專利名稱：水產(chǎn)養(yǎng)殖鲇魚雜種的CH₄分子標(biāo)記DGGE鑒定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及魚類雜種的分子標(biāo)記鑒定方法，具體涉及水產(chǎn)養(yǎng)殖鲇魚雜種的CH4分子標(biāo)記DGGE鑒定方法。
背景技術(shù)：
鲇形目魚類屬肉食性底層魚類，是魚類進(jìn)化中最發(fā)達(dá)的真骨魚類之一。南方鲇(又叫大口鲇)iSilurus meridionalis Chen)和鲇asotus Linnaeus)均屬于鲇形目、鲇科、鲇屬，兩者味道鮮美、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，是我國(guó)各地主要養(yǎng)殖的高附加值經(jīng)濟(jì)魚類。南方鲇分布于我國(guó)珠江、閩江、湘江、長(zhǎng)江等水系，是一種大型兇猛的肉食性魚類，具有生長(zhǎng)快、個(gè)體大、抗病力強(qiáng)等特點(diǎn)，喜棲息于開(kāi)敞水體，以及灣花、河底礫石河段，懷卵量大，產(chǎn)卵期長(zhǎng)。鲇分布于除青藏高原及新疆外的全國(guó)各水系，體色隨棲息環(huán)境不同而有所變化，主要 棲息于江河干流或較大的支流、大型湖泊和水庫(kù)等水體的中下層，其適應(yīng)性強(qiáng)，棲息于靜水或緩流水域，個(gè)體較小，生長(zhǎng)快。南方鲇和鲇形體輪廓相似，小個(gè)體的南方鲇與鲇成體混同雜居，大個(gè)體與鲇隔離生活。據(jù)報(bào)道，人工繁殖的南方鲇群體中雄性比例非常低。調(diào)查顯示，當(dāng)雄性南方鲇缺乏時(shí)，可能進(jìn)行了雌性南方鲇與其他雄性鲇屬種類的雜交，從而在鲇魚生產(chǎn)中出現(xiàn)了物種間的雜交育種。為了滿足社會(huì)生產(chǎn)的需要，獲得兼有以上2種魚優(yōu)良性狀的苗種，王朝明等(大口鲇與鲇魚的雜交試驗(yàn)，淡水漁業(yè)，2004，34 (6): 4廣43 ;三種鲇遺傳多樣性的RAPD分析，淡水漁業(yè)，2005，35 (4) : 14 17)開(kāi)展了南方鲇與鲇的雜交育種試驗(yàn)，并做了一定的雜種鑒定工作，篩選出22個(gè)隨機(jī)引物用于南方鲇、鲇及其雜交F1代三個(gè)群體多樣性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)雜交F1代繼承了大口鲇的52條特征帶和鲇的32條特征帶。然而，其鑒定工作所采用的RAH)標(biāo)記，受方法本身的限制，檢測(cè)效率低且重復(fù)性不高，嚴(yán)重影響了這一方法的推廣使用。此外，僅有龍華等(鲇、大口鲇及其雜交鲇血液生理生化指標(biāo)比較及轉(zhuǎn)鐵蛋白等位基因分析，長(zhǎng)江大學(xué)學(xué)報(bào)(自科版)，2006，3 (2): 161^164 ；鲇、大口鲇及其雜交鲇的血型分析，水利漁業(yè)，2007，27 (3) : 19 20)對(duì)南方鲇、鲇及其雜交鲇的血液生理、血型分析及同工酶等方面的研究?？梢?jiàn)，有必要開(kāi)展南方鲇、鲇及其雜交子代的分子標(biāo)記及鑒定技術(shù)研究，為南方鲇養(yǎng)殖和育種實(shí)踐中的雜種鑒定提供可靠方法。目前，RAPD, AFLP和微衛(wèi)星都適合種群層次的種質(zhì)鑒定，但是，RAPD檢測(cè)效率低，通常嘗試數(shù)十對(duì)隨機(jī)引物才有十對(duì)左右可以使用，而且重復(fù)性不佳；AFLP重現(xiàn)性較高，能產(chǎn)生大量(通常100以上)的多態(tài)性條帶，但不易操作，在放大種間差異的同時(shí)更加劇了種內(nèi)差異，存在大量假陽(yáng)性結(jié)果，限制了雜種鑒定準(zhǔn)確性；微衛(wèi)星雖然具有種屬特異性、共顯性及高度的多態(tài)性和靈敏性，在雜種鑒定及遺傳漸滲等分析中得到了廣泛的應(yīng)用，但是用于鑒別雜種的位點(diǎn)需要具種屬特異性，在分析過(guò)程中要判斷擴(kuò)增產(chǎn)物的真實(shí)性，尤其是在鑒別近緣種雜交時(shí)，正確判斷近緣種中等位基因的大小和數(shù)目顯得特別重要，這在很大程度上增加了微衛(wèi)星的使用難度。