專利名稱：苯并噻二唑結合羅倫隱球酵母防治水果采后病害的方法
技術領域：
本發明涉及一種苯并噻二唑和羅倫隱球酵母(jCryptococcus IaurentiI)結合使用對水果采后病害生物防治的方法，屬于水果采后病害生物防治領域。
背景技術：
水果在采摘、運銷、儲藏過程中因腐爛造成的損失是巨大的，也是全球關注的問題。據報道，在發達國家有10% - 30%的新鮮產品由于采后病害導致腐爛，而在缺乏貯運冷藏設備的發展中國家，果實采后腐爛率則高達40% — 50%。國外水果貯藏保鮮量占水果總產量60%以上，目前我國果品貯藏量800多萬噸，不到總量的15%，其中冷藏庫和氣調庫的貯藏量為70萬噸，僅占總產量的7%。我國水果采后損失一般在20% - 30%,高者甚至達到50%。2007年3月國家統計局發布的《中華人民共和國2006年國民經濟和社會發展統計公報》顯示，2006年我國水果總產量達17050萬噸。據此估算，我國水果采后的損失每年將達·到數百億元人民幣的水平。水果腐爛的主要原因在于病原微生物的致病作用，這些病原微生物主要有灰葡11 {Bo try tis cinerea ) >(.Rhizopus s toloniger ) > (.PeniciIlium spp.)、毛霉 iMucor spp.)、鏈格孢(Alterimriei spp.)、曲霉(AspergiIlus spp.)和軟腐細菌(.Erwinia #.)等。病原微生物對采后水果的危害不僅在于其導致水果在數量上造成的嚴重損失，而且由于許多病原真菌能分泌產生許多次生代謝產物從而引起嚴重的食品安全問題，如擴展青霉(A ezpa/75 )產生的棒曲霉素(patulin)、灰葡萄孢(漢ciflerea )產生的葡雙醒霉素(botrydial)等。目前最常用的控制水果采后腐爛的方法是低溫貯藏和化學殺菌劑處理。近年來低溫貯藏技術在我國得到了廣泛的發展和應用，但已有的冷藏設備往往不能滿足大多數水果的需要。同時，在低溫條件下仍有相當數量的致病菌能夠在水果上生長，并造成水果腐爛。例如，能引起多種水果灰霉病的灰葡萄孢{Botryris cinerea),也稱灰霉菌,在-O. 5°C時也能生長繁殖，引起許多水果腐爛變質，造成嚴重經濟損失。而那些對低溫敏感的水果，因只能在不低于使產品受冷害的溫度下貯藏，病原物的生長、繁殖不能得到有效地抑制，腐爛相當嚴重。長期以來，控制水果采后病害的主要措施是使用殺菌劑。化學殺菌劑對防治病害可以起到立竿見影的效果，但是，化學殺菌劑長期和大量的使用，不僅導致病原微生物產生抗藥性，同時嚴重污染環境，有損于人類健康。美國國家科學院(National Academy ofScinces)的一份報告顯示，在用于處理食品的全部農藥中，殺菌劑構成60%的致癌危險。隨著國家經濟發展和消費水平的提高，人們對食品安全和環境保護意識的日益增強，目前多種化學殺菌劑(如CaptaruBenomyl等)已被明令禁止使用或者在部分水果產品上限制使用，其直接的后果是目前許多水果采后病害已經沒有殺菌劑能予以控制。因此，各國科學家都在積極地探索能代替化學殺菌劑的安全、高效的新型水果采后病害防治方法。當前國際上對用拮抗微生物進行水果采后病害的生物防治的研究已經取得了階段性的成果，并認為這是最有希望取代化學殺菌劑的方法之一。
