專利名稱：用于研究分子的設備和方法
技術領域：
本發(fā)明涉及用于研究分子、特別是生物學分子諸如核酸或蛋白的設備和方法。本設備和方法涉及納米等級技術的應用到迅速和詳細分析這些分子的問題。在一方面，本發(fā)明涉及測序核酸的設備和方法。
背景技術：
迅速測試核酸的能力在生物學中保持最高的重要性。盡管現(xiàn)在已知許多基因組(包括人)的完整序列，且將可獲得許多更多的序列，但是由于許多原因仍保持對獲得序列數(shù)據(jù)的需要。目前的測序技術主要基于Sanger(“雙脫氧”)技術且費力費時。包括檢測通過聚合酶引入單核苷酸的方法固有地受到聚合酶能合成互補DNA鏈的相對較低速率的限制。目前，關于單測序裝置的最大測序速率是約I堿基/秒；盡管是超越常規(guī)Sanger測序技術的進歩，但仍然非常緩慢。提議了通過檢測當DNA通過導電孔時的電流變化來測序DNA的方法。盡管這樣的方法具有高理論最高檢測速度，但是至今為止僅獲得相對低的檢測速率，且似乎很可能在不徹底改變總設計或使用導電標記的條件下，檢測的限制將保持很低。納米技術，如同生物學，是迅速發(fā)展的領域且產(chǎn)生用于處理和分析分子的新型方法和材料。納米技術人員現(xiàn)在能夠生產(chǎn)和處理低至納米以下等級的材料。這提供發(fā)展具有新的且以前從未考慮過的潛力的裝置或技術的潛力。然而，盡管納米技術在例如，電子エ業(yè)中發(fā)現(xiàn)了功用，但是其尚未廣泛用于生物學領域中。等離子共振是這樣的現(xiàn)象，其中金屬表面上的等離子受到該表面上光入射的激發(fā)。等離子共振用于大量常規(guī)分析儀，諸如Biacore 中。在激發(fā)平面上的等離子的情形中，使用術語表面等離子共振(SPR)，且在激發(fā)納米尺寸的顆粒的情形中，經(jīng)常使用術語局部表面等離子共振(LSPR)來區(qū)分這方面現(xiàn)象。當光照射小金屬顆粒時，振蕩電場導致所述顆粒的電子相干振蕩。這些電子的共同振蕩稱為偶極等離子共振。電子云中的共同振蕩產(chǎn)生強烈的、高度局部化的電磁場(EMF)。為了產(chǎn)生這些共同振蕩，必須使用正確的激發(fā)波長。該波長應該取決于被激發(fā)的金屬顆粒或納米結構物的尺寸和形狀。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，通過使用可以用納米技術獲得的高度局部化的SPR，可以在納米等級研究生物學分子的結構。

發(fā)明內(nèi)容
根據(jù)本發(fā)明，提供用于研究分子的設備，其包括:-至少ー個處于基底中的 通道，所述通道適合于分子從其中通過；-至少ー個能夠等離子共振的金屬結構部分，所述至少ー個金屬結構部分與所述通道結合，所述金屬結構部分處于適合由所述金屬結構部分產(chǎn)生的電磁場與經(jīng)由所述通道通過的分子相互作用的位置處；-用于誘導分子通過所述通道的裝置；-用于誘導所述金屬結構部分中的表面等離子共振的裝置；和-用于檢測由所述金屬結構部分產(chǎn)生的電磁場與通過所述通道的分子之間的相互作用的裝置。適當?shù)兀鲈O備包括兩個儲存器:第一儲存器適合于接受包括待研究分子的樣品，且第二儲存器適合于所述分子一旦通過所述通道便進入其中。合適地，這兩個儲存器彼此通過基底分開，且分子必須通過至少ー個通道而從第一儲存器進入第二儲存器。因此所述基底可以被認為是分開這兩個儲存器的膜或隔膜。一般地，所述通道的尺寸應該適合于待研究的分子通過該通道，且這樣迫使該分子以合適地靠近所述金屬結構部分來通過，以使所述分子和由金屬結構部分產(chǎn)生的局部化EMF之間發(fā)生相互作用。所述通道通常也應該具有合適的尺寸，以使得毎次僅ー個分子可以通過該通道。一般地，優(yōu)選的是該通道是孔，盡管其也可能是其他通道形式，諸如處于基底中的縫或槽也可以是合適的。所述孔可以具有任何合適的形狀，盡管最容易想到圓形或近似圓形的孔。所述孔(或通道) 可以具有約0.5nm-100nm,優(yōu)選50nm以下，尤其30nm以下的直徑。盡管使用術語直徑，但應該理解這不意味著嚴格的幾何學含義且可以，例如應用于非圓形孔或通道的最小維度。通常，基底中的小孔(small apertures)稱為“小孔(pores) ”,且該術語可以貫穿說明書中使用，且應該得到相應的解釋。在待研究的分子是核酸的情形中，單鏈核酸通過的最小孔是約lnm。雙鏈核酸應該通過約2nm以上的孔[見Heng J.B.等Biophysical Journal (生物物理學雜志)(2OO6),90，1098-1106]。因此，在研究單鏈核酸的情形中，優(yōu)選地，所述孔的直徑應該是1nm-1OOnmdt-lnm-30nm,尤其是1-1Onm,特別地l_5nm。對于雙鏈核酸,所述孔的直徑應該是2nm-100nm,優(yōu)選 2nm-30nm,尤其是 2nm_4nm。所述通道可以由任何合適的物質(zhì)形成。其可以是有機的或無機的。在一個實施方案中，所述孔可以由“有機”小孔，即源自天然存在的結構，例如具有小孔的蛋白質(zhì)諸如a-溶血素的小孔或線粒體外膜中存在的有機小孔形成。