專利名稱：一種酶工程法生產d-α-生育酚的方法
技術領域：
本發明涉及ー種d-a -生育酚生產技木，特別是ー種酶工程轉化生產d-a -生育酚的方法，屬于生物制品技術類。
背景技術：
維生素E(VE)是人類營養的必需成份，具有促進人體能量代謝、防止血管硬化、保肝、調整性腺功能、延緩衰老和抑制游離基等多種生理功能，是治療和輔助治療一系列疾病的有效藥物，在抗不育、抗癌、抗衰老、治療冠心病、心肌梗塞和血栓、動脈硬化、増加機體免疫力、提高血液中氧的利用率和肌肉持久力等方面都具有重要作用，可用于醫藥エ業、食品エ業、化妝品エ業等多個領域。維生素E是生育酚類化合物的總稱。它不僅是ー種常用的藥品兼營養保健品，在其他領域也有許多重要的用途。商品維生素E可分為天然維生素E和合成維生素E兩類。·天然VE是以富含維生素E的天然油脂為原料，經適當加工得到的由d-a、d-0、d_ Y、d_ 6生育酚構成的混合物。目前天然VE占全球VE總商品量的30%左右。維生素E已成為國際市場上用途廣泛、產銷量較大的主要維生素品種，同VC、VA 一起成為維生素系列的三大支柱產品。天然維生素E比合成維生素E安全性高，生理功能好，發展非常迅速，國內外市場前景極為廣闊(天然維生素E生產技術現狀.濕法冶金2003年9月，第22卷第3期(總第87期))。目前國內制備天然VE以脫臭餾份為原料，脫臭餾份經過酯化、中和、分層、冷析分離分層、蒸餾得30%天然VE祖品，超臨界萃取或正己烷萃取，可得80%以上的天然VE混合液。脫臭物制備天然VE濃縮液的技術已經較為成熟，エ業收率可達60%左右。特別是北京化工大學、上海交大、清華大學等開發成功分子蒸餾、超臨界萃取等天然維生素E提取分離新技術，加快了天然維生素E產業化進程。國內已有多家企業采用脫臭餾份為原料生產天然維生素E。但是制得的維生素E產品是d-a、d-P、d-Y、d-S生育酚構成的混合物，并且成本高。上述產品中d-a -生育酚的純度在5-15%，達不到國際標準。采用上述エ藝制備的天然維生素E濃縮液，實際上是d-a，d-^ , d-Y , d-6生育酚的混合物，其中，d-a生育酚的生物活性最高。由于原料的差異，所得到的組成成份差別較大，導致生物活性的差別也較大。為了提高生物活性，國內以天然VE混合液為原料，將d-P-，d-Y-和d-S生育酚轉化為d-a生育酚，増加天然VE的生物活性，國外標準d- a -生育酚純度98%，中國標準純度90%。國內外多家科研院所針對從油渣制備維生素E進行了大量研究，但目前尚未實現エ業化。用油渣制備天然維生素E，一方面可以產生較好的經濟效益，對于油渣綜合利用、環境保護具有現實意義。目前國外以油渣為原料，カロ入酶和緩沖液進行處理，直接得到混合天然維生素E，然后經過金屬催化劑將d- 3，d- Y，d- 8 -生育酚轉化為d-a -生育酚，這種制造方法仍然是化學合成方法。我們的研究是采用酶工程方法轉化制備d-a -生育酚，這種方法效率高，無污染，具有良好的發展前景，在國際上處于領先地位，可用于エ業化應用。天然維生素E的效カ是合成維生素E的5倍以上。天然VE以其良好的抗氧化功能和安全性得到廣泛應用，國外醫藥，食品，化妝品必須使用天然維生素E(USP美國標準)。近年來天然維生素E需求量超過合成維生素E的增長速度，年均增長率為15%左右。但由于其產量的增長受限于原料來源，不能滿足市場需求，處于賣方市場，價格逐年上升，目前已高出合成維生素ElO倍以上。此外，我國具有發展天然維生素E的豐富原料資源。