變性梯度凝膠電泳(DGGE)技術(shù)廣泛應(yīng)用于微生物宏基因組種屬的鑒定，還從未被引入雜種鑒定領(lǐng)域。變性梯度凝膠電泳是一種在核苷酸序列中發(fā)現(xiàn)點(diǎn)突變或SNP位點(diǎn)的方法，這種電泳技術(shù)直接依據(jù)DNA序列差異產(chǎn)生的變性條件的不同而進(jìn)行，即依據(jù)片段長(zhǎng)度相同但堿基組成不同的DNA分子在含有線性變性劑梯度的構(gòu)象膠中遷移率不同而可以相互分離。通過(guò)DGGE可以分離長(zhǎng)度在500 bp以內(nèi)的具有50 %序列差異的DNA片段，而在給DNA片段的一端加上高GC含量的夾板后，甚至可以分離序列差異僅有I bp的DNA片段。在雜種鑒定領(lǐng)域，使用這種方法能在找到存在差異位點(diǎn)核基因的同時(shí)將其等位基因進(jìn)行分離，進(jìn)而在膠圖上直觀地判定物種是否存在雜交，從而提高了雜種鑒定的快捷性，并在一定程度上克服了瓊脂糖凝膠或普通的聚丙烯酰胺凝膠電泳中不能進(jìn)行等位基因分離鑒別的缺陷。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的為鑒定南方鲇與鲇的雜種，從分子生物學(xué)層面上將形態(tài)上不易區(qū)分的雜種和純種進(jìn)行分辨。本發(fā)明以南方鲇、鲇及其雜交子代為研究對(duì)象，在鲇屬魚類中篩選 設(shè)計(jì)了 CH4基因片段作為分子標(biāo)記，應(yīng)用CH4基因片段的變性梯度凝膠電泳(DGGE)檢測(cè)，成功鑒定了南方鲇、鲇及其雜交子代。CH4基因片段是免疫球蛋白重鏈編碼基因外顯子的一部分，在近緣種間高度保守。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)CH4基因片段在南方鲇與鲇之間存在種間序列差異，將CH4基因片段的變性梯度凝膠電泳(DGGE)檢測(cè)用于南方鲇、鲇及其雜交子代的鑒定，具有實(shí)驗(yàn)快捷，鑒定直觀，無(wú)需測(cè)序的優(yōu)點(diǎn)。為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用如下的技術(shù)方案
水產(chǎn)養(yǎng)殖鲇魚雜種的CH4分子標(biāo)記DGGE鑒定方法，其特征在于應(yīng)用PCR擴(kuò)增后的南方鲇的CH4基因片段與鲇的CH4基因片段之間存在的種間序列差異，鑒定南方鲇、鲇及其雜交子代。所述的水產(chǎn)養(yǎng)殖鲇魚雜種的CH4分子標(biāo)記DGGE鑒定方法，包括以下步驟
A分別取南方鲇、鲇及其雜交樣本，提取DNA ；
B分別以南方鲇、鲇及其雜交樣本的總DNA為模板，使用特定引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；
C DGGE分析檢測(cè)種間差異，經(jīng)DGGE檢測(cè)，在一個(gè)泳道上同時(shí)出現(xiàn)南方鲇和鲇的兩條基因條帶，則是南方鲇和鲇的雜交種。所述的步驟B中的特定引物為擴(kuò)增CH4基因片段的特定引物，其堿基序列為
正向引物(SEQID NO: 3) 5’ -TCCCCAAGGTTTACTTGCTCGCTCC-3’ ；
反向引物(SEQID NO:4) 5’ -CGATGGATCTGGATATGTGGCGCAC-3’ ；
