下繼續振蕩培養18 30h，得到小肽發酵液； 3)測定小肽發酵液中小肽的含量，滅酶后，繼續加入水溶性鋅鹽，混合均勻，控制反應溫度在55 65 °C，pH為5 6，進行螯合反應；
4)將反應產物干燥，得到小肽螯合鋅復合物。所述蛋白原料為豆柏、大米蛋白粉、小麥蛋白粉、玉米蛋白粉、棉柏、花生柏、馬鈴薯蛋白、菜柏、大豆濃縮蛋白中的至少ー種。所述碳源為葡萄糖、蔗糖、淀粉中的至少ー種。以上原料均可在原料市場購得。姆IOOml培養液中，含有蛋白原料20 30g、碳源O. I lg。所述芽孢菌為地衣芽孢桿菌iBaciIlus Iicheniformis)或/和枯草芽孢桿菌{BeilIus subtilis、或 I 和納豆芽抱桿菌CfeciBw1S natto、。所述芽孢菌的接種濃度為5 X IO7 IOX 107cfu/ml培養液。所述蛋白酶為中性蛋白酶，加入量為400 700 U/g蛋白原料。步驟3)中，小肽與水溶性鋅鹽的摩爾比為I 3 :1。所述水溶性鋅鹽為硫酸鋅、氯化鋅、碳酸鋅、こ酸鋅中的至少ー種。上述方法制備得到的小肽螯合鋅復合物作為飼料添加劑的應用。本發明的有益效果在于
本發明小肽螯合鋅制備方法的螯合率高，達到94%以上，所得到的小肽螯合鋅復合物在動物胃內的穩定性好，營養更加全面，可用作飼用添加剤，補充日糧的微量元素，提高動物體的免疫機能。


圖I是標準蛋白的分子量和出峰時間曲線2是小肽發酵液凝膠G-15洗脫圖譜。
具體實施例方式以下實施例中所用到的菌液按以下方法制備
從斜面試管培養基中刮取ー環地衣芽孢桿菌(ガaciBiAs Iicheniformis)或枯草芽孢桿菌iBcillus JrY1S)或納豆芽孢桿菌{Bacillus菌種加入到液體培養基中,搖
瓶培養。搖瓶種子培養基與培養條件為葡萄糖1%、酵母膏O. 5%、蛋白胨O. 5%、牛肉膏O. 5%、食鹽O. 05%、磷酸ニ氫鉀O. 1%。pH=7. 0-7. 2、121°C滅菌18分鐘。于32°C恒溫搖床中，200r/min振蕩培養24h，得到菌種液。以上三個菌種購自廣東省微生物菌種保藏中心，地衣芽孢桿菌(McilliisIi cheni formi s )和枯草芽抱桿菌subtil is、的編號分別為 GIM1. 8=AS1. 518,GIM1. 19=AS1. 210。以下實施例中所用到的中性蛋白酶購自肇東市日成酶制劑有限公司，商品型號為AS. 1398，酶活力為 50000U/g。以下實施例中所用到的檢測方法和計算公式如下所示
一、檢測小肽發酵液中小肽的含量及小肽轉化率
I、原理 小肽發酵液中的大分子蛋白質和肽鏈較長的多肽用三氯醋酸溶液進行沉淀，并將其中的短鏈小肽用酸溶解出來，其中包括小肽和部分α-氨基酸。然后經離心、過濾、消化、蒸懼，測定其蛋白質含量即酸溶蛋白。本方法參照大豆肽粉(Soy peptides powder)中華人民共和國輕エ行業標準(QB/ T 2653 -2004)修訂而成。2、試劑及儀器
IOOml燒杯；10ml，25ml移液管；半微量粗蛋白質測定試劑和裝置；15%三氯醋酸溶液(TCA溶液)；4500轉/分鐘的離心機。3、方法
取樣將小肽發酵液攪拌均勻后，取IOml樣品，80°C烘干，準確稱重，用于測定小肽含量，重復三次。具體步驟如下