備選地，所述孔可以由常規(guī)用于處理核酸或其他生物學分子的凝膠，諸如瓊脂糖或聚丙烯酰胺提供。備選地，所述孔可以在基底，諸如由氮化硅或其他這樣的物質(zhì)形成的膜中改造。參見，例如，Ho C.等，PNAS(2005) ,102(30) 10445-10450，其中討論了由氮化硅形成納米直徑小孔的方法。所述孔還可以由納米孔材料諸如多孔金，膠體晶體，膠體腔，金屬環(huán)等形成。Netti等描述了金納米腔的形成及其形成表面等離子的能力[見Netti M.C.等AdvancedMaterials (高級材料)(2001), 13 (18), 1368-1370]。Aizpurua 0.等描述了金納米環(huán)的形成[見 Aizpurua 等 Physical Review Letters (物理學綜述書信)(2003), 90 (5)，057401-1-057401-4]。Lesuffleur等討論了具有增強的等離子共振的金納米孔陣列[Lesuffleur A.等,Applied Physics Letter (應用物理學書信)(2007), 90, 243110]。在孔本身由能夠展示LSPR的金屬物質(zhì)形成的情形中，則可能不需要単獨的金屬結構部分應該是顯然的。用于納米-工程以產(chǎn)生多種適合于本發(fā)明的結構的裝置是公知的，但其也是迅速發(fā)展的技術領域。同樣地，預期將來將開發(fā)適合于形成如本發(fā)明所需的處于基底中的通道的新型技術和材料，這樣的技術屬于本發(fā)明的范圍。通常優(yōu)選地，所述設備包括多個通過基底的孔。所述孔可以以陣列形式排列，其中每個孔的位置受到控制；這在使用納米-工程形成處于基底中的孔的情形中特別方便。備選地，孔可以分散在基底上，其位置不受控制。金屬結構部分必須能夠形成表面等離子并由此在該結構部分附近處形成局部化EMF。任何適合于獲得該功能的材料適合用于該金屬結構部分。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)金、銀、銅和鋁金屬在等離子形成和傳播方面具有理想特性，并且因此，金屬結構部分主要或完全由這些金屬中的ー種或多種形成通常是優(yōu)選的。納米技術容許形成基本任何形狀的金或銀顆粒。形狀可以對由顆粒產(chǎn)生的EMF具有重大影響[見Mock J.J.等，Journal of Chemical Physics (化學物理學雜志),116(15) ,6755-6759]。球形或基本球形(例如，球體或扁球體)顆粒具有適合的特性且由此形成金屬結構部分的合適的實施方案。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)具有50nm-150nm的直徑的球形金屬顆粒是特別適合的，這歸因于高水平的突光增強[ 見Nakamura和Hayashi, Japanese Journal of AppliedPhysics (日本應用物理學雜志)，44 (9A)，6833-6837]。在備選的實施方案中，可以使用環(huán)形金屬結構部分。所述環(huán)形結構部分具有某些益處；已經(jīng)顯示出環(huán)內(nèi)的EMF 很強，且在由環(huán)限定的內(nèi)部區(qū)域內(nèi)相對恒定[見Aizpurua等，同前]。在金屬結構部分是環(huán)形的情形中，該環(huán)本身可以形成使分子通過其中的孔應該是顯然的。制備所述納米-環(huán)的方法記述在Aizpurua等中。其他形狀諸如多邊形棱柱或其他多邊形狀也可能是適合的。為了清楚，指出可以有多于ー個金屬結構部分與具體的通道結合，且可以使用多于ー種類型的金屬。實際上，使用兩種以上金屬材料是理想的，以使得產(chǎn)生最大EMF區(qū)，這是組合每個結構部分的可分開的EMF的結果。這可以在高度局部化的區(qū)域內(nèi)引起非常高的EMF 值。通常重要地是，將金屬結構部分排列在這樣的位置，以使得其與通過所述小孔的分子相互作用，但與所述小孔具有充足的間隔，以防止或減弱對由該分子發(fā)射的信號的猝滅。這可以以許多方式實現(xiàn)。所述通道可以具有這樣的形狀和尺寸，以使得通過其中的分子被限定在這樣的位置，即其既不過份靠近(因此避免猝滅)，也不過份遠離(因此確保相互作用)金屬結構部分——這在所述小孔本身不具有猝滅活性時尤其適合。備選地，可以用控制裝置來引導分子，以使其不過份靠近金屬結構部分。典型地，金屬結構部分的表面應該定位在距通過通道的分子50nm以下，優(yōu)選30nm以下，尤其IOnm以下。用于誘導分子通過通道的裝置可以是誘導電泳的裝置、微射流裝置、或激光捕集裝置中的ー種或多種。然而，任何其他適合于誘導分子運動到和/或通過所述通道的裝置也可以是合適的。所述設備可以包括用于控制分子朝向、進入和/或經(jīng)過所述孔通過的控制裝置。所述控制裝置可以適合于控制速率、方向、位置或分子構象中的ー種或多種。控制裝置的類型應該根據(jù)待研究的分子的類型和所需控制的類型而變化。