且在正向引物的 5’ 末端添加了 GC 夾板(SEQID NO: 5) 5’ - CGGGGGCCGGGCCGGGCGGGCGTGGCGGGCGCTGCGGGCG-3，。所述的CH4基因片段的特定引物，所擴(kuò)增出的南方鲇的基因片段的核苷酸序列(SEQID NO:I)為
CCAGAGACTT CAGAATCAGT GACCCTGACT TGCTATGTAA AAGACTTCTA CCCTAAGGAGGTGTATGTGT CTTGGCTTGC TGATGATAAA CCAGTGGAGG GTCTGAGCTA CTATAAGGAG AACACCACCGTTCCCCAGAA TGACAAACAA TTTTCAATGT ATAGTCAGC TGATTGTTGA TTCCCAATCT TGGAAGAAAGGCGTTGTGT ACACCTGCAG GGTTTATCAC GAGTCCATCG AGGACCCA ；所述的CH4基因片段的特定引物，所擴(kuò)增出的鲇的基因片段的核苷酸序列為CCAGAGACTT CAGAATCAGT GACCCTGACT TGCTATGTAA AAGACTTCTA CCCTAAGGAGGTGTATGTGT CTTGGCTTGC TGATGATAAA CCAGTGGAGG GTCTGAGCTA CTATAAGGAG AACACCACCATTCCCCAGAA TGAGAAACAA TTTTCAATGT ATAGTCAGCT GATTGTTGAT TCCCAATCTT GGAAGAAAGGCGTTGTGTAC ACCTGCAGGG TTTATCACGA GTCCATCGAG GACCCA。所述的步驟C中的DGGE，所使用的變性梯度凝膠組分是指變性劑濃度為30%與60%的凝膠液的混合液。采用這種組合的變性梯度凝膠組分，DGGE結(jié)果理想，表現(xiàn)為條帶在凝膠中電泳充分，電泳結(jié)束時(shí)條帶位置接近中間，條帶的分離度好等。所述的步驟C中的DGGE，在恒溫60° C的IX TAE電泳緩沖液中進(jìn)行，首先在80V電壓下運(yùn)行20min，然后在150V電壓下運(yùn)行2. 5h。其優(yōu)點(diǎn)在于，在不影響結(jié)果的前提下盡量縮短電泳時(shí)間，提高效率，由于本方法是分離等位基因且不需要低電壓長(zhǎng)時(shí)間電泳，故較傳統(tǒng)的DGGE電泳時(shí)長(zhǎng)(20— 40h)縮短了很多。本發(fā)明的有益效果表現(xiàn)在· (I)本發(fā)明首次將PCR-DGGE用于雜種鑒定領(lǐng)域，具有快速直觀的優(yōu)點(diǎn)，而且尤其適用于那些缺乏相關(guān)序列信息的物種。這一方法在一定程度上不依賴于測(cè)序結(jié)果，只要選擇了合適的分子標(biāo)記，DGGE電泳圖就可以直觀展示鑒定結(jié)果，不需要對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行等位基因測(cè)序以建樹(shù)分析，或者依據(jù)近緣種間的序列差異尋找合適的限制性酶切位點(diǎn)進(jìn)行PCR-RFLP分析。(2)本發(fā)明提供的DGGE方法所使用的變性梯度凝膠組分為30%與60%的凝膠液的混合液。采用這種組合的變性梯度凝膠組分，DGGE的條帶在凝膠中電泳充分，電泳結(jié)束時(shí)條帶位置接近中間，條帶的分離度好。(3)本發(fā)明提供的DGGE方法在恒溫60° C的I X TAE電泳緩沖液中進(jìn)行，首先在80V電壓下運(yùn)行20min，然后在150V電壓下運(yùn)行2. 5h。其優(yōu)點(diǎn)在于，在不影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的前提下盡量縮短電泳時(shí)間，提高效率，由于本方法是分離等位基因且不需要低電壓長(zhǎng)時(shí)間電泳，故較傳統(tǒng)的DGGE電泳時(shí)長(zhǎng)(20— 40h)縮短了很多。