隨著酵母分類、生態、生理、生物化學和分子生物學的研究取得進展，人們對果蔬貯藏中利用酵母的興趣日益提高。國內外的研究表明，許多酵母菌應用于水果表面，可以防治水果由致病霉菌引起的病害，這些酵母被稱為拮抗酵母。酵母菌遺傳穩定，抑菌譜廣、效價高，一般不產生對人和寄主植物有害的代謝產物，安全性高，且對營養要求低，生長快，并對多種脅迫、逆境具有較強的耐受力，對大多數殺菌劑不敏感，對其它化學和物理處理能夠相容。因此近年來拮抗酵母作為水果采后病害生防菌，受到國際上的廣泛關注。國外方面，Sansone等從蘋果表面分離得到的粘紅酵母對由沒otryiis cinerea引起的灰霉病有顯著的防治效果，在實驗室條件下，其腐爛率與對照相比降低了 54%。Calvente等的研究也發現粘紅酵母對水果采后青霉病害有顯著的抑制效果。我國水果采后病害生物防治研究起步較晚，鄭曉冬等在體外和體內抑菌試驗中研究了粘紅酵母對由指狀青霉引起的柑桔青霉腐爛的抑制效果，發現粘紅酵母在控制由指狀青霉引起的柑桔腐爛中顯示出了很高的抑菌活性，在25°C條件下，對照的發病率為100%，而使用I X IO8個/ml的菌懸液的發病率僅為45 %，而且隨著酵母濃度的提高，發病率也有逐漸下降的趨勢。張紅印等研究了粘紅酵母對草莓采后灰霉病的抑制效果，對草莓進行了前期的預處理后，接種I X IO9個/ml的菌懸液和I X IO5個/ml的病·原菌孢子菌懸液，分別在4°C下貯藏7天和20°C下貯藏2天后，發現接種粘紅酵母的草莓，其腐爛率與對照相比分別降低了 95%和94.7 %。范青(2001)等對果實病害生物防治拮抗菌進行了篩選和分離，結果表明季也蒙假絲酵母{Candida guiIiermondii) > τ樣形克勒克酵母iKloeckeim、漢遜德巴利酵母{Debaryomyces hansenii)對甜櫻桃褐腐病都表現出顯著的抑制效果，季也蒙假絲酵母和檸檬形克勒克酵母能有效地防治核果類果實軟腐病；Tian等(2004)的研究表明，在甜櫻桃采前噴灑I X IO8個/mL的絲抱酵母{Trichosporon ,羅倫隱球酵母{Cryptococcus laurentif)和紅酵母{Rhodotorula glut inis),分別在25°C, 0°C以及氣調忙藏下，絲孢酵母對甜樓桃采后病害具有顯著的抑制效果；張紅印等(2005)研究了不同溫度下，羅倫隱球酵母對灰霉病的防治效果，結果表明，25°C下，經羅倫隱球酵母處理的梨果，其灰霉病的發病率為16. 7%，顯著地低于對照；羅倫隱球酵母結合CaCl2使用效果更顯著。從國內外文獻中可知當前以有效微生物取代化學殺菌劑用于采后水果病害的防治已顯示出巨大的應用前景，水果采后病害的生物防治成為一個新的研究熱點。但到目前為止，已實際應用于生產的拮抗菌種類不多，只有Biosave和Aspire等少數幾種產品上市，而我國目前尚沒有拮抗菌應用于實際生產。主要原因在于商業生產條件下，目前已報道的拮抗微生物的防治效果往往不如化學殺菌劑的效果，從而達不到保鮮要求。這些因素影響了拮抗菌作為果蔬保鮮劑在生產中的使用。為了盡快地將拮抗微生物應用于水果貯藏保鮮實際生產，還需進一步篩選拮抗效果好、抗病譜廣的微生物，并進一步提高拮抗酵母的拮抗效力，從而將其應用于水果貯藏保鮮。苯并噻二唑(2，1，3-Benzothiadiazole，BTH)，化學名稱為2，1，3-苯并噻二唑，是水楊酸的結構類似物，水楊酸是植物抗病反應的信號分子和誘導植物對非生物逆境反應的抗逆信號分子。BTH是一種典型的植物抗病誘導劑，離體條件下無殺菌活性，但能夠誘導植物的免疫活性，活化物體內的防御機制，激發抗病蛋白的產生，誘導抗病性。近年來的研究發現，苯并噻二唑(BTH)具有廣譜的誘抗活性，可誘導多種植物對細菌、真菌和病毒等產生抗性。近年來，BTH功能的研究已經成為生物學最重要、發展最迅速的研究領域之一。本發明利用苯并噻二唑和羅倫隱球酵母結合使用提高其對水果采后病害生物防治的效力，從而降低水果的腐爛率，進而達到水果貯藏保鮮的目的。

發明內容