在需要測序核酸的情形中，控制線性核酸分子經(jīng)過通道的通過速度非常重要。為了測序，還需要使核酸分子保持為線性構象。在一個實施方案中，控制裝置可以包括分子由其中通過的多孔基質(zhì)，所述多孔基質(zhì)位于緊鄰通道入口處。在使用多孔基質(zhì)的情形中，如果通過電泳誘導分子通過該基質(zhì)，則很方便。多孔基質(zhì)的特性與電泳條件的結合適合于容許精細控制分子(例如核酸)經(jīng)過所述基質(zhì)和進入通道的運動。可以實現(xiàn)對核酸經(jīng)過凝膠的運動速度的精確控制。經(jīng)過多孔基質(zhì)電泳的另ー個優(yōu)勢是線性分子的構象被拉出到延長的線性形式，該形式特別適合于測序。合適的多孔基質(zhì)可以由用于處理核酸和蛋白質(zhì)的常規(guī)材料，諸如聚丙烯酰胺或瓊脂糖形成。備選地，其他納米-多孔材料也可以是適合的。上述控制裝置充分適合于控制核酸和其他線性分子。其他的分子可能需要不同水平的控制，或控制的程度可能更高或更低。應該注意到，用于誘導分子通過所述通道的裝置和控制裝置可以以相同手段提供。例如，單獨的在液體介質(zhì)中電泳可以適合于在不需要精確控制構象和速率的情形中控制分子。備選地，激光捕集可以用于精確控制分子朝向和進入通道的運動。用于檢測金屬結構部分與分子的相互作用的裝置當然可以是可以檢測由所述結構部分產(chǎn)生的局部化EMF和與其靠近的分子之間的相互作用的任何合適裝置。合適的裝置可以包括用于檢測熒光的裝置或用于檢測拉曼散射的裝置。用于檢測熒光的合適裝置包括足夠靈敏以檢測由通過EMF區(qū)的熒光團發(fā)射的光子的任何裝置。合適的裝置包括光電倍增管或雪崩光電ニ極管。熒光適合于檢測固有熒光性分子或用熒光團標記的分子。用于檢測拉曼散射的合適裝置包括拉曼分光計。拉曼散射可以用于檢測未標記的和非熒光性分子。用于檢測拉曼散射的技術在本領域中是公知的。本發(fā)明中利用拉曼散射的檢測基于表面增強的拉曼光譜學現(xiàn)象[背景參見Jeanmaire, David L.； Ri chardP.van Duyne (1977)." Surface Raman Electrochemistry Part 1.Heterocyclic,Aromatic and Aliphatic Amines Adsorbed on the Anodized Silver Electrode (表面拉曼電化學部分1.吸附在陽極化處理的銀電極上的雜環(huán)、芳族和脂族胺)".Journal ofElectroanalytical Chemistry (電分析化學雜志)84:1_20.]。在許多實施方案中，使用不依賴于標記分子的檢測方法可以是優(yōu)選的。這簡化待研究樣品的制備，并且也不需要存在可能干擾分子經(jīng)過通道的標記物。在另一方面，本發(fā)明提供用于研究分子的方法，其包括以下步驟；-提供包含待研究的分子的流體樣品；-誘導所述分子通過處于基底中的通道，所述通道具有結合的金屬結構部分，所述金屬結構部分被誘導具有等離子共振；

-在所述分子通過所述通道時，檢測由所述金屬結構部分產(chǎn)生的電磁場與所述分子之間的相互作用。優(yōu)選地，所述分子是生物學分子，例如核酸或蛋白質(zhì)/肽。線性分子諸如核酸或線性蛋白/肽特別適合于利用本發(fā)明方法來研究。單鏈核酸尤其適合于利用本發(fā)明方法來研究。在優(yōu)選的實施方案中，所述方法是測序核酸的方法。然而，所述方法也可以用于研究其他類型的分子，并不需要用于進行測序。在其他潛在應用中，設想了所述方法用于計數(shù)樣品中的単獨分子和定位線性分子上標記的應用。盡管不是必需地，所述分子包括與金屬結構部分相互作用的標記物可以是優(yōu)選的。因此，所述方法還可以包括用將與所述金屬結構部分相互作用的標記物標記所述分子的步驟。合適的標記包括熒光團。熒光團在與熒光標記全部類型生物學分子有關的領域中是公知的。在本發(fā)明中，熒光團足夠小以使得其不抑制被標記分子通過所述通道是非常重要的。典型地，熒光團應該具有2nm以下的有效尺寸，且優(yōu)選是任何維度測距小于Inm的染料分子。合適的熒光團的實例包括玫瑰紅，Alexa Fluor 488 C5_馬來酰亞胺，AlexaFluor 532 C2-馬來酰亞胺和若丹明紅C2-Hieleimide,和若丹明綠。這些熒光團可以分別用于利用本領域中已知的技術來標記核酸的堿基。適當?shù)兀龇肿邮窃谄渲袠擞浟颂厥鈮A基的大部分或全部的核酸。在優(yōu)選的實施方案中，標記分子中的一種或多種堿基的大部分 或全部，每種類型的堿基包含具有可分別鑒定放射譜的標記物。在特別優(yōu)選的實施方案中，標記全部，或基本全部堿基，每種類型的堿基包含具有可分別鑒定放射譜的標記物。在Tasara等,Nucleic Acids Research(核酸研究)，2003，31 (10)，2636-2646中討論了核酸的高密度標記。選作標記物的熒光團能夠與由金屬結構部分產(chǎn)生的EMF相互作用是非常重要的。使熒光團與特殊特性的金屬結構部分相匹配是常規(guī)方式。