圖I為DGGE檢測(cè)親本南方鲇和鲇的CH4基因條帶圖。圖2為檢測(cè)南方鲇、鲇及其雜交子代的CH4基因條帶圖。圖中標(biāo)記為D1 D3為南方鲇樣本，Al A3為鲇樣本；Z1 Z3為正交子代，F(xiàn)l F3為反交子代。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性內(nèi)容作進(jìn)一步詳細(xì)的描述。水產(chǎn)養(yǎng)殖鲇魚雜種的CH4分子標(biāo)記DGGE鑒定方法，以南方鲇、鲇及其雜交F1代作為研究對(duì)象，包括以下步驟
第一步，分別取南方鲇、鲇及其雜交樣本，提取基因組DNA。因?yàn)殡s交魚苗個(gè)體很小，所以用海洋組織DNA提取試劑盒(Tiangen公司)提取魚苗樣本基因組DNA。
用傳統(tǒng)的酹-氯仿抽提法(Sambrook & Russell, 2001)提取親本南方鲇和鲇鰭條樣本的基因組DNA
a取材取無(wú)水乙醇浸泡的鰭條樣本少許，用酒精消毒的剪刀剪碎，放入I. 5 ml EP管中。b 消化加入 500 u L 裂解緩沖液(10 mmol/L Tris-Cl ；0. I mol/L EDTA ；0. 5 %SDS ；pH 8.0),5 ML蛋白酶K (20 mg/ml )，混合均勻，放入55 °C的搖床內(nèi)，60-70 rpm消化過(guò)夜。c抽提I :取出EP管，待溶液冷卻至室溫，加入等體積的Tris飽和酚(約500 ML)，緩慢混勻10 min, 12000 rpm離心10 min，用I ml槍頭緩慢將上清液移至另一 EP管中。
d抽提2 :重復(fù)抽提I的步驟，用飽和酚再抽提一次，將上清液轉(zhuǎn)入另一 EP管中。e抽提3 :加入400 ML的酹-氯仿(I :1),緩慢混勻5 min, 12000 rpm離心10 min,
輕輕將上清液轉(zhuǎn)入另一 EP管中。f抽提4 :加入300 ML的氯仿，緩慢混勻5 min, 12000 rpm離心10 min,上清液轉(zhuǎn)
移至另一 EP管中。g沉淀加入管內(nèi)體積兩倍體積的冰凍無(wú)水乙醇,于_20°C沉淀20 min。8000 rpm離心I min。h漂洗I :加入150 ML 75 %的冰凍酒精，漂洗后，8000 rpm離心I min。i漂洗2:同漂洗I步驟。j漂洗3:用150 ML冰凍無(wú)水乙醇再漂洗一次，8000 rpm離心I min后，棄掉上清，
自然風(fēng)干。k溶解加入50 ML MilliQ超純水，溶解沉淀的DNA。第二步，分別以南方鲇、鲇及其雜交樣本的總DNA為模板，在CH4基因片段特定引物的引導(dǎo)下進(jìn)行PCR擴(kuò)增；
(I)PCR擴(kuò)增南方鲇、鲇及其雜交F1代的免疫球蛋白M的重鏈保守區(qū)DNA外顯子序列CH4 基因片段。CH4 引物采用 CH4-F (5，-TCCCCAAGGITTACTTGCTCGCTCC-3’ )和 CH4-R (5，-CGATGGATCTGGATATGTGGCGCAC-3 ’)。為獲得較好的DGGE分離效果,在引物CH4-F的5，末端添加了 GC 夾板(5’ - CGGGGGCCGGGCCGGGCGGGCGTGGCGGGCGCTGCGGGCG-3’)，以上引物均由Invitrogen公司合成。CH4-F和CH4-R為擴(kuò)增CH4目的片段的引物對(duì)，其中的F代表正向引物(或上游引物)，R代表反向引物(或下游引物)。(2) PCR 擴(kuò)增
將各組分按以下順序在0. 2 ml的PCR管中混合(反應(yīng)體系為50 ML)
①超純水36 ML
②Taq 酶 IOX buffer5 ML
③MgCl2 (I. 5 mM)4 ML
④dNTPs (2. 5 mM)I. 5 ML
⑤引物GC-CH4-F (25 pM)I ML
⑥引物CH4-R (25 pM)I ML
⑦模板DNA (約 100 ng)I ML⑧Taq DNA 聚合酶(2. 5 U U L-1) 0. 5 ML 經(jīng)過(guò)優(yōu)化的PCR反應(yīng)擴(kuò)增步驟為
