專利名稱：一種s-腺苷-l-蛋氨酸和谷胱甘肽聯產發酵方法
技術領域：
本發明涉及一種微生物發酵方法，具體涉及一種S-腺苷-L-蛋氨酸和谷胱甘肽聯產發酵方法。
背景技術：
S-腺苷-L-蛋氨酸(SAM)和谷胱甘肽(GSH)是生物體內兩種重要的生物活性分子。
SAM，又名腺苷甲硫氨酸，是甲硫氨酸的活性形式，在動植物體內廣泛存在，由底物L-甲硫氨酸和三磷酸腺苷(ATP)經腺苷甲硫氨酸合成酶(EC 2.5. I. 6)酶促合成的。SAM與人體中許多代謝過程密切相關，是一種改善細胞代謝的生化藥物，可以通過轉硫基增加肝內GSH、硫酸根及牛磺酸水平，防止肝炎、脂肪肝、肝纖維化、肝硬化和肝癌，也可防止酒精、藥物和細胞素對肝臟的損傷。SAM對于關節炎、纖維性肌肉、偏頭痛等疾病也具有很好的治療效果，而且副作用小。早在上世紀70年代，歐洲已將SAM作為治療關節炎的處方藥使用。1999年，美國FDA批準SAM作為保健品上市，在美國己成為最暢銷的營養品之一。GSH是廣泛分布于哺乳動物、植物和微生物細胞內最主要且含量最豐富的低分子三肽，也是生物體內最重要的活性巰基化合物之一，被廣泛應用為解毒劑、抗氧化劑、免疫增強劑、風味劑和防腐劑，在臨床醫學、運動保健、食品加工等很多領域都有著廣泛的應用前景。臨床方面，GSH常作為肝炎、溶血性疾病以及角膜炎、白內障和視網膜疾病的輔助治療藥物，能夠保護體內許多蛋白質和酶等分子中的巰基不被如自由基等有害物質氧化，從而讓蛋白質和酶等分子發揮其生理功能，對保護紅細胞膜上蛋白質的巰基處于還原狀態，防止溶血具有重要意義。GSH對于放射線、放射性藥物或由于抗腫瘤藥物引起的白細胞減少等癥狀也能起到保護作用。同時GSH能與進入機體的有毒化合物、重金屬離子或致癌物質等相結合，并促其排出體外，起到中和解毒作用。最新研究還表明，GSH能夠糾正體內乙酰膽堿、膽堿酯酶的不平衡，起到抗過敏作用，還可防止皮膚老化及色素沉著，減少黑色素的形成，改善皮膚抗氧化能力并使皮膚產生光澤，另外，GSH在改善性功能方面也有很好作用。近年來，西方科學家發現谷胱甘肽也具有抑制艾滋病病毒的功能。食品加工方面，將GSH加入到面制品中，可起到還原作用，不僅使制造面包的時間縮短至原來的二分之一或三分之一，勞動條件大幅度改善，并起到強化食品營養的作用；將其加入到酸奶和嬰幼兒食品中，相當于維生素C，可起到穩定劑的作用；將其拌到魚糕中，可防止色澤加深；加到肉制品和干酪等食品中，具有強化風味的效果。由于SAM和GSH在多方面的作用，特別是醫藥方面的突出作用，人們對二者的需求量也迅猛增加，但目前國內需求主要依賴進口，且價格居高不下。SAM和GSH的生產方法有化學合成法、酶法和微生物發酵法。其中化學合成法由于具有過程復雜、耗時的缺陷，限制了其工業化應用。酶法合成SAM和GSH具有產物純度高，易提取等優點，但原料ATP價格昂貴成為酶法合成SAM和GSH的限制性因素。目前酵母發酵法被認為是SAM和GSH生物合成最有潛力的方法，然而對于發酵法生產SAM和GSH的已有研究大都集中在其中一種產物的生產上。事實上，由于SAM和GSH均是酵母細胞含硫物質代謝網絡中的重要節點物質，二者在合成過程中存在著復雜的關聯。值得注意的一點是在SAM的分解代謝過程中會通過轉硫作用合成L-半胱氨酸，為GSH的合成提供重要前體從而促進了 GSH的合成。近年來，利用一種微生物菌株發酵聯產SAM和GSH也逐漸引起了研究者的廣泛關注。在“5·-腺苷硫氨酸和谷胱甘肽聯產發酵的環境條件”(《生物加工過程》2011年3月第9卷第2期，第23 28頁)一文中，公開了采用產朊假絲酵母util is CCTCCM 209298)進行發酵培養聯產SAM和GSH，并對培養條件進行了研究。在SAM和GSH的生物合成過程中，ATP作為限制性底物和能量物質，其作用不可替代，胞內ATP含量的多少決定著底物的轉化效率以及SAM和GSH能否高效合成。有研究表明，適時向發酵液中添加適當濃度的外源ATP可以有效地促進SAM和GSH產量的提高。但是由于ATP價格昂貴，外源性ATP添加方式顯然難以應用于SAM和GSH的工業化生產。因此尋找到一種ATP的替代性廉價物質，對于SAM和GSH產量的提高，乃至于SAM和GSH的工業化生產無疑具有重要意義。

發明內容