通常，為了金屬結構部分和熒光團之間的良好相互作用，優(yōu)選地，熒光團具有比金屬結構部分的局部化表面等離子共振峰能量略低的發(fā)射峰，即熒光團發(fā)射峰由LSPR峰略微紅移。紅移約20-150meV是合適的，優(yōu)選約 40-120meV[見 Chen 等，Nano Letters (納米書信)(2007)，7 (3)，690-696]。根據(jù)另一方面，本發(fā)明提供適合用在用于研究分子的設備中的基底，所述設備包括:-至少ー個處于基底中的通道，所述通道適合于分子從其中通過；和-至少ー個適合于在其中誘導等離子共振的金屬結構部分，所述至少ー個金屬結構部分與所述通道結合，所述金屬結構部分處于使得由所述金屬結構部分產(chǎn)生的電磁場能夠與經(jīng)由所述通道通過的分子相互作用的位置處。優(yōu)選基底的其他詳細信息記述在上文中。


現(xiàn)將通過非限制實施例，參考附圖描述本發(fā)明的實施方案，其中:圖1顯示適合用于本發(fā)明中的小孔和電極；圖2顯示包括小孔和電極的基底；
圖3顯示按照本發(fā)明的設備的方面的圖示；圖4顯示按照本發(fā)明的設備的實施方案的圖示；和圖5-7顯示所述基質(zhì)的備選結構的圖示。
具體實施例方式背景當光照射小球形金屬顆粒時，振蕩電場導致顆粒的電子相干振蕩。這些電子的共同振蕩稱為偶極等離子共振。電子云中的共同振蕩產(chǎn)生強烈的、高度局部化的電磁場(EMF)。為了產(chǎn)生這些共同振蕩，必須使用正確的激發(fā)波長。該波長應該取決于被激發(fā)的金屬顆粒的尺寸和形狀。關于·具體顆粒的正確波長可以容易地通過實驗來確定或，對于某些形狀，可以利用已知的建模技術來預測。[I]中已經(jīng)顯示由金屬膠體諸如金或銀納米顆粒的等離子共振產(chǎn)生的EMF可以用于激發(fā)常用的熒光標記諸如，特別地，Cy5和玫瑰紅。這些實驗包括將金或銀納米顆粒置于表面上并定位熒光團以使得它們受益于增強的EMF。這導致所謂的金屬增強的熒光性(MEF)。當將熒光團置于展示等離子共振的金屬顆粒附近吋，該熒光團受益于局部化的EMF和沒有得到充分理解的其中熒光壽命縮短的現(xiàn)象。當檢測分子的拉曼散射吋，發(fā)生類似的現(xiàn)象。在分子如果緊密靠近展示局部化表面等離子共振的金屬顆粒的情形中，觀察到拉曼散射水平的顯著増大。由于突光團的最大光子發(fā)射通過其量子產(chǎn)率和突光壽命確定，所以較短的突光壽命導致較高的光子發(fā)射。具有90%量子產(chǎn)率和2.5ns熒光壽命的熒光團可以發(fā)射最大360百萬個光子/秒。實際上，熒光染料可以在衰退前發(fā)射數(shù)百萬光子。通過誘導高度局部化增強的EMF，諸如已經(jīng)利用金和銀膠體陣列，[1，2]以及在膠體納米晶體[3]，光子晶體納米腔[4]，金屬納米環(huán)[5]和多孔金屬薄膜[6]中示范的那些，和定位熒光團以使其從中受益，可以誘導MEF并檢測熒光團，或備選地，檢測拉曼散射。如果制備裝置，以使得存在在任意給定時刻只有一個熒光團可以受益于MEF的區(qū)域，則該熒光團的位置可以已知。通過在孔(小孔)周圍或鄰近處安排等離子結構(例如，金屬結構部分)，可以定向熒光顆粒，以使其通過最大熒光增強(MaxFE)區(qū)域。合適的小孔包括:凝膠(常用于限制多核苷酸)，有機小孔諸如a-溶血素，固態(tài)小孔諸如可由氮化硅制成的那些，納米孔材料諸如多孔金、膠體晶體、膠體腔、金屬環(huán)，或直徑小于IOnm且優(yōu)選直徑小于5nm，尤其1.5-2.5nm之間的任何其他小孔。假設以下內(nèi)容:-兩個等離子共振表面之間的EMF在它們之間的距離減小時増大，-靠近等離子共振表面也縮短熒光團的熒光壽命，-這些表面之間的距離可以小于5nm，-且可以以小于2nm的尺寸制備膠體、多孔薄膜、2D晶體陣列、和其他納米結構，假設可以使最大光子發(fā)射發(fā)生在非常小的區(qū)域內(nèi)是合理的。以類似的方式，分子的具體特性，或分子內(nèi)的區(qū)域，可以通過拉曼散射的特有模式識別。這，在識別具體熒光團位置時，具有可識別的拉曼譜的特殊性質(zhì)的位置可以通過其與等離子結構的靠近來確定。
如果通過例如微射流或電泳方式誘導離子通過小孔，則可以使其通過該MaxFE區(qū)域，以使得可以檢測單離子-熒光團綴合物，或具有特殊拉曼譜的區(qū)域。通過誘導熒光標記的帶電離子諸如蛋白質(zhì)通過納米孔以使得每次僅一個離子可以經(jīng)由該小孔行迸，那些離子的量化可能如下:-給定兩個相同的熒光顆粒/離子綴合物，當?shù)谝粋€通過所述小孔并進入受限的EMF吋，熒光團將開始發(fā)射光子。當熒光團移動靠近MaxFE區(qū)域吋，發(fā)射增加數(shù)量的熒光團。因為光子發(fā)射與EMF強度直接相關，EMF強度又隨著到MaxFE區(qū)域的距離減小而指數(shù)増大，所以光子發(fā)射也將指數(shù)増大，由此在MaxFE區(qū)域內(nèi)產(chǎn)生光子發(fā)射峰井隨著所述綴合物移動遠離MaxFE區(qū)域而減小。