①94° C預(yù)變性4 min
②94。C變性40 s
③60° C退火30 s
④72° C延伸30 s
⑤重復(fù)步驟②-④32次
⑥72。C充分延伸10 min
(3)PCR產(chǎn)物純化與測(cè)序
用I %的瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物片段，并在紫外燈下切割目的條帶后放入1.5mL的EP管中，回收采用DNA Agarose Extraction kit (Omega公司)回收試劑盒?；厥债a(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)后，送生物公司測(cè)序。測(cè)序驗(yàn)證其序列信息，發(fā)現(xiàn)CH4基因片段存在種間序列差異，用于進(jìn)行后期的DGGE法雜種鑒定。第二步，DGGE分析檢測(cè)種間差異。DGGE在Bio-Rad公司的Dcode 通用突變檢測(cè)系統(tǒng)中進(jìn)行，選用的聚丙烯酰胺凝膠濃度為8 %，其中變性劑(尿素和去離子甲酰胺)梯度經(jīng)過(guò)優(yōu)化為30% 60%。配制方法為首先按照表I分別配制低變性劑濃度(30%)凝膠液15mL和高變性劑濃度(60%)凝膠液15mL，并于灌膠前各加入150 ML APS和8 ML TEMED ;然后使用梯度生成器將2種凝膠液同時(shí)向豎直放置于水平桌面凝膠槽中的三明治玻璃夾板中注入，其中高變性劑濃度凝膠液注入速度較快，灌膠結(jié)束后插上點(diǎn)樣梳；最后由于重力作用，形成自上而下變性劑梯度為30% 60%的聚丙烯酰胺凝膠。在凝膠的同時(shí)，將DGGE儀器中的IX TAE電泳緩沖液預(yù)熱，當(dāng)溫度接近60° C時(shí)，將夾有凝固凝膠的三明治夾板放入電泳槽中，上樣時(shí)每個(gè)泳道加PCR產(chǎn)物約25ML。DGGE在恒溫60° C的IX TAE電泳緩沖液中進(jìn)行，首先在80V電壓下運(yùn)行20min，然后在150V電壓下運(yùn)行2. 5h。DGGE結(jié)束后，將聚丙烯酰胺凝膠在加入25 Gold View的IX TAE電泳緩沖液中避光染色40min，然后在UV凝膠成像系統(tǒng)中檢測(cè)并對(duì)電泳結(jié)果進(jìn)行分析。DGGE變性梯度凝膠組分為變性梯度為30%與60%的變性劑的混合液，各組分見(jiàn)下表
表I DGGE變性梯度凝膠組分
權(quán)利要求
1.水產(chǎn)養(yǎng)殖鲇魚雜種的CH4分子標(biāo)記DGGE鑒定方法，其特征在于應(yīng)用PCR擴(kuò)增后的南方鲇的014基因片段與鲇的CH4基因片段之間存在的種間序列差異鑒定南方鲇、鲇及其雜交子代。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的水產(chǎn)養(yǎng)殖鲇魚雜種的CH4分子標(biāo)記DGGE鑒定方法，其特征在于包括以下步驟 A分別取南方鲇、鲇及其雜交樣本，提取基因組DNA; B分別以南方鲇、鲇及其雜交樣本的總DNA為模板，使用特定引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增； C DGGE分析檢測(cè)種間差異，經(jīng)DGGE檢測(cè)，在一個(gè)泳道上同時(shí)出現(xiàn)南方鲇和鲇的兩條基因條帶，則為南方鲇和鲇的雜交種。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的水產(chǎn)養(yǎng)殖鲇魚雜種的CH4分子標(biāo)記DGGE鑒定方法，其特征在于所述的步驟B中的特定引物為CH4基因片段的特定引物，堿基序列為正向引物(SEQID NO: 3) 5’ -TCCCCAAGGTTTACTTGCTCGCTCC-3’ ； 反向引物(SEQID NO:4) 5’-CGATGGATCTGGATATGTGGCGCAC-3’ ； 且在正向引物的 5’ 末端添加了 GC 夾板(SEQID NO: 5) 5’ - CGGGGGCCGGGCCGGGCGGGCGTGGCGGGCGCTGCGGGCG-3，。