專利名稱：改進(jìn)的酮還原酶多肽、其編碼基因以及表達(dá)該多肽的細(xì)胞的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種改進(jìn)的酮還原酶多肽、其編碼基因以及表達(dá)該多肽的細(xì)胞。
背景技術(shù)：
去氧腎上腺素(phenyl印hrine)又名苯腎上腺素，其化學(xué)學(xué)名為3_ (2- (N-甲基氨基)-1-羥基)苯酚。它在臨床上常用于陣發(fā)性室上性心動過速，可通過收縮血管，升高血壓使迷走神經(jīng)反射的興奮而心率減慢。去氧腎上腺素的合成方法包括化學(xué)法和生物法，將其酮底物立體選擇性還原成具有手性結(jié)構(gòu)的產(chǎn)物。采用生物法制備去氧腎上腺素需要使用具有立體選擇性的酮還原酶。 然而，現(xiàn)有的野生型酮還原酶KRED，其催化活性很低，例如，10g/l粗酶粉20小時只能完全轉(zhuǎn)化lg/1的酮底物，無法滿足工業(yè)化生產(chǎn)的需要。目前對于去氧腎上腺素的生物制備，還沒有一種既具有一定立體選擇性，又具有較好催化活性的酮還原酶。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明一方面提供了一種該改進(jìn)的酮還原酶多肽的酶活性高于野生型酮還原酶多肽的酶活性；所述酶活性是指催化酮類化合物發(fā)生還原反應(yīng)生成手性醇的酶活性；所述野生型酮還原酶多肽具有SEQ ID No. 2所示氨基酸序列，且來源于高加索乳酸桿菌 Lactobacillus kef iri DSM 20587 ；所述改進(jìn)的酮還原酶多肽包含與SEQ ID No. 2所示氨基酸序列有至少90%序列同源性的氨基酸序列，并且該改進(jìn)的酮還原酶多肽的氨基酸序列中對應(yīng)于SEQID No. 2所示氨基酸序列中的第94位殘基為酪氨酸殘基。在本發(fā)明的一個具體實(shí)施方案中，所述酶活性是指催化底物1-(3-羥基苯基)-2_[甲基(苯基甲基)氨基]乙酮發(fā)生還原反應(yīng)生成3- ((R)-2- (N-芐基-N-甲基氨基)-I-羥基)的酶活性。3- ((R) -2- (N-芐基-N-甲基氨基)-I-羥基)的酶活性經(jīng)過還原反應(yīng)脫去芐基后生成去氧腎上腺素。在本發(fā)明的一個具體實(shí)施方案中，所述改進(jìn)的酮還原酶多肽具有如SEQ IDNo. 4所示氨基酸序列。在本發(fā)明的一個具體實(shí)施方案中，該改進(jìn)的酮還原酶多肽的酶活性是所述野生型酮還原酶多肽的酶活性的至少2倍。本發(fā)明另一方面還提供了編碼上述改進(jìn)的酮還原酶多肽的基因，其包含與SEQ IDNo. I所示核苷酸序列有至少90%序列同源性的核苷酸序列。在本發(fā)明的一個具體實(shí)施方案中，該基因具有如SEQ ID No. 3所不核苷酸序列。本發(fā)明再一方面還提供了一種細(xì)胞，該細(xì)胞表達(dá)上述的改進(jìn)的酮還原酶多肽。
優(yōu)選的，所述細(xì)胞屬于乳酸桿菌或大腸桿菌。更優(yōu)選的，所述乳酸桿菌屬于高加索乳酸桿菌。在本發(fā)明的一個具體實(shí)施方式
中，所述大腸桿菌為E. coli. BL21 (DE3)。
具體實(shí)施例方式下面將通過實(shí)施例對本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容作進(jìn)一步的闡述，其目的是為了更好的理解本發(fā)明的內(nèi)容。因此，所舉的例子并不限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。