第二相同熒光顆粒將產(chǎn)生相同模式的光子發(fā)射。只要峰光子發(fā)射在具有小于兩個熒光團/離子綴合物之間的距離的厚度的離散區(qū)域內(nèi)發(fā)射，則可以區(qū)分由這兩個熒光團產(chǎn)生的熒光性。-當這兩個綴合物間隔如此靠近在一起(小于0.5nm)以致于很難單獨檢測吋，MaxFE區(qū)域內(nèi)多于ー個熒光團的存在可以通過光子發(fā)射確定。暴露于相等EMF強度的2個相同熒光團應該發(fā)射是單熒光團的大約2倍那么多的光子。假設MaxFE區(qū)域可以包含2個、3個或更多綴合物，則如果已知它們經(jīng)過EMF行進的速度，則可以實現(xiàn)通過EMF的綴合物數(shù)
量的量化。通過構建2個由隔板分開的室，所述隔板確保離子僅能通過小孔由ー側到達另ー側，無論MaxFE區(qū)域可以包含2個、3個或更多綴合物，只要該數(shù)量已經(jīng)確定，則可以量化可以被誘導移動的離子。標記核酸熒光標記物通常引入單鏈(ss)和雙鏈(ds)多核苷酸DNA和RNA。存在許多充分確定的用于將熒光標記物引入到DNA的方法，且通過小心選擇DNA聚合物和熒光修飾的核苷酸，顯示出[7]可能熒光標記四種堿基(CGTA)中的ー種或多種的全部。已知dsDNA和dsRNA中的核苷酸之間的距離為0.34nm，而在ssDNA和ssRNA中，聚合物可以處于線性構象，從而容許最大空間間隔變得更大——盡管準確的距離根據(jù)施加的張カ在0.5-lnm之間變化[8]。測序方法已知可以實現(xiàn)對單鏈DNA通過有機小孔諸如a -溶血素[10]或固態(tài)氮化硅小孔的速度的精確控制[8，9]。通過標記多核苷酸從而使其一種或多種堿基的全部被熒光標記，和通過微射流、電泳或ー些其他方式誘導該多核苷酸以已知速度通過EMF，從而使核苷酸通過可能包含至少ー個熒光標記的核苷酸的MaxFE區(qū)域可以確定標記的核苷酸沿著DNA片段的位置。完整多核苷酸序列可以以下列方式裝配:假定都同時標記一種堿基的全部，則可以進行四個PCR反應，其中在每個反應中，熒光標記全部C，T，G，或A核苷酸堿基。然后鏈變性-形成ssDNA或ssRNA。再誘導每條鏈以已知的速度通過納米孔和通過能 夠包含已知數(shù)量的核苷酸的MaxFE區(qū)域。當標記的核苷酸通過EMF時，它們的位置可以相對于其他標記的核苷酸來確定——為四個相同但區(qū)別標記的多核苷酸中的每ー個提供距離圖。然后這四幅距離圖可以容易地組合為完整的多核苷酸序列。
全基因組測序:為了利用該方法測序基因組，可以使用熒光標記的隨機引物，諸如可用于全基因組擴增的那些。這些引物的序列應該是已知的，且熒光標記可以在通過所述小孔時，起指示DNA片段5’或3’方向的作用。標記的引物也應該起初始參考點的作用，標記的核苷酸的距離圖可以由該初始參考點相關聯(lián)。優(yōu)選地，四種堿基中多于ー種的全部被熒光標記且應該使用具有不同發(fā)射譜的熒光標記物來區(qū)分這些堿基。還可以使用多于ー種熒光標記譜來標記ー種堿基類型的全部，條件是該標記物具有截然不同的最大發(fā)射譜。然后可以誘導這些DNA片段以通過光子發(fā)射確定的速率通過如上所述的小孔。利用染料Cy5，獲得MEF的光子發(fā)射速率為3_9百萬光子/秒[I]。這可以容許DNA以略低于I百萬核苷酸堿基/秒/納米結構的速率通過。納米結構陣列應該容許該速度提高到乘以陣列的尺寸。由于這些引物是隨機的且基因組中DNA片段的距離圖的位置未知，所以應該需要全基因組裝配軟件諸如用于完整鳥槍法測序的那個來精確比對和裝配。本發(fā)明的優(yōu)點本發(fā)明提供多種超越其他DNA測序方法以及其他單分子檢測方法的優(yōu)點:-本發(fā)明容許增強的單分子檢測。-本發(fā)明可以用于確定單分子的位置和速度。 -盡管PCR可以用于熒光標記單分子，但是本發(fā)明的設備和方法不依賴于化學或酶反應。-所述設備可以被排列為陣列，以便數(shù)十、數(shù)百、數(shù)千或數(shù)百萬的這些納米結構可以同時運行。-利用以上概述的方法的DNA測序應該非常快速。利用該方法測序的成本應該僅限于不超過四種PCR反應物諸如熒光標記物、核苷酸、聚合酶和其他少量消費品的成本。構建方法本發(fā)明的中心在于誘導單分子以受控的方式通過高度局部化的EMF并檢測該分子和EMF之間的相互作用。存在許多充分研究的控制蛋白和多核苷酸的方法，包括凝膠、有機小孔、固態(tài)小孔、附著到珠、和固定在表面上。這容許構建廣泛范圍的可以控制單分子諸如蛋白或DNA片段使其可以通過高度局部化EMF的裝置。本發(fā)明容許使用任何表面，條件是由入射EMF誘導的等離子共振將在熒光標記的單分子或SERS中誘導MEF，且可以誘導單分子通過MaxFE區(qū)域。本發(fā)明容許任何誘導單分子通過MaxFE區(qū)域的手段，包括微射流、電泳、或激光捕集。在選擇熒光作為檢測方法的情形中，本發(fā)明容許使用任何將以所用表面的最大等離子共振頻率發(fā)熒光的熒光標記物。