本發明利用苯并噻二唑和羅倫隱球酵母結合使用來提高其對水果采后病害生物防治的效力。經苯并噻二唑和羅倫隱球酵母結合使用，可以明顯地抑制水果病原菌，防治水果采后腐爛。本發明具有安全、高效、成本低等優點，可以廣泛地用于水果采后病害的生物防治過程中，減少水果采后病害造成的損失。本發明提供了苯并噻二唑(BTH)結合羅倫隱球酵母使用防治水果采后病害的方法，按照下述步驟進行將羅倫隱球酵母活化，用NYDB培養基培養羅倫隱球酵母，離心得到菌體，配制含苯并噻二唑O. lg/Ι的酵母濃度為5X IO8菌懸液；將菌懸液均勻噴灑在水果·上，自然風干；放在塑料筐中，用保鮮膜密封后，放在室溫條件下存放。其中所述的NYDB培養基為酵母膏5g，牛肉浸膏8g，葡萄糖10g，純化水1000ml，pH自然。其中所述的羅倫隱球酵母(jCryptococcus laurentif)。其中所述的配制含苯并噻二唑O. lg/Ι的酵母濃度為5X IO8菌懸液方法，按照下述步驟進行將菌體用無菌水稀釋制備成I X IO9個/ml的菌懸液，與濃度為O. 2g/l的苯并噻二唑按體積比I :1混合。其中所述的水果優選草莓或蘋果。本發明的優點
(I)本發明所使用的羅倫隱球酵母(jCryptococcus laurentii)購于中國農業微生物菌種保藏管理中心(ACCC)，其拮抗效力強，對人體安全無害。(2)本發明使用苯并噻二唑和羅倫隱球酵母結合使用，與單獨使用苯并噻二唑處理或羅倫隱球酵母處理相比，可以顯著提高羅倫隱球酵母的拮抗活性，從而降低水果的腐爛率，進而達到水果貯藏保鮮的目的。(3)本發明使用苯并噻二唑和羅倫隱球酵母結合使用，可以代替化學殺菌劑防治水果采后病害，避免使用化學殺菌劑對人的危害，具有顯著的經濟效益和社會效益。


其中圖I為苯并噻二唑與羅倫隱球酵母結合使用對草莓根霉病、灰霉病的控制效應；注=CK :對照；BTH :苯并噻二唑(O. lg/Ι);酵母羅倫隱球酵母菌懸液(5X IO8個/ml);BTH+酵母5X IO8個/ml羅倫隱球酵母菌懸液(含濃度為O. lg/Ι的BTH)。發病率是20°C放置4d后測定的結果。不同字母代表差異顯著(P=O. 05)。圖2為苯并噻二唑與羅倫隱球酵母結合使用對蘋果青霉病的控制效應；注CK 對照；BTH :苯并噻二唑(O. lg/Ι);酵母羅倫隱球酵母菌懸液(5X IO8個/ml) ;BTH+酵母5 X IO8個/ml羅倫隱球酵母菌懸液(含濃度為O. lg/Ι的BTH)。發病率是25°C放置IOd后測定的結果。不同字母代表差異顯著(P=O. 05)。圖3、4為苯并噻二唑與羅倫隱球酵母結合使用對草莓自然腐爛的影響；注CK 對照；BTH:苯并噻二唑(O. lg/1);酵母羅倫隱球酵母菌懸液(5X IO8個/ml) ;BTH+酵母5 X IO8個/ml羅倫隱球酵母菌懸液(含濃度為O. lg/Ι的BTH)。不同字母代表差異顯著性(P=O. 05)。圖5為苯并噻二唑與羅倫隱球酵母結合使用對蘋果自然腐爛的影響；注CK :對照；BTH:苯并噻二唑(O. lg/Ι);酵母羅倫隱球酵母菌懸液(5X IO8個/ml) ;BTH+酵母5 X IO8個/ml羅倫隱球酵母菌懸液(含濃度為O. lg/Ι的BTH)。不同字母代表差異顯著性(P=O. 05)。
具體實施例方式通過借助以下實施實例將更加詳細的說明本發明。以下實施例僅是說明性的，本發明并不受這些實施實例的限制。
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羅倫隱球酵母{Cryptococcus 7a T6Wiii),購于購于中國農業微生物菌種保藏管理中心(ACCC)，于NYDA (NYDB培養基的基礎上添加2%的瓊脂)培養基4°C低溫保存。培養程序為(I)固體活化將羅倫隱球酵母接種于NYDA培養基中，在28°C培養48h ; (2)液體培養在250 ml的三角瓶中裝入50 ml的NYDB種子培養基，用接種環接入一環活化好的羅倫隱球酵母，在200 rpm (轉/分鐘)，28°C條件下培養24h ; (3)離心分離再懸浮將酵母培養混合物在7000 Xg條件下,離心10-15 min,并用無菌蒸懼水洗漆2次，以去除培養介質，用無菌蒸餾水重新再懸浮，并用血球計數板調節酵母細胞濃度為IXlO9個/ml，再用滅過菌的生理鹽水或BTH溶液稀釋到所需濃度。實施例I :苯并噻二唑與羅倫隱球酵母結合使用對對水果病害的抑制效果