中國是世界上油料生產大國，大豆、花生和菜籽等油料作物的年產量分別為1800萬噸、1100萬噸和1000萬噸。年食用油的總產量1000萬噸。隨著人民生活水平的不斷提高，色拉油消費量不斷増加，廣東、北京、上海、江蘇、山東、河南等省市已建有近30家大型色拉油加工廠，毎年副產大量的油渣，為天然維生素E的生產提供了豐富的原料。植物油精煉后油渣中含有質量分數5%的天然維生素E (天然維生素E生產現狀與應用前景.化工技術經濟2002年，第4期)。國內將榨油后的油渣作為肥料，沒有利用開發，所以利用“生物技術”從油渣提取天然維生素E是關鍵。因此，探尋ー種利用我國豐富的油渣原料來生產對人體無害的天然維生素E的方法，就成為該技術領域研究人員的ー個重要課題。

發明內容
本發明的目的是提供一種用酶工程法生產d- a -生育酚的方法。該方法既不同干現有的用重金屬催化生產d- a -生育酚的合成方法，也不同于將Y -生育酚甲基轉移酶導入轉基因植物生產a-生育酚的方法。國內外a -生育酚的生產方法很多,如三甲基氫醌與異植物醇的化學合成法；a -生育酚的兩步合成法(如羥甲基化-還原法、氯甲基化-還原法、胺甲基化-還原法和酰甲基化-還原法)，由于天然生育酚都是右旋的，甲基化反應只能發生在苯環上，側鏈上的碳原子構型不會受到影響，所以化學金屬催化甲基化后的產物基本上也都是具有旋光性的d- a -生育酚(植物維生素E合成相關酶基因的克隆及其在體內功能研究進展.植物學通報2006年，23 (I) :68-77)。本發明是要探索一種無害化，低成本的エ業化生產d- a -生育酚的方法，生產真正意義上的純天然a -生育酚產品，即純右旋a -生育酚(d- a -生育酚)，真正地造福于人類。這種d-a -生育酚的生產方法，其特征在于向混合生育酚中加入Y-生育酚甲基轉移酶(Y -tocopherolmethyItansferase, y -TMT)。Y -TMT 是光合生物維生素 E 生物合成途徑中的最后ー個酶，它催化d-Y -生育酚甲基化形成生物活性最高的生育酚d- a -生育酚。本發明利用的原料是混合生育酚，混合生育酚在市場上有很多公司出售，它來自食用油精煉過程中產生的下腳料--脫臭餾出物，脫臭餾出物中維生素E的含量隨油脂精煉エ藝的不同而不同，一般在3 8%范圍。本發明使用的￥づ1^利用集胞藻？06803或聚球藻1^1(10224制備，具體方法如下將集胞藻PCC6803或聚球藻MBIC10224(均購自中國科學院上海植物研究所)在培養液中培養，獲得含有大量Y-生育酚甲基轉移酶的菌液，隨后通過離心分離濃縮的方法、或者是用こ醇萃取濃縮和冷卻的方法獲得Y-生育酚甲基轉移酶。本發明的酶工程法生產d-a-生育酚的方法，其特征在于，包括以下步驟A、取100克混合生育酚，加熱至50 75°C，在攪拌下加90%こ醇溶液200克，カロ2%的三甲胺反應2小時；B、加入90%的Y-生育酚甲基轉移酶2毫克進行轉化12-24小吋；
C、萃取、水洗、干燥、濃縮和分子蒸餾得d-a -生育酚。本發明人經過大量實踐，優化了實驗參數，摸索出上述實驗條件，出人意料的發現d-^,d-y,d-6-生育酚的轉化率超過90 %。本發明的酶工程法生產d-a-生育酚的方法，具體來說，包括以下步驟A、首先取2. 2L，pH值為7.4的O.OlnM LB培養基，將其在121°C下滅菌10分鐘，而后加入2克集胞藻PCC6803，使其在28°C、轉速300rpm條件下進行48小時的藻細胞培養；B、向培養液中注入摩爾濃度為0. 