理想地，所述熒光標記物應該具有高量子產(chǎn)率，低熒光壽命，低分子量，且易于通過聚合酶引入。優(yōu)選地，核苷酸本身固有地具有熒光性。SERS具有不需要標記的優(yōu)點，而待鑒定的分子的特異性拉曼譜特性應該是已知的。這些特征容許以至少三種一般方式改造本發(fā)明，其中每種具有不同的優(yōu)點:-使用“有機”小孔來控制單分子容許金納米顆粒共價結合小孔本身或周圍脂質(zhì)。備選地，有機小孔可以置于較大的固態(tài)納米孔內(nèi)，諸如可以在氮化硅中制備，且可以定位等離子結構(例如金屬結構部分)以使得MEF或SERS針對有機小孔內(nèi)的那些分子或部分分子最優(yōu)化。備選地，有機小孔可以置于等離子結構諸如光子納米腔內(nèi)(參見圖5和6)。本方法的優(yōu)點包括單分子被誘導通過所述小孔的充分表征的行為，有機小孔容許的小的和高度可再現(xiàn)的孔徑，和生成所述有機小孔的低成本。-使用固態(tài)納米孔容許控制孔徑和納米定位等離子結構，以使得MEF或SERS最優(yōu)化。理想地，光子發(fā)射可以進一歩通過波導手段控制。這將容許更有效的光子檢測和更高的檢測速度。-第三種一般構建方法容許高度局部化的EMF的隨機分布，以使得多孔表面上任ー給定點的場強是未知的，且容許單分子以受控的速度但不受控的位置通過該表面(圖7)。這具有超越其他兩種方法的巨大優(yōu)勢，因為EMF或單分子的位置或分布均不精確受控，可以構建這樣的裝置的容易性相應較高。以下描述控制在20nm小孔和包含隨機分布的EMF的表面的交叉處的單分子的速度的方法。該方法具有優(yōu)勢，因為其固有是多路的。即使由通過EMF的單分子產(chǎn)生的熒光性使得每秒僅可以檢測ー個分子，但是該裝置可以是多路的，從而使數(shù)百或千或百萬個小孔同時運行。
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用于構建按照本發(fā)明的設備和進行測序的方法按照本發(fā)明的設備包括以下:-第一儲存器19，能夠容納數(shù)UL溶液并包含植入其底表面中的電極26；-具有納米孔10的陣列的硅層(基底)11，其直徑20nm且間隔Iy m蝕刻在其表面上。電極12植入硅層11中以使得每個直徑20nm的小孔10包含電極12，且每個電極12與具有高斜率的電壓源相連(未顯示)；-與所述硅層結合的多孔膜22，其上放置有金納米顆粒14的規(guī)則陣列。金納米顆粒14具有已知的尺寸和幾何形狀，且當以合適頻率激發(fā)時，產(chǎn)生EMF ；-凝膠24諸如瓊脂糖或聚丙烯酰胺應用于膜22，所述膜22具有這樣的平均孔徑，即當誘導ssDNA 20經(jīng)由凝膠22移動時，其應該采用近似線性構象。這形成本發(fā)明實施方案中的控制裝置；-在基底22的另ー側提供第二儲存器21，分子在運動通過小孔后將進入所述基底22中；-具有高斜率的電壓調(diào)節(jié)器的陣列(未顯示)與靈敏的光子檢測器諸如雪崩光電ニ極管(未顯示)相連；-提供光子檢測器諸如雪崩光電ニ極管(未顯示)；-提供基于來自光子檢測器(未顯示)的輸入控制電壓源陣列的裝置；-提供能夠在已知尺寸和幾何形狀的金屬膠體(未顯示)中誘導等離子共振的頻率的激光。進行測序的操作方法DNA通過PCR標記，如上所述，從而使給定ssDNA鏈中的兩種堿基(C和A或G和T)的全部用熒光標記物進行熒光標記，所述熒光標記物在接近，但優(yōu)選相對于所用的金屬膠體14的等離子共振頻率略紅移處具有最大發(fā)射。然后將標記的ssDNA置于第一儲存器19中。將膜22，其包被有納米孔凝膠24并含有近似平均分布的金納米顆粒14以使得它們之間的間隔在Inm-1OOnm之間隨機變化，置于第一儲存器19上。然后將硅層11置于膜22上并可以將整個組件浸沒在導電溶液中。然后向在20nm小孔10內(nèi)的電極12提供正電荷，以使得ssDNA 20被誘導經(jīng)由第二儲存器21移動進入凝膠24，以線性構象通過凝膠24并通過金納米顆粒14陣列，從而在它們通過由等離子共振產(chǎn)生的EMF時發(fā)射光子。因為在PCR反應中使用熒光標記的隨機引物，所以第一光子發(fā)射應該由5'或3'引物產(chǎn)生。獲自所述引物的光子發(fā)射應該直接指示SSDNA20片段可以被誘導經(jīng)由EMF移動且仍獲得清晰信號的速度。因為ssDNA 20在每個20nm的小孔中相對于金球14的定位對于每個ssDNA片段20而言應該不同，所以應該存在能夠在任意給定時刻應用于每個小孔10的最佳電壓。如上概述，包含關于彼此的距離和已知的引物的距離圖可以由光子發(fā)射數(shù)據(jù)創(chuàng)建。然后，該數(shù)據(jù)可以組合為完整的基因組序列。用于制備基底和進行測序的其他方法存在許多可以利用納米技術生成合適基底的方法。以下描述兩種進行測序流程的可能方法和方式。實施例1-等離子納米腔中的有機小孔(如圖5和6中所示)I)等離子結構諸如光子納米腔30的陣列由如[4]中所述的合適材料32構建，所述納米腔具有8-10nm的內(nèi)徑,如圖5中所示，或具有4_5nm的內(nèi)徑,如圖6中所示。2)然后將有機小孔34諸如a -溶血素通過[13]中提示的手段定位在這些等離子結構內(nèi)，以使得有機小孔34間隔約I ii m。3)然后精確確定這些納米腔30的等離子共振波長并選擇激光和熒光染料譜來與所定義的等離子共振相一致。該熒光染料譜應該由等離子共振峰略紅移(20-150meV)。4)如[10]中所述進行經(jīng)由有機小孔34的電解運輸。

