專利名稱：一種快速鑒定瓜類疫霉對caa類殺菌劑抗藥性的方法及專用引物的制作方法
技術領域：
本發明涉及瓜類疫霉纖維素合酶相關基因CesA3的克隆及其在Ckks殺菌劑抗性監測中的應用，具體公開一種快速鑒定瓜類疫霉CesA3基因的核苷酸點突變及其對CAA類殺菌劑抗藥性的分子檢測方法及專用引物。屬于分子生物學技術領域。
背景技術：
由瓜類疫霉侵染黃瓜導致的黃瓜疫病在我國黃瓜產區的一種常見病害，在北京、上海、南京、杭州和武漢郊區的黃瓜種植區尤為常見。該病害可以對黃瓜產量造成嚴重損失，甚至可以減產80%。瓜類疫霉還可以侵染葫蘆科作物，包括黃瓜、西葫蘆、哈密瓜、冬瓜、葫蘆等作物，引起產量損失。
目前化學防治仍是植物病害防治過程中使用的重要手段。用于防治瓜類疫霉等植物病原卵菌引起的病害的殺菌劑主要有以甲霜靈為代表的苯酰胺類殺菌劑，然而病原卵菌對該類殺菌劑廣泛產生抗藥性，因此在生產實踐中主要以復配方式使用苯酰胺類殺菌劑。羧酸酰胺類殺菌劑(Carboxylic acid amide, CAAs)是一類新型用于卵菌病害防治的殺菌劑，其中主要代表有烯酰嗎啉、氟嗎啉、雙炔酰菌胺以及異丙菌胺等。然而在使用該類殺菌劑若干年之后，已經在田間采集的葡萄霜霉病菌中檢測到對CAA類殺菌劑產生抗性的群體。植物病原菌抗藥性檢測方法有以下幾種菌落生長測定法、菌絲干重測定法，這兩種方法能準確反映殺菌劑對菌體生長的抑制作用；孢子萌發測定法適用于測定容易產生孢子的病原菌，如小麥銹病和黃瓜霜霉病菌；還有瓊脂展布法、抑菌圈測定法等。但是這些方法都需要通過測定藥劑對病原菌的EC5tl來比較敏感和抗性菌株的差異，試驗需要多個處理，多次重復，因此檢測周期長、工作量大、消耗的人力資源和材料較多。而且上述常規方法檢測靈敏度低，抗藥性菌株的突變頻率在1%以上才能被檢測到。由于病原菌的繁殖、傳播速度一般都很快，在自然界存在的數量又很大，因此經過幾次藥劑選擇后，抗藥性病原菌亞群體可能會成為致病病原群體的主體，造成病害大流行。隨著分子生物學技術的飛速發展及其應用范圍的不斷擴展，分子技術開始在病原菌抗藥性檢測中應用。與傳統的檢測方法比較，不但節省了檢測時間、提高了工作效率，而且提高了檢測的靈敏度，檢測頻率在10_5 10_4，更適用于檢測低頻率的抗藥性基因，因此也被作為田間抗藥性早起診斷的理想方法。可以預測，分子檢測技術將在病害的可持續管理系統中發揮愈來愈重要的作用。

發明內容
本發明的一個目的是提供一種檢測或輔助檢測瓜類疫霉中CesA3基因是否存在突變位點的方法及其專用引物對。本發明提供的檢測或輔助檢測瓜類疫霉中CesA3基因是否存在突變位點的方法，包括如下步驟以待測瓜類疫霉的基因組DNA為模板，用SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 3所示引物對進行PCR擴增，若PCR擴增產物為497bp的片段，則所述待測瓜類疫霉中CesA3基因存在或候選存在突變位點；所述突變位點指瓜類疫霉中CesA3基因的自5’末端起第3455位核苷酸為C。所述CesA3基因的基因組序列自5’末端起第3455位核苷酸也就是SEQ ID NO 7中自5’末端起第3455位核苷酸。上述過程中，所述PCR擴增中，退火溫度為68. 5 0C。本發明所提供的檢測或輔助檢測瓜類疫霉中CesA3基因是否存在突變位點的引物對，由SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 3所示DNA分子組成。本發明的另一個目的是提供瓜類疫霉中CesA3基因或蛋白的突變位點。 