本發明的發明目的是提供一種S-腺苷-L-蛋氨酸和谷胱甘肽聯產發酵方法，通過對方法的改進，以較低的成本提高SAM和GSH的聯產量。為達到上述發明目的，本發明采用的技術方案是一種S-腺苷-L-蛋氨酸和谷胱甘肽聯產發酵方法，采用產朊假絲酵母保藏號CCTCC M 209298)菌株，經種子培養后，發酵培養18至30小時，再從發酵液中提取獲得腺苷-L-蛋氨酸和谷胱甘肽，在發酵培養開始的O 15小時內，向培養液中添加檸檬酸鈉，每升培養液中加入2 10克朽1檬酸鈉。優選的技術方案，在發酵培養開始的15小時，向培養液中添加朽1檬酸鈉，每升培養液中加入2克檸檬酸鈉。上述技術方案中，發酵培養的接種量為5 10%，發酵溫度28 32°C，攪拌轉速300 400 rpm,通氣量 3. O 4. O L/min, pH 為 5. O。優選的技術方案，發酵培養時間為24 30小時。由于上述技術方案的運用，本發明與現有技術相比具有下列優點
I.本發明采取外源性添加廉價的檸檬酸鈉的方式，在沒有額外添加其他前體氨基酸的情況下進一步提高了 SAM和GSH聯產產量，使在好氧發酵過程中間接提高胞內ATP的水平成為可能。2.本發明為SAM和GSH聯產發酵過程的優化增添了新的途徑，為SAM和GSH的產業化生產提供了技術依據，也為類似耗能合成化合物的過量合成提供了新的思路。


圖I是實施例五中聯產發酵過程中SAM和GSH的變化結果圖。
具體實施例方式下面結合附圖及實施例對本發明作進一步描述實施例一一種5·-腺苷-L-蛋氨酸和谷胱甘肽聯產發酵方法，采用產朊假絲酵母菌株，經種子培養和發酵培養，從發酵液中提取獲得S-腺苷-L-蛋氨酸和谷胱甘肽。其具體方法如下
Cl)菌株
產朊假絲酵母uti I is) CCTCC M 209298，蘇州大學工業微生物實驗室篩選
并保存。(2)培養基
斜面及種子培養基(g/L):葡萄糖20，蛋白胨10，酵母膏10，pH 6.0 ；
發酵培養基(g/L):蔗糖35，硫酸銨10，磷酸二氫鉀12. 3，L-蛋氨酸4. 6，硫酸鎂O. 05，pH 5. O。(3)種子培養
斜面種子活化4小時后接入裝有50 mL種子培養基的500 mL三角瓶中進行振蕩培養，培養溫度30°C，搖床轉速200 rpm，培養時間24小時。(4)分批發酵培養
新鮮種子培養液接種至5 L發酵罐(BI0TECH-5BGZ，上海保興生物設備工程有限公司)中，裝液量3 L，接種量10%，發酵溫度30°C，攪拌轉速350印111，通氣量3.0 L/min, pH 5.0(通過自動流加3 mo I/L H2SO4和3 mo I/L NaOH溶液進行調節)，培養時間30小時。在發酵培養的O小時、6小時或15小時，向培養液中添加ATP (對比例)或檸檬酸鈉，ATP添加濃度
O.2 mmol/L，檸檬酸鈉添加濃度2 g/L或10 g/L。(5)酵母生物量的測定
以細胞干重(DCW)表示酵母生物量。取25 mL發酵液，3500 rpm離心10 min，蒸餾水離心洗滌3次，收集菌體，70°C烘干至恒重。(6 )胞內GSH的提取及測定
發酵培養得到的新鮮酵母用蒸餾水洗滌3次后，30°C下在40%乙醇溶液中處理2小時，離心取上清液作為待測樣品。采用DTNB [5，5’-二硫雙(2-硝基苯甲酸)]-谷胱甘肽還原酶循環法進行測定。(7 )胞內SAM的提取及測定
發酵培養得到的新鮮酵母用蒸餾水洗滌3次后，4°C下用O. 35 mol/L稀硫酸處理2小時，離心，上清液經O. 22 μ m濾膜過濾作為待測樣品。采用HPLC法測定流動相為O. 5 mol/L甲酸銨溶液(pH 4.0)，流速0.8 mL/min，柱溫25°C。(8 )胞內ATP的提取及測定
取5 mL發酵液，離心得到濕酵母細胞，將濕細胞重新懸浮在5 mL 0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)中，超聲波破碎10 min，離心后得到的上清液作為待測樣品，采用HPLC法檢測ATP含量，流動相為PBS溶液，流速I mL/min，檢測波長254 nm，柱溫35°C。對比例一按照實施例一中所述發酵條件，分批發酵O小時添加O 0. 2 mmol/LATP的實驗結果
細胞干重14· 47 14. 86 g/L ;SAM 產量270. I 296. 2 mg/L ;GSH 產量257. I