一、試驗方案
供試的果實經過精細挑選，盡量選擇果實均勻一致，表面無擦傷、機械傷和病蟲傷害。將水果用無菌打孔器打孔，其中草莓的表面傷口為3mm (直徑)X3mm (深)，蘋果的表面傷口為5_ (直徑)X3mm (深)。每個傷口處等量加入30 μ I以下處理液(I) 5 X IO8個/ml的羅倫隱球酵母菌懸液(含濃度為O. lg/Ι的BTH); (2) 5X IO8個/ml的羅倫隱球酵母菌懸液；(3)BTH (O. lg/Ι)和(4)無菌水。2 h后，再向草莓傷口處分別接種30 μ L以下致病菌孢子懸浮液草莓IX IO5個/ml的灰葡萄孢(Aoiirii1S ciflerea)孢子懸浮液、I X IO4個/ml的葡枝根霉(Miizopus)孢子懸浮液；向蘋果傷口處接種30 μ L, 5 X IO4個
/ml的擴展青霉孢子懸浮液。自然晾干后,將果實放入塑料筐并用保鮮膜密封，恒溫培養箱中培養(濕度95%)，蘋果置于25°C，草莓置于20°C。每處理重復3次，每次重復10個果實。整個試驗重復2次。經過若干天的培養，記錄果實發病率，以此評價羅倫隱球酵母的抑菌效果。發病率的計算公式如下
發病率(%)=發病的果實/接種病原菌的果實總數X100%
_■、試驗結果
按照上述步驟試驗，統計水果的腐爛率結果如下
I.I對草莓根霉病、灰霉病的抑制效果
從圖I可以看出，經羅倫隱球酵母單獨處理、BTH與羅倫隱球酵母結合處理的草莓，其灰霉病發病率顯著低于對照處理，其中結合處理效果最好，腐爛率為20. 83%，遠遠低于對照(100%,)，為對照處理的20. 83%。單獨使用羅倫隱球酵母的腐爛率為36. 11%，為對照處理的36.11%。單獨使用BTH處理對根霉病沒有顯著影響。羅倫隱球酵母單獨處理和BTH與羅倫隱球酵母結合處理對草莓采后根霉病都有顯著的抑制效果，其腐爛率分別為26. 38%和
12.5%，遠遠低于對照(100%，)，單獨應用BTH對草莓采后根霉病的腐爛率為95. 83%，與對照相比沒有顯著影響。1.2對蘋果青霉病的抑制效果
從圖2可以看，羅倫隱球酵母(5X IO8個/ml)與BTH (O. lg/Ι)結合能顯著抑制蘋果青霉病的發病率，結合處理青霉病的發病率51. 39%，單獨使用羅倫隱球酵母處理也能顯著抑制蘋果的青霉病，但是效果不如結合處理，發病率為72. 22%。單獨使用苯并噻二唑處理不能顯著降低蘋果青霉病的發病率。實施例2 :苯并噻二唑與羅倫隱球酵母結合使用對水果自然腐爛的抑制效果· 一、試驗方案
將以下處理液均勻噴于水果表面，自然晾干(1)5X108個/ml的羅倫隱球酵母菌懸液(含O. lg/Ι的BTH) ; (2) 5X IO8個/ml的羅倫隱球酵母菌懸液；(3) BTH (O. lg/Ι)和(4)無菌水。然后，將處理好的果實放入塑料筐用保鮮膜密封，草莓分別在20°C (RH 95%)的恒溫培養箱中貯藏6天或4°C冰柜中貯藏10天后轉入20°C (RH 95%)的恒溫培養箱中貯藏I天；蘋果室溫下貯藏3個月。取出水果統計腐爛水果個數，并觀察腐爛情況。每處理重復3次，整個實驗重復2次。苯并噻二唑與羅倫隱球酵母結合使用對草莓自然腐爛的抑制效果以草莓的發病率表示，對蘋果自然腐爛的抑制效果以蘋果的腐爛指數表示。發病率的計算公式如下
發病率(%)=發病的果實/處理的果實總數X 100%