本發明所提供的瓜類疫霉中CesA3基因的一個突變位點，為瓜類疫霉中CesA3基因的基因組序列自5’末端起第3455位核苷酸為C。所述CesA3基因的基因組序列自5’末端起第3455位核苷酸也就是SEQ ID NO :7中自5’末端起第3455位核苷酸。本發明所提供的瓜類疫霉中CesA3蛋白的一個突變位點，為瓜類疫霉中CesA3蛋白的自N端起第1109位氨基酸為亮氨酸。所述CesA3蛋白的自N端起第1109位氨基酸也就是SEQ ID NO :6中自N端起第1109位氨基酸。上述任一所述突變位點在鑒定瓜類疫霉抗藥性中的應用也屬于本發明的保護范圍；所述抗藥性為抗CAA類殺菌劑。所述CAA類殺菌劑為氟嗎啉、烯酰嗎啉、異丙菌胺、雙炔酰菌胺。上述應用中，存在所述突變位點的瓜類疫霉具有或候選具有抗藥性。SEQ ID NO :6所示蛋白或SEQ ID NO :7所示基因也屬于本發明的保護范圍。本發明提供的檢測瓜類疫霉對CAA類殺菌劑產生抗藥性的點突變的方法，可以用于快速、靈敏地檢測田間瓜類疫霉對CAA類殺菌劑的抗性發生發展動態，及時調整病害防治策略，以延緩和控制抗藥性的進一步發展。本發明方法具有以下技術優勢和特點結果可靠用本發明建立的分子檢測方法檢測菌株DNA，所有的抗性菌株都能與敏感菌株區分開來，其結果可靠性有保證。簡單快速傳統的生物學測定方法從病菌分離，到敏感性檢測，至少需要6-8天時間，工作量大，周期長。而分子檢測從提DNA到PCR分析，最多需2天時間，省時省工。


圖I為PCR檢測瓜類疫霉抗CAA類殺菌劑突變體。A :不同的AS-PCR引物進行溫度梯度PCR的結果，表明各個引物的特異性存在差異；B PMF+PMR1109B檢測瓜類疫霉敏感菌株和對CAA類殺菌劑的抗性菌株。其中TX21、TX33、TJ90和TJ12為敏感菌株；F58_4、I63-2、D63-1，F63-11和D70-3為抗藥性菌株；CK為空白對照。
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。文中“抗性菌株”均指對CAA類殺菌劑抗性的瓜類疫霉菌；“敏感菌株”均指對CAA類殺菌劑敏感的瓜類疫霉菌。其中，CAA類殺菌劑可為氟嗎啉、烯酰嗎啉、異丙菌胺、雙炔酰菌胺。下述實施例中使用的瓜類疫霉菌株為抗性菌株F58-4、163-2、D63-1，F63-11和D70-3 ;敏感菌株 TX21、TX33、TJ90 和 TJ12。上述菌株分別采自了乂21、了乂33、？58-4、？63-11(天津市西青區)，1\190、1\112(天津市河西區)，I63-2、D63-l、D70-3(美國)，經過現有的形態學和分子生物學方法鑒定為瓜類疫霉。上述各個菌株均經過菌落生長測定法進行抗藥性驗證。實施例I、瓜類疫霉對CAA類殺菌劑氟嗎啉、烯酰嗎啉和異丙菌胺的敏感性測定五株瓜類疫霉抗性菌株，菌株編號分別為F58-4、163-2、D63-1，F63-11和D70-3 ； 四株瓜類疫霉敏感菌株，菌株編號分別為TX21、TX33、TJ90和TJ12。白云豆培養基白云豆粉60g，瓊脂粉7g，蒸餾水定容至1L，121°C濕熱滅菌20分鐘。I、實驗步驟如下I)將氟嗎啉、烯酰嗎啉和異丙菌胺分別用甲醇配成105yg/ml的母液。