樣品用水溶解，用玻璃棒攪拌均勻，無損的移入IOOml容量瓶中，定容至刻度(100 ml總樣本液)靜止10分鐘。搖動容量瓶取15ml渾濁液用離心機4500轉離心10分鐘，取IOml上清液注入試管管中，再加入15%三氯醋酸10ml，靜止沉降15分鐘后，用定性濾紙過濾。取濾液IOml (相當于用于消化的樣本液為5ml)注入干燥的消化管中，加入硫酸銅O. 2g，硫酸鈉3g，再加濃硫酸10ml，消化方法及蒸餾方法與凱氏定氮法相同。樣品中肽含量的計算公式
權利要求
1.ー種小肽螯合鋅復合物的制備方法，包括如下步驟1)將蛋白原料、碳源和水配制成培養液，滅菌；2)將芽孢菌接種到滅菌后的培養液中，30 37°C下振蕩培養18 30h后，加入蛋白酶，35 50°C，pH6. O 7. 5，繼續酶解6 12h，得到小肽發酵液；或者是往培養液中加入蛋白酶，35 50°C，pH6. O 7. 5，酶解6 12h后，接種芽孢菌，30 37°C下繼續振蕩培養18 30h，得到小肽發酵液；3)測定小肽發酵液中小肽的含量，滅酶后，繼續加入水溶性鋅鹽，混合均勻，控制反應溫度在55 65 °C，pH為5 6，進行螯合反應；4)將反應產物干燥，得到小肽螯合鋅復合物。
2.根據權利要求I所述的小肽螯合鋅復合物的制備方法，其特征在于所述蛋白原料為豆柏、大米蛋白粉、小麥蛋白粉、玉米蛋白粉、棉柏、花生柏、馬鈴薯蛋白、菜柏、大豆濃縮蛋白中的至少ー種。
3.根據權利要求I所述的小肽螯合鋅復合物的制備方法，其特征在于所述碳源為葡萄糖、蔗糖、淀粉中的至少ー種。
4.根據權利要求I所述的小肽螯合鋅復合物的制備方法，其特征在于每IOOml培養液中，含有蛋白原料20 30g、碳源O. I lg。
5.根據權利要求I所述的小肽螯合鋅復合物的制備方法，其特征在于所述芽孢菌為地衣芽抱桿菌{Bacillus licheniformi s')或/和枯草芽抱桿菌iBcillus subtil is)或/和納豆芽抱桿菌(ifeciBiAs natto)。
6.根據權利要求I所述的小肽螯合鋅復合物的制備方法，其特征在于所述芽孢菌的接種濃度為5 X IO7 IOX 107cfu/ml培養液。
7.根據權利要求I所述的小肽螯合鋅復合物的制備方法，其特征在于所述蛋白酶為中性蛋白酶，加入量為400 700 U/g蛋白原料。
8.根據權利要求I所述的小肽螯合鋅復合物的制備方法，其特征在于步驟3)中，小肽與水溶性鋅鹽的摩爾比為I 3 :1。
9.根據權利要求I所述的小肽螯合鋅復合物的制備方法，其特征在于所述水溶性鋅鹽為硫酸鋅、氯化鋅、碳酸鋅、こ酸鋅中的至少ー種。
10.權利要求I 9任ー項的方法制備得到的小肽螯合鋅復合物作為飼料添加劑的應用。
全文摘要
本發明公開了一種小肽螯合鋅復合物的制備方法與應用。制備方法包括如下步驟將蛋白原料、碳源和水配制成培養液，滅菌；將芽孢菌和蛋白酶接種到滅菌后的培養液中，發酵酶解或酶解發酵，得到小肽發酵液；繼續加入水溶性鋅鹽，控制反應溫度在55～65℃，pH為5～6，螯合反應；將反應物干燥，得到小肽螯合鋅復合物。本發明小肽螯合鋅制備方法的螯合率高，達到94%以上，所得到的小肽螯合鋅復合物在動物胃內的穩定性好，并含有多種生物活性成分，營養更加全面，可用作飼用添加劑，補充日糧的微量元素，提高動物體的免疫機能。
文檔編號C12R1/07GK102827909SQ20121027291
公開日2012年12月19日 申請日期2012年8月2日 優先權日2012年8月2日
發明者潘軍, 張偉強, 王瑞平, 蘇全, 馬春平 申請人:廣州市博善生物飼料有限公司