12mM的枸櫞酸30mL，并對加酸處理后的培養液進行離心分離處理，將分離后獲得的細胞沉淀用純水洗滌數次獲得洗浄的藻細胞體；C、最后使用Mulitibeads shocker B-300振蕩,攪拌I小時后,使藻細胞體破碎，離心分離得到沉淀物；D、將上述沉淀物放入30%こ醇溶液中，在20°C下攪拌30分鐘后，進行離心分離后除去こ醇溶液相；E、再次加入95%こ醇，在50°C下攪拌30分鐘后，通過過濾得到含有Y _生育酚甲基轉移酶的提取液；F、先對該提取液進行不少于10小時的4°C冷卻處理，使Y -生育酚甲基轉移酶析出，得到Y-生育酚甲基轉移酶的初次結晶；而后再使用95%こ醇通過用10小時冷卻至4°C，即可得到純度為90%的Y-生育酚甲基轉移酶的結晶；G、取IOOg混合生育酚，加熱50 75°C，在攪拌下加90%こ醇溶液200g，加2%的三甲胺反應2小時后加入90%的Y -生育酚甲基轉移酶2mg進行轉化12-24小時，萃取、水洗、干燥、濃縮和分子蒸餾得d- a -生育酚。
對產物的定量分析使用安捷倫1100高壓液相色譜儀。分析條件柱溫30°C，采用100%甲醇為洗脫劑，流量1000mL/min。樣品吸收波長210nm，在液相色譜條件下，d_ a -生育酚的保留時間為6. 047min, d_ P-、d_ Y -生育酚保留時間均在5. 258min左右，兩峰在檢測中經常重合；d- S -生育酚保留時間為4. 637min。d-a-生育酚(天然維生素E)主要是從植物油中蒸餾提取，主要的植物油中a-生育酚的含量僅為7%-10%，而其生物合成前體Y-生育酚卻高達67%-70%。使用Y-TMT可以大大降低エ業化生產天然維生素E產品的成本，提高產品的產量和質量，在醫藥、保健品、食品、營養品、化妝品和飼料等方面具有廣泛的應用前景。本發明制備的d-a -生育酚具有以下優點I.穩定，不被空氣的氧氧化。2.純天然產品，沒有殘留物，也沒有任何抗氧化劑，保護劑等化學制品。3.用于食品，藥品,化妝品，安全可靠4.用Y-生育酚甲基轉移酶轉化生產純d-a-生育酚可用于針劑，輸液，對人體沒有免疫原性反應。
具體實施例方式綜上所述，本發明的使用Y -生育酚甲基轉移酶轉化法生產的d- a -生育酚方法，具有上述諸多優點及實用價值，并在同類制備方法中未見有類似的設計公開發表或使用。而且本發明技術方案確屬首創，并且具有產業化的廣泛利用價值。上述說明僅是本發明技術方案的概述，為了能夠更清楚了解本發明的技術手段，而可依照說明書的內容予以實施，并且為了讓本發明的上述和其他目的，特征和優點能夠更加明顯易懂，以下特舉最佳實施例詳細說明如下實施例I.利用集胞藻PCC6803制備、-生育酚甲基轉移酶A、首先取2. 2L DMEM-I培養液，將其在121°C下滅菌10分鐘，而后加入2克集胞藻PCC6803，使其在28°C環境下，在轉速300rpm條件下進行48小時的細菌培養；B、向培養液中注入克分子濃度為25%的枸櫞酸30毫升，并對加酸處理后的培養液進行離心分離處理，4°C，5000rpm, 30分鐘，將分離后獲得的含水物用純水洗滌數次獲得洗凈的細菌體；C、最后使用Mulitibeadsshocker B300振蕩，振蕩頻率60次/姆分振幅20MM, 振蕩I小時后，使細菌體破碎，離心分離得到沉淀物；D、將上述沉淀物放入作為提取溶劑的30%こ醇溶液中，在20°C下攪拌30分鐘后，進行離心分離，4°C，5000rpm，30分鐘，然后除去こ醇溶液相；E、再次加入95%こ醇，在50°C下攪拌30分鐘后，通過過濾，采用MILLIIP0RE Ultracel-lOMembrane, IOKda ；24/Pk, 4°C, 6000rpm, I 小時后取上層結晶體，放置 20°C，得