對于四株瓜類疫霉敏感菌株的敏感性測定，將氟嗎啉逐級稀釋成500μ g/mL、700l·! g/mL、900l·! g/mL、l. 00Χ103μ g/mL、l. 25 X IO3 μ g/mL、I. 50Χ103μ g/mL 的濃度梯度，將烯酰嗎啉稀釋成100 μ g/mL、150 μ g/mL、200 μ g/mL、250 μ g/mL、300 μ g/mL、350 μ g/mL 的濃度梯度，將異丙菌胺稀釋成 200 μ g/mL、250 μ g/mL、300 μ g/mL、350 μ g/mL、400 μ g/mL、450 μ g/mL 的濃度梯度；對于五株瓜類疫霉抗性菌株的敏感性測定，氟嗎啉、烯酰嗎啉和異丙菌胺三種供試藥劑均被逐級稀釋成 5 X IO3 μ g/mL、I X IO4 μ g/mL、2 X IO4 μ g/mL、4X IO4 μ g/mL、8 X IO4 μ g/mL、I X IO5 μ g/mL的濃度梯度。2)用移液槍吸取組合物藥液60 μ I加入已滅菌的冷卻至45°C的60ml白云豆培養基中，使溶劑含量為1%。，混勻，將帶藥的培養基倒入直徑為9cm的培養皿中，設只加60μ I甲醇的處理為空白對照,每個復配比例藥劑設3次重復。3)瓜類疫霉在白云豆平板上培養5天后，沿菌落邊緣用打孔器打取直徑為O. 5cm的菌餅，菌絲面向下接種于步驟2)中的帶藥和對照培養基中，置于28°C培養箱中黑暗培養，4d后測量菌落直徑。4)十字交叉法測量菌落直徑，根據菌落平均直徑值計算出各復配比例對供試菌株的菌絲生長的抑制率。然后將抑制率轉化成機率值(Y)，藥劑濃度轉換成以10為底的對數值(X),在Microsoft Excel中作回歸直線,分別求出兩單劑及其各配比混劑對水稻紋枯病菌的毒力回歸曲線方程Y = a+bX,以及相關系數r和有效抑制中濃度EC5tl值。2.結果表I 9株瓜類疫霉菌株對氟嗎啉、烯酰嗎啉和異丙菌胺的敏感性
權利要求
1.一種檢測或輔助檢測瓜類疫霉中CesA3基因是否存在突變位點的方法，包括如下步驟 以待測瓜類疫霉的基因組DNA為模板，用SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 3所示引物對進行PCR擴增，若PCR擴增產物為497bp的片段，則所述待測瓜類疫霉中CesA3基因存在或候選存在突變位點； 所述突變位點指瓜類疫霉中CesA3基因的基因組序列自5’末端起第3455位核營酸為C0
2.根據權利要求I所述的方法，其特征在于所述PCR擴增中，退火溫度為68.5°C。
3.—種檢測或輔助檢測瓜類疫霉中CesA3基因是否存在突變位點的引物對，由SEQ IDNO :1和SEQ ID NO 3所示DNA分子組成。
4.瓜類疫霉中CesA3基因的一個突變位點，為瓜類疫霉中CesA3基因的自5’末端起第3455位核苷酸為C。
5.瓜類疫霉中CesA3蛋白的一個突變位點，為瓜類疫霉中CesA3蛋白的自N端起第1109位氨基酸為亮氨酸。
6.權利要求4或5所述突變位點在鑒定瓜類疫霉抗藥性中的應用；所述抗藥性為抗CAA類殺菌劑。
7.根據權利要求6所述的應用，其特征在于具有所述突變位點的瓜類疫霉具有具有抗藥性。
8.SEQ ID NO 6所示蛋白。
9.SEQ ID NO 7所示基因。
全文摘要
本發明涉及一種快速鑒定瓜類疫霉對CAA類殺菌劑產生抗藥性的核苷酸點突變方法及專用引物。屬于分子生物技術領域。該特異性引物對由SEQ ID NO1和SEQ ID NO3所示的DNA分子組成。本發明提供的檢測瓜類疫霉對CAA類殺菌劑產生抗藥性的分子檢測方法，簡單快速、敏度度高、穩定性好，可以有效地監測和早期預警田間瓜類疫霉對CAA類殺菌劑的抗性發生發展動態，指導制定科學的病害管理策略，以延緩和控制抗藥性的進一步發展。
文檔編號C12N15/54GK102876773SQ201210291639
公開日2013年1月16日 申請日期2012年8月16日 優先權日2012年8月16日
發明者劉西莉, 陳磊, 朱書生, 盧曉紅, 龐智黎, 蔡萌, 畢揚 申請人:中國農業大學