5)來自熒光標記物的光子發(fā)射利用本領域中公知的雪崩光電ニ極管檢測系統(tǒng)來檢測。6)由所選遺傳來源提取DNA后，利用PCR和隨機引物諸如全基因組擴增中使用的那些來熒光標記ssDNA。PCR反應中存在的四種核苷酸中，一種應該僅以其染料-修飾的形式存在，以確保高密度熒光標記所選核苷酸。為了確保具有長閱讀長度的高密度熒光標記，若干熒光染料可能必須使用如[7]中所述的多種聚合酶來測試。7)然后對剩余三種核苷酸進行該PCR反應，以使得進行四次PCR反應，從而產(chǎn)生包含分別在全部C, T, G,和A核苷酸處突光標記的DNA的四份樣品。8)在DNA即將通過測序裝置前，如本領域中公知地變性PCR反應，以容許標記的ssDNA通過納米孔34。9)每次容許ー個變性PCR反應通過納米孔34。10)來自染料分子的光子發(fā)射通過精確到百萬分之一秒的Aro來獲得。使用關于ssDNA經(jīng)由小孔移動所已知的來標準化這些光子發(fā)射爆發(fā)的時刻，并且創(chuàng)建數(shù)千或百萬幅距離圖以掲示相同核苷酸之間的間隔。11)然后，將這些距離圖首先組合為相同核苷酸的四個完整的重新裝配的序列，并合成為完整的基因組序列。實施例2-合成的納米孔(如圖7中所示)I)利用本領域中公知的電子束平版印刷術，在半導體氮化硅或?qū)щ娊饘倌?0上蝕刻具有30nm以下頂端內(nèi)半徑的圓錐形納米孔陣列。這些納米孔間隔I Pm。將蝕刻的硅膜安裝在如[11]中所述的臺上，井置于處于小Teflon管(2mm直徑)中的電鍍液中，所述小 Teflon 管作為電鍍槽運作。包括 1.17% (w/w)KAu(CN) 2 的 TEMPEREX 8400 (TanakaKikinzoku)在室溫下作為電鍍液使用。將金絲(直徑0.5mm)浸沒在溶液中作為對電極。然后將1.4-1.5V的偏壓應用干與系統(tǒng)中對電極相対的初始電扱。隨后將金電鍍到所述初始電極表面上。典型地,0.2mA的誘導電流容許室溫下1A° /秒的電鍍速率。2)然后利用[11]中所述的電鍍法沉積金層42，以生成直徑為1.5-2.5nm的小孔。當受到適當波長的入射波的激發(fā)時，該結構會產(chǎn)生集中在圓錐形小孔頂端的高度局部化EMF[12]。3)當通過電泳誘導標記的ssDNA經(jīng)由小孔44移動時，各種標記物接觸到小孔44的邊緣43。由于EMF在小孔44邊緣周圍高度局部化，當熒光標記物通過該場時，應該預測到光子發(fā)射。然而，小孔44頂端處的金表面和熒光標記的ssDNA之間的接觸誘導熒光猝滅。當標記的ssDNA繼續(xù)運動通過小孔頂端并進入通道時，通道擴張。該擴張消除與等離子結構的表面的接觸和由此產(chǎn)生的熒光猝滅。4)然后精確確定這些電鍍的圓錐形小孔44的等離子共振波長，并選擇激光和熒光染料譜以與所定義的等離子共振相一致。該熒光染料譜應該由峰值等離子共振略微紅移(20-150meV)。5)經(jīng)由圓錐形納米孔44的電解運輸如[8，9]中所述進行。6)利用本領域中公知的雪崩光電ニ極管檢測系統(tǒng)檢測來自熒光標記物的光子發(fā)射。7)由所選遺傳來源提取DNA后，利用PCR和隨機引物諸如全基因組擴增中使用的那些來熒光標記ssDNA。在PCR反應中存在的四種核苷酸中，一種應該僅以其染料-修飾的形式存在，以確保高密度熒光 標記所選核苷酸。為了確保具有長閱讀長度的高密度標記，若干熒光染料可能必須使用如[7]中所述的多種聚合酶來測試。8)然后對剩余三種核苷酸進行該PCR反應，以使得進行四次PCR反應，從而產(chǎn)生包含分別在全部C, T, G,和A核苷酸處突光標記的DNA的四份樣品。9)在DNA即將通過測序裝置前，如本領域中公知地變性PCR反應，以容許標記的ssDNA通過納米孔44。10)每次容許ー個變性PCR反應通過納米孔44。11)來自染料分子的光子發(fā)射通過精確到百萬分之一秒的Aro來獲得。使用關于ssDNA經(jīng)由小孔44移動所已知的來標準化這些光子發(fā)射爆發(fā)的時刻，并且創(chuàng)建數(shù)千或百萬幅距離圖以掲示相同核苷酸之間的間隔。12)然后，將這些距離圖首先組合為相同核苷酸的四個完整重新裝配的序列，并合成為完整的基因組序列。參考文獻:[I]Fu, Yi, Lakowicz ；Joseph R., " Single molecule studies of enhancedfluorescence on silver island films (銀島膜上的增強突光性的單分子研究)"，Plasmonics (表面等離子體光子學)，第2卷,第I號,2007.