到含有Y-生育酚甲基轉移酶提取液；F、先對該提取液進行不少于10小時的冷卻處理至4°C，使Y -生育酚甲基轉移酶析出，得到Y-生育酚甲基轉移酶的初次結晶，而后再使用95%こ醇通過用10小時冷卻至10°C，得到Y-生育酚甲基轉移酶的結晶。實施例2.利用聚球藻MBIC10224制備Y -生育酚甲基轉移酶A、向含2. 2升DMEM-I培養液的3L細胞發生器中加入按質量計I %的聚球藻MBIC10224濕菌體，在30°C，無氧條件下，攪拌轉數300rpm條件下培養28小時；B、培養結束吋，向培養液中加30毫升25%枸櫞酸溶液，通過離心分離培養物收集細菌體得到的180克濕物體用水洗滌3次，得到洗凈細胞體；C、使用Mulitibeadsshocker B300振蕩，攪拌I小時后，使細胞體破碎，離心分離得到沉淀物；D、向180克沉淀物中添加水,使其恢復衆狀后，通過噴霧干燥得到干燥細胞體；E、向該干燥細胞體中加入作為提取溶劑的1000毫升こ醇，在50°C下攪拌30分鐘后，離心分離，除去こ醇溶液相；F、再次加入こ醇，在50°C下攪拌30分鐘后，通過過濾得到Y _生育酚甲基轉移酶提取液；G、通過對該提取液冷卻至4°C 10小時以上，使Y-生育酚甲基轉移酶析出，得到Y-生育酚甲基轉移酶的結晶。實施例3.制備d-a-生育酚(I)取IOOg混合生育酚，水浴加熱50 75°C，在攪拌下加90%こ醇溶液200g。(2)加2%的三甲胺反應2小時后加入Y-生育酚甲基轉移酶溶液2ml進行轉化12-24小時。(3)經過萃取、水洗、干燥、濃縮和分子蒸餾，得到d-a -生育酚。 實施例4. d- a -生育酚エ業化生產
取IOOkg植物油提取后的油渣加聚球藻MBIC10224菌120g濕菌體，混合后30°C固體發酵72-100小吋。此處的油渣含有混合生育酚(經檢測，d-a-生育酚含量為85%，d-y-生育酚的含量為2. 5 %，d- 0 -和d- S -生育酚的含量共為12. 5 % )，水浴加熱50 75°C，在攪拌下加90%こ醇溶液200g。カロ2%的三甲胺反應2小時后加入90%的Y-生育酚甲基轉移酶2mg進行轉化12-24小吋。萃取、水洗、干燥、濃縮和分子蒸餾得d-a -生育酚，采用高效液相色譜法測定維生素E的含量色譜柱硅酮(0V-17)為固定相，涂布濃度為2%，或以HP-I毛細管柱(100%ニ甲基聚硅氧烷)為分析柱；理論塔板數按維生素E峰計算不低于500 (填充柱)或5000 (毛細管柱，色譜條件流動相正己烷+正戊醇=997 3檢測波長254nm
柱溫265°C操作步驟分別精密吸取上述供試品溶液與對照品溶液，I 3 y L注入氣相色譜儀，用紫外吸收檢測器，于波長254nm處測定維生素E和內標正三十ニ烷的吸收值，按內標法以峰面積計算，即得.國家藥典2005版)經過上述HPLC檢測，產物中d-a -生育酚的濃度達到98. 6%。通過本發明的方法，用于醫藥級的可以大量生產天然(純右旋d-a -生育酚)、穩定、無有機溶劑，無重金屬的純d-a -生育酚，100%純天然d-a -生育酚對人體沒有任何過敏原。安全、可靠，本發明的方法可用于醫藥エ業化生產。
權利要求
1.ー種d-a-生育酚的生產方法，其特征在于，向混合生育酚中加入Y-生育酚甲基轉移酶。