281.I mg/L ;SAM 和 GSH 聯產產量:528. 8 562. 9 mg/L ;胞內 SAM 含量1. 96 I. 98% ;胞內 GSH 含量1. 78 I. 81%。
對比例二 按照實施例一中所述發酵條件，分批發酵15小時添加O O. 2 mmol/LATP的實驗結果
細胞干重14· 47 14. 77 g/L ;SAM 產量270. I 360. 3 mg/L ;GSH 產量257. I 350. 9 mg/L ;SAM 和 GSH 聯產產量:528. 8 701. 3 mg/L ;胞內 SAM 含量1· 96 2. 39% ;胞內 GSH 含量1. 78 2. 35%。實施例二 按照實施例一中所述發酵條件，分批發酵O小時添加2 10 g/L檸檬酸鈉的實驗結果
細胞干重14. 01 14. 27 g/L ;SAM 產量329. 7 344. O mg/L ;GSH 產量269. 4 310. 3 mg/L ;SAM 和 GSH 聯產產量:582. 5 636. 3 mg/L ;胞內 SAM 含量2. 23 2. 41% ;胞內 GSH 含量1. 91 2. 33%。實施例三按照實施例一中所述發酵條件，分批發酵6小時添加2 10 g/L朽1檬 酸鈉的實驗結果
細胞干重13· 93 14. 20 g/L ;SAM 產量310. 7 328. 6 mg/L ;GSH 產量270. O 301. 5 mg/L ;SAM 和 GSH 聯產產量:588. 6 607. 3 mg/L ;胞內 SAM 含量2. 01 2. 42% ;胞內 GSH 含量:2· 05 2. 32%。實施例四按照實施例一中所述發酵條件，分批發酵15小時添加2 10 g/L檸檬酸鈉的實驗結果
細胞干重14· 02 14. 33 g/L ;SAM 產量308. 4 331. 5 mg/L ;GSH 產量281. 8 344. 6 mg/L ;SAM 和 GSH 聯產產量:571. 4 663. 9 mg/L ;胞內 SAM 含量2. 44 2. 55% ;胞內 GSH 含量2. 06 2. 47%ο實施例五按照實施例一所述發酵條件，分批發酵15小時添加2 g/L檸檬酸鈉，檢測培養過程中SAM和GSH的變化，結果如圖I所示。從上述實施例和對比例中可以看出本發明通過在聯產發酵過程中添加外源物質ATP和檸檬酸鈉，實現了 SAM和GSH聯產量的進一步提高；與添加ATP相比，添加檸檬酸鈉更加有利于胞內SAM和GSH含量的提高。
權利要求
1.一種S-腺苷-L-蛋氨酸和谷胱甘肽聯產發酵方法，采用產朊假絲酵母山 保藏號CCTCC M 209298)菌株，經種子培養后，發酵培養18至30小時，再從發酵液中提取獲得腺苷-L-蛋氨酸和谷胱甘肽，其特征在于在發酵培養開始的0 15小時內，向培養液中添加檸檬酸鈉，每升培養液中加入2 10克檸檬酸鈉。
2.根據權利要求I所述的S-腺苷-L-蛋氨酸和谷胱甘肽聯產發酵方法，其特征在于在發酵培養開始的15小時，向培養液中添加朽1檬酸鈉，每升培養液中加入2克朽1檬酸鈉。
3.根據權利要求I所述的S-腺苷-L-蛋氨酸和谷胱甘肽聯產發酵方法，其特征在于發酵培養的接種量為5 10%，發酵溫度28 32°C，攪拌轉速300 400 rpm,通氣量3. 0 4. 0 L/min, pH 為 5. O。
4.根據權利要求I所述的S-腺苷-L-蛋氨酸和谷胱甘肽聯產發酵方法，其特征在于發酵培養時間為24 30小時。
全文摘要
本發明公開了一種S-腺苷-L-蛋氨酸和谷胱甘肽聯產發酵方法，采用產朊假絲酵母(Candidautilis，保藏號CCTCC M209298)菌株，經種子培養后，發酵培養18至30小時，再從發酵液中提取獲得S-腺苷-L-蛋氨酸和谷胱甘肽，其特征在于在發酵培養開始的0～15小時內，向培養液中添加檸檬酸鈉，每升培養液中加入2～10克檸檬酸鈉。本發明采取外源性添加廉價的檸檬酸鈉的方式，在沒有額外添加其他前體氨基酸的情況下進一步提高了SAM和GSH聯產產量，使在好氧發酵過程中間接提高胞內ATP的水平成為可能。
文檔編號C12R1/72GK102776258SQ201210285900
公開日2012年11月14日 申請日期2012年8月13日 優先權日2012年8月13日
發明者衛功元, 王大慧, 王玉磊 申請人:蘇州大學