[2」Nakamura, Tosnihiro ；Hayashi, Shinji, " Enhancement of dyeiluorescence by gold nanoparticles:Analysis oi Particle Size Dependence、通過金納米顆粒增強染料焚光性:分析顆粒尺寸依賴性)"，Japanese Journal of AppliedPhysics (日本應用物理學雜志)，第44卷，第9A號，第6833-6837頁，2005.
[3]Pompa，P.P.等， "Metal enhanced fluorescence of colloidalnanocrystals with nanoscale control (具有納米級控制的金屬增強的膠體納米晶體焚光性)",Nature (自然)，2006年11月3日在線發(fā)表.
[4]Netti，M.Caterina 等， "Confined plasmons in gold photonicnanocavities (金光子納米腔中的受限等離子)"，Advanced Materials (高級材料)，第13卷，第18號，2001.
[5]Aizpurua，J.等，Optical properties of gold nanorings (金納米環(huán)的光學性能)"，Physics Review Letters (物理學綜述書信)，第90卷，第5號，2003.
[6] Kucheyev, S.0.%, 〃 Surface-enhancea Raman scattering onnanoporousAu (納米孔Au上的表面-增強的拉曼散射)",Applied Physics Letters(應用物理學書信)，卷89，2006.
[7]Taurai，Tasara %, 〃 Incorporation of reporter molecule-labellednucleotides by DNA polymerases.11.High-aensity labelling of natural DNA(通過DNA聚合酶引入報道分子標記的核苷酸.11.天然DNA的高密度標記)"，Nucleic AcidsResearch(核酸研究)，第31卷，第10號，2003.
[8]Heng, J.B.等， "The Electromechanics of DNA in a syntheticnanopore (合成的納米孔中的DNA的電力學)"，Biophysical Journal (生物物理雜志)，卷90，2006年2月 [9]Ho, Cnuen 等， 〃 Electrolytic transport through a syntheticnanometer-diameter Pore (經(jīng)由合成的納米直徑小孔的電解運輸)"，PNAS，第102卷，第30 號，2005.
[1 0]Astier，Yann ;Braha，Orit ;Bayley，Hagan，" Towards single molecule DNAsequencing (有助于單分子 DNA 測序)",Journal of American Chemical Society(美國化學學會雜志)，卷128，2006.
[II]Kashimura, Yoshiaki #，〃 Fabrication of nano-gap electrodes usingelectroplating technique (利用電鍍技術制造納米-間隙電極)"Thin Solid Films (薄固體膜)438-439，2003.
[12]Downes, Andrew ；Salter, Donald ;Elfick，Alistair， " Simulations ofatomic resolution tip-enhanced optical microscopy(模擬原子分辨率頂端增強的光學顯微鏡法)"OPTICS EXPRESS(光學快訊)，第14卷，第23號，2006.
[13]Bayley, Hagan ；Cremer, Paul S.， " Stochastic sensors inspired bybiology (受到生物學啟示的隨機傳感器)"，NATURE (自然)，卷413，2001年9月.
權利要求
1.種用于確定熒光標記在包含所述熒光標記的核酸中的位置的設備，所述設備包括: 基底； 第一儲存器，所述第一儲存器設置在所述基底的第一側； 第二儲存器，所述第二儲存器設置在所述基底的第二側； 至少ー個納米孔，所述納米孔連接所述第一儲存器和所述第二儲存器，所述納米孔包含在所述基底中； 至少ー個金屬結構部分，所述金屬結構部分在被激發(fā)進行等離子共振時能夠產(chǎn)生電磁場，所述金屬結構部分位于所述基底的表面上鄰近所述第一儲存器或所述第二儲存器以及所述納米孔； 裝置，所述裝置誘導核酸經(jīng)由所述納米孔在所述第一儲存器和所述第二儲存器之間通過；和 光子檢測器，所述光子檢測器用于檢測在所述金屬結構部分被刺激進行等離子共振時產(chǎn)生的電磁場中由突光標記發(fā)突光產(chǎn)生的光子。
2.權利要求1所述的設備，其中所述納米孔具有約l_30nm的直徑。
3.權利要求1所述的設備，其中用于誘導的所述裝置包括ー個或多個電扱。
4.權利要求1所述的設備，其中所述納米孔是有機的。
5.權利要求1所述的設備，其中所述金屬結構部分包括金、銀、銅或鋁。
6.權利要求1所述的設備，其中所述基底包括納米孔的陣列。
7.權利要求1所述的設備，其中所述光子檢測器是光電倍増管或雪崩光電ニ極管。
8.權利要求1所述的設備，其還包括用于激發(fā)所述金屬結構部分中的等離子共振的激光器。
9.權利要求1所述的設備，其中所述設備適于確定熒光標記的核酸中的核苷酸序列。
10.權利要求9所述的設備，其中所述核酸是DNA或RNA。
全文摘要
用于研究分子的設備，包括處于基底中的通道，能夠等離子共振的金屬結構部分，其與所述通道結合，所述金屬結構部分處于適合由所述金屬結構部分產(chǎn)生的電磁場與經(jīng)由所述通道通過的分子相互作用的位置處，用于誘導分子通過所述通道的裝置，用于誘導所述金屬結構部分中的表面等離子共振的裝置；和用于檢測由所述金屬結構部分產(chǎn)生的電磁場與通過所述通道的分子之間的相互作用的裝置。還提供研究分子的方法。
文檔編號C12M1/34GK103087904SQ20121029170
公開日2013年5月8日 申請日期2008年9月4日 優(yōu)先權日2007年9月4日
發(fā)明者卡梅倫·弗雷林 申請人:貝斯4創(chuàng)新公司