腐爛指數的計算方法觀察蘋果的腐爛情況，按照腐爛指數分級標準進行分級，再計算各組處理蘋果的腐爛指數。腐爛指數分級標準O級果實完好無損；I級果實表面褐斑面積小于總面積的10% ；2級果實表面褐斑面積約占總面積的10%-30% ；3級果實表面褐斑面積約占總面積的30%-50% ；4級果實表面褐斑面積約占總面積的50%-70% ；5級果實表面褐斑面積大于總面積的709L腐爛指數=Σ (腐爛級別X腐爛個數)/ (蘋果總數X 5) X 100%
_■、試驗結果
按照上述步驟試驗，統計草莓的自然腐爛率及蘋果的腐爛指數結果如下
2.I對草莓自然腐爛率的影響
從圖3可以看出，經過羅倫隱球酵母(5 X IO8個/ml)和BTH(O. lg/Ι)結合處理的草莓果實，在20°C (濕度95%)貯藏6天后，草莓果實的自然發病率均顯著低于對照，為51. 67%，單獨使用羅倫隱球酵母也能顯著降低草莓果實的自然腐爛率但是效果不如結合處理好。從圖4可以看出，低溫貯藏情況下(4°C )，單獨使用BTH對草莓自然腐爛沒有顯著的抑制效果。BTH與羅倫隱球酵母結合使用以及羅倫隱球酵母單獨使用都顯著抑制草莓自然腐爛，但兩者之間的抑制效果沒有顯著差異。2. 2對蘋果腐爛指數的影響
從圖5可以看出，經羅倫隱球酵母(5X IO8個/ml)和BTH(0. lg/Ι)結合處理的蘋果，其果實腐爛指數為18. 66 %，與對照蘋果的腐爛指數(29 % )相比顯著降低，BTH單獨處理增大了蘋果的腐爛指數，經羅倫隱球酵母單獨處理的蘋果的腐爛指數與對照蘋果的腐爛指數相比較，兩者的差異不顯著?！?br> 權利要求
1.苯并噻二唑(BTH)結合羅倫隱球酵母使用防治水果采后病害的方法，其特征在于按照下述步驟進行將羅倫隱球酵母活化，用NYDB培養基培養羅倫隱球酵母，離心得到菌體，配制含苯并噻二唑O. lg/Ι的酵母濃度為5 X IO8菌懸液；將菌懸液均勻噴灑在水果上，自然風干；放在塑料筐中，用保鮮膜密封后，放在室溫條件下存放。
2.根據權利要求I所述的苯并噻二唑(BTH)結合羅倫隱球酵母使用防治水果采后病害的方法，其特征在于其中所述的NYDB培養基為酵母膏5g，牛肉浸膏8g，葡萄糖10g，純化水 1000ml, pH 自然。
3.根據權利要求I所述的苯并噻二唑(BTH)結合羅倫隱球酵母使用防治水果采后病害的方法，其特征在于其中所述的羅倫隱球酵母(jCryptococcus Iaurenti )。
4.根據權利要求I所述的苯并噻二唑(BTH)結合羅倫隱球酵母使用防治水果采后病害的方法，其特征在于其中所述的配制含苯并噻二唑O. lg/Ι的酵母濃度為5X108菌懸液方法，按照下述步驟進行將菌體用無菌水稀釋制備成I X IO9個/ml的菌懸液，與濃度為O.2g/l的苯并噻二唑按體積比I :1混合。
5.根據權利要求I所述的苯并噻二唑(BTH)結合羅倫隱球酵母使用防治水果采后病害的方法，其特征在于其中所述的水果為草莓或蘋果。
全文摘要
本發明公開了苯并噻二唑結合羅倫隱球酵母防治水果采后病害的方法，屬于水果采后病害生物防治領域。將羅倫隱球酵母(Cryptococcuslaurentii)活化，接種到NYDB培養基中培養24h，離心得到菌體，將菌體用0.1g/l的苯并噻二唑稀釋制備成5×108個/mL的菌懸液；將菌懸液均勻噴灑于水果上，自然風干；放在塑料筐中，用保鮮膜密封后，放在室溫條件下存放。本發明利用苯并噻二唑和羅倫隱球酵母結合使用提高其對水果采后病害生物防治的效力，使用簡單，操作方便，效果好，成本低。其結合使用可以替代化學殺菌劑防治水果采后病害，避免使用化學殺菌劑對人的危害，具有顯著的經濟效益和社會效益。
文檔編號A23B7/155GK102783518SQ201210291499
公開日2012年11月21日 申請日期2012年8月15日 優先權日2012年8月15日
發明者任曉鋒, 孫瑜, 張紅印 申請人:江蘇大學