2.如權利要求I所述的d-a-生育酚的生產方法，其特征在于，該方法包括以下步驟 A、取100克混合生育酚，加熱至50 75°C，在攪拌下加90%こ醇溶液200克，加2%的三甲胺反應2小時； B、加入90%的Y-生育酚甲基轉移酶2毫克進行轉化12-24小時； C、萃取、水洗、干燥、濃縮和分子蒸餾得d-a -生育酚。
3.如權利要求I或2所述的d-a-生育酚的生產方法，其特征在于，所述Y-生育酚甲基轉移酶由集胞藻PCC6803或聚球藻MBIC10224制備。
4.如權利要求3所述的d-a-生育酚的生產方法，其特征在于，所述Y-生育酚甲基轉移酶由集胞藻PCC6803制備，包括以下步驟 A、首先取2.2L DMEM-I培養液，將其在121°C下滅菌10分鐘，而后加入2克集胞藻PCC6803，使其在28°C環境下，在轉速300rpm條件下進行48小時的細菌培養； B、向培養液中注入克分子濃度為25%的枸櫞酸30毫升，并對加酸處理后的培養液進行離心分離處理，4°C，5000rpm, 30分鐘，將分離后獲得的含水物用純水洗滌數次獲得洗凈的細菌體； C、最后使用MulitibeadsshockerB300振蕩，振蕩頻率60次/毎分，振幅20MM，振蕩I小時后，使細菌體破碎，離心分離得到沉淀物； D、將上述沉淀物放入作為提取溶劑的30%こ醇溶液中，在20°C下攪拌30分鐘后，進行離心分離，4°C，5000rpm，30分鐘，然后除去こ醇溶液相； E、再次加入95%こ醇，在50°C下攪拌30分鐘后，通過過濾，采用MILLIIP0REUltracel-lOMembrane, IOKda ；24/Pk,4°C,6000rpm, I 小時后取上層結晶體，放置 20°C，得到含有Y-生育酚甲基轉移酶提取液； F、先對該提取液進行不少于10小時的冷卻處理至4°C，使Y-生育酚甲基轉移酶析出，得到Y-生育酚甲基轉移酶的初次結晶，而后再使用95%こ醇通過用10小時冷卻至10°C，得到Y-生育酚甲基轉移酶的結晶。
5.如權利要求3所述的d-a-生育酚的生產方法，其特征在于，所述Y-生育酚甲基轉移酶由聚球藻MBIC10224制備，包括以下步驟 A、向含2.2升DMEM-I培養液的3L細胞發生器中加入按質量計I %的聚球藻MBIC10224濕菌體，在30°C,無氧條件下,攪拌轉數300rpm條件下培養28小時； B、培養結束吋，向培養液中加30毫升25%枸櫞酸溶液，通過離心分離培養物收集細菌體得到的180克濕物體用水洗滌3次，得到洗凈細胞體； C、使用MulitibeadsshockerB300振蕩，攪拌I小時后，使細胞體破碎，離心分離得到沉淀物； D、向180克沉淀物中添加水,使其恢復衆狀后,通過噴霧干燥得到干燥細胞體； E、向該干燥細胞體中加入作為提取溶劑的1000毫升こ醇，在50°C下攪拌30分鐘后，離心分離，除去こ醇溶液相； F、再次加入こ醇，在50°C下攪拌30分鐘后，通過過濾得到Y-生育酚甲基轉移酶提取液；G、通過對該提取液冷卻至4°C 10小時以上，使Y-生育酚甲基轉移酶析出，得到Y-生育酚甲基轉移酶的結晶。·
全文摘要
本發明涉及一種酶工程法生產d-a-生育酚的工業化方法。該方法通過γ-生育酚甲基轉移酶將d-β、d-γ、d-δ生育酚轉化為d-α-生育酚，以區別于化學合成的金屬催化劑甲基的轉化。這種方法效率高，無污染，生產真正意義上的純天然d-α-生育酚產品，即純的右旋α-生育酚。
文檔編號C12N9/10GK102839199SQ20121029162
公開日2012年12月26日 申請日期2012年8月16日 優先權日2012年8月16日
發明者熊軍, 婁彩玲, 李國興, 陳芝榮, 單曉昌 申請人:熊軍