專利名稱：拆分消旋體γ-內酰胺活性的(+)γ-內酰胺酶及應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于酶工程領域，具體涉及ー種具有拆分消旋體Y-內酰胺活性的(+ )Y-酰胺酶及其編碼基因在手性化合物上的應用。
背景技術：
(-)2- 氮雜雙環[2，2，I]庚-5-烯-3-酮(簡稱(_) Y _內酰胺)是合成抗病毒藥物如阿巴卡韋的重要中間體，獲得高光學純度的(+/_) Y-內酰胺是限制上述多種抗病毒藥物、及代謝調節藥物生產成本降低、及產量提高的主要因素之一。目前，Y-內酰胺酶是ー種新型的酰胺酶，能夠催化酰胺類化合物的酰胺鍵水解。(+) Y-內酰胺酶能夠高效拆分外消旋體Y-內酰胺，獲得光學純的㈠Y-內酰胺。光學純的㈠Y-內酰胺是制備抗病毒藥物阿巴卡韋((-)abaCavir)的重要中間原料，具有巨大的經濟價值。與化學合成法相比，生物催化具有的反應條件溫和，特異性高，低能耗，底物專ー性，重復使用，催化效率高等優點，已代替某些化學合成法投入應用；微生物酶法拆分外消旋體Y-內酰胺具有良好的應用前景。
權利要求
1.一種具有拆分消旋體Y-內酰胺活性的(+) Y-內酰胺酶，其特征在于 所述的(+ ) Y-內酰胺酶是如下(a)或(b)的蛋白質 Ca)其氨基酸序列組成為序列表中的SEQ ID No:l ； (b)將序列表中的SEQ ID No: I的氨基酸序列經過一個或多個氨基酸的取代、和/或缺失、和/或添加，且具有拆分消旋體Y-內酰胺活性的由SEQ ID No: I衍生的蛋白質。
2.一種具有拆分消旋體Y-內酰胺活性的(+ ) Y-內酰胺酶編碼基因，其特征在于 所述的(+ ) Y-內酰胺酶的編碼基因是如下(a)或(b)的基因 (a)、其核苷酸序列組成為:序列表中的SEQID No:2 ； (b)、編碼序列表中的SEQID No:2的氨基酸序列的核苷酸序列。
3.—種重組表達載體，其特征在于含有權利要求2中所述的(+ ) Y-內酰胺酶編碼基因。
4.一種轉基因細胞系，其特征在于含有權利要求2中所述的(+ ) Y-內酰胺酶編碼基因。
5.一種宿主菌，其特征在于含有權利要求2中所述的(+ ) Y-內酰胺酶的編碼基因。
6.一種具有拆分消旋體Y-內酰胺活性的(+ ) Y-內酰胺酶的編碼基因的應用，其特征在于 提取大豆慢生根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum, CGMCC :1. 2550)基因組DNA,構建用于提取重組蛋白的重組菌體，再通過表達得到所述的(+ ) Y內酰胺酶； 將所述的用于提取重組蛋白的重組菌體懸浮在的磷酸緩沖液中，加入Y內酰胺底物，37°C反應24小時，得到反應混合物；將所述的反應混合物進行離心處理，保留上清液；將所述的上清液中加入乙酸乙酯萃取，進行HPLC檢測，獲得(-)Y-內酰胺。
7.一種具有拆分消旋體Y-內酰胺活性的(+ ) Y-內酰胺酶的編碼基因的應用，其特征在于 提取大豆慢生根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum, CGMCC :1. 2550)基因組DNA,構建用于提取重組蛋白的重組菌體，再通過表達得到所述的(+ ) Y內酰胺酶； 將所述的( + )Y內酰胺酶懸浮在的磷酸緩沖液中，加入Y內酰胺底物，37°C反應24小時，得到反應混合物；將所述的反應混合物進行離心處理，保留上清液；將所述的上清液中加入乙酸乙酯萃取，進行HPLC檢測，獲得(-)Y -內酰胺。
8.一種以大豆慢生根瘤菌為菌種生產(_) Y-內酰胺的方法，其特征在于該方法包括如下步驟 A、菌種選擇選用大豆慢生根瘤菌(Bradyrhizobiumjaponicum)作為菌種，菌種保藏號為 CGMCC No. I. 2550 ； B、振蕩培養將所述的大豆慢生根瘤菌菌種接種到根瘤菌培養基中，進行振蕩培養，得到發酵液； C、收集菌體將所述的發酵液與PH值為7.0的磷酸鹽緩沖液的混合，得到稀釋發酵液；將所述的稀釋發酵液進行離心處理，收集沉淀；將該沉淀用所述的PH值為7. 0的磷酸鹽緩沖液進行洗滌處理，回收得到濕菌體； D、生物拆分實驗將所述的濕菌體與(+/_)Y-內酰胺溶液混合，得到菌體混合液；將所述的菌體混合液進行振蕩培養，得到振蕩后的菌液；E、分離樣品將所述的振蕩后的菌液以進行離心處理，得到上清液，即為所述的(_)Y _內酰胺。
9.根據權利要求8所述的生產(-)Y-內酰胺的方法，其特征在于所述的根瘤菌培養基的碳源包括葡萄糖、甘露醇、蔗糖中的一種或幾種的混合物；所述的根瘤菌培養基的氮源包括胰蛋白胨、酵母粉、牛肉膏、玉米漿中的一種或幾種的混合物。
10.根據權利要求8所述的生產(-)Y-內酰胺的方法，其特征在于所述的pH值為·7.0的磷酸鹽緩沖液由0. 05mol/l的Na2HPO4溶液和0. 05mol/l的NaH2PO4溶液混合而成，所述的Na2HPO4溶液和NaH2PO4溶液的體積比為7:3。
全文摘要
本發明提供一種具有拆分消旋體γ-內酰胺活性的(+)γ-酰胺酶及編碼基因在手性化合物上的應用；及利用一種以大豆慢生根瘤菌生產(-)γ-內酰胺的方法。提取大豆慢生根瘤菌基因組DNA，構建用于提取重組蛋白的重組菌體，再通過表達得到所述的(+)γ內酰胺酶；將所述的用于提取重組蛋白的重組菌體或(+)γ內酰胺酶懸浮在的磷酸緩沖液中加入γ內酰胺底物反應、萃取獲得(-)γ-內酰胺。或提取大豆慢生根瘤菌基因組DNA，構建用于提取重組蛋白的重組菌體，再通過表達得到所述的(+)γ內酰胺酶，加入底物反應、萃取獲得(-)γ-內酰胺。本發明中的(+)γ-內酰胺酶源于大豆慢生根瘤菌，催化效率高，得到的(-)γ-內酰胺純度高。
文檔編號C12R1/01GK102796720SQ20121029325
公開日2012年11月28日 申請日期2012年8月16日 優先權日2012年8月16日
發明者鄭國鈞, 朱紹洲, 宋大偉, 宮萃宇 申請人:北京化工大學