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的水產(chǎn)養(yǎng)殖鲇魚雜種的CH4分子標(biāo)記DGGE鑒定方法，其特征在于所述的CH4基因片段的特定引物，所擴(kuò)增出的南方鲇的基因片段的核苷酸序列(SEQIDNO:I)為 CCAGAGACTT CAGAATCAGT GACCCTGACT TGCTATGTAA AAGACTTCTA CCCTAAGGAGGTGTATGTGT CTTGGCTTGC TGATGATAAA CCAGTGGAGG GTCTGAGCTA CTATAAGGAG AACACCACCGTTCCCCAGAA TGACAAACAA TTTTCAATGT ATAGTCAGC TGATTGTTGA TTCCCAATCT TGGAAGAAAGGCGTTGTGT ACACCTGCAG GGTTTATCAC GAGTCCATCG AGGACCCA。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的水產(chǎn)養(yǎng)殖鲇魚雜種的CH4分子標(biāo)記DGGE鑒定方法，其特征在于所述的CH4基因片段的特定引物，所擴(kuò)增出的鲇的基因片段的核苷酸序列(SEQID N0:2)為 CCAGAGACTT CAGAATCAGT GACCCTGACT TGCTATGTAA AAGACTTCTA CCCTAAGGAGGTGTATGTGT CTTGGCTTGC TGATGATAAA CCAGTGGAGG GTCTGAGCTA CTATAAGGAG AACACCACCATTCCCCAGAA TGAGAAACAA TTTTCAATGT ATAGTCAGCT GATTGTTGAT TCCCAATCTT GGAAGAAAGGCGTTGTGTAC ACCTGCAGGG TTTATCACGA GTCCATCGAG GACCCA。
6.根據(jù)權(quán)利要求2中任意一項(xiàng)所述的水產(chǎn)養(yǎng)殖鲇魚雜種的CH4分子標(biāo)記DGGE鑒定方法，其特征在于所述的步驟C中的DGGE，所使用的變性梯度凝膠組分是指變性梯度為30%與60%的變性劑的混合液。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的水產(chǎn)養(yǎng)殖鲇魚雜種的CH4分子標(biāo)記DGGE鑒定方法，其特征在于所述的步驟C中的DGGE，在恒溫60° C的I X TAE電泳緩沖液中進(jìn)行，首先在80V電壓下運(yùn)行20min，然后在150V電壓下運(yùn)行2. 5h。
全文摘要
本發(fā)明涉及水產(chǎn)養(yǎng)殖鲇魚雜種的CH4分子標(biāo)記DGGE鑒定方法。本發(fā)明以南方鲇、鲇及其雜交子代為研究對(duì)象，在鲇屬魚類中篩選設(shè)計(jì)了CH4基因片段作為分子標(biāo)記，應(yīng)用CH4基因片段在南方鲇與鲇之間存在種間序列差異，應(yīng)用變性梯度凝膠電泳檢測(cè)，成功鑒定了南方鲇、鲇及其雜交子代。具有實(shí)驗(yàn)快捷，鑒定直觀，無(wú)需測(cè)序的優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102758023SQ201210278429
公開(kāi)日2012年10月31日 申請(qǐng)日期2012年8月7日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月7日
發(fā)明者劉匆, 孫家賢, 宋昭彬, 應(yīng)汝華, 盛曉灑, 郭睿, 陳齊勇, 龔麗 申請(qǐng)人:通威股份有限公司