實(shí)施例I一、制備能夠表達(dá)如SEQ ID No. 4所示氨基酸序列的改進(jìn)的酮還原酶多肽的宿主細(xì)胞步驟I :全基因合成如SEQ ID No. I所示核苷酸序列步驟2 :引入對第94位氨基酸的飽和突變?yōu)榱藢柡屯蛔円隨EQ ID No. I所示核苷酸序列，我們以含有SEQ ID No. I所示核苷酸序列的質(zhì)粒pET21b-KREDlk作為PCR反應(yīng)模板，并設(shè)計了以下兩對引物上游引物Fl: 5，-AGGGCTGCATATGACTGATCGTTTAAAACAC-3’ (SEQ ID No. 5)下游引物Rl: 5’ -CTCAAGCTTTTATTGAGCAGTGTATCCACC-3，(SEQ ID No. 6)上游引物Fl和下游引物Rl序列中標(biāo)注下劃線處表示酶切位點(diǎn)突奪引物F2:5’ -CAATGCCGGAAGTNNSGTCCTCAAGAG-3，(SEQ ID No. 7)突奪引物R2:5’ -CTCTTGAGGACSNNACTTCCGGCATTG-3，(SEQ IDNo. 8)突變引物F2和突變引物R2序列中標(biāo)注下劃線處表示突變位點(diǎn)的簡并堿基以質(zhì)粒PET21b_KREDlk為模板，進(jìn)行第一輪PCR反應(yīng)，按以下次序，將各成分在滅菌 EP 管中混合，采用 25 u I 反應(yīng)體系ddH20 16. 3 u I, PCR Buffer 2. 5u I, dNTP 2u I,引物 Fl(10iimol/L)2ii 1，$*R2(10iimol/L)2iil，pET21b-KREDlk I u I, Pfu DNA 聚合酶(5U/u 1)0. 2 u I。擴(kuò)增條件為94°C 2min, 一個循環(huán)；94°C 30s, 55°C 30s, 72°C 20s, 30 個循環(huán)；72°C，lOmin，一個循環(huán)。將所得的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收在300bp處的特異性條帶，使用博大泰克DNA片段快速回收試劑盒進(jìn)行回收。然后進(jìn)行第二輪PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系為ddH20 16. 3 u I, PCR Buffer 2. 5u I, dNTP 2u I,引物 F2 (10 y mol/L)2u I,引物 Rl(10iimol/L)2ii l，pET21b-KREDlk I u I, Pfu DNA 聚合酶 0. 2 y I。擴(kuò)增條件為94°C 2min，一個循環(huán)；94°C 30s, 55°C 30s, 72°C 30s，30 個循環(huán)；72°C，lOmin，一個循環(huán)。將所得的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，回收在500bp左右的特異性條帶。然后，以 前二輪PCR的產(chǎn)物為模板，進(jìn)行第三輪PCR，反應(yīng)體系如下ddH20 14. 3 u I, PCR Buffer2. 5 iil, dNTP 2 iil, $*Fl(10iimol/L)2iil,引物 Rl (10 y mol/L) 2 y 1，第一輪 PCR 回收產(chǎn)物Iu 1，第二輪PCR回收產(chǎn)物I iil，Pfu DNA聚合酶0. 2iil。擴(kuò)增條件為94°C 2min，一個循環(huán)；94°C 30s, 55°C 30s, 72°C 50s，30個循環(huán)；72°C，lOmin，一個循環(huán)。將所得的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，回收在SOObp左右的特異性條帶。該片段中則包含了具有飽和突變的所有突變序列。步驟3 :構(gòu)建突變核苷酸序列的表達(dá)載體在含有氨芐青霉素(Amp，100 U g/ml)的LB培養(yǎng)基中接種含有質(zhì)粒pET21b的大腸桿菌ToplO菌株，于37°C搖床中培養(yǎng)過夜。取3ml菌液轉(zhuǎn)入EP管中，12000rpm離心lmin，收集菌體，根據(jù)博大泰克小量質(zhì)粒制備試劑盒說明書操作提取pET21b質(zhì)粒。
酶切質(zhì)粒pET21b 的反應(yīng)體系為NEB Buffer 25 u I, pET21b 43 u I1NdeIIu I1Hind III I yl，于37°C水浴中保溫4h。然后酶切步驟2獲得的突變后的基因片段，依次加入如下試劑NEB Buffer25u I,基因片段 43 yl, NdeI Iu I1Hind III lyl，于 37°C水浴中保溫4h。隨后向兩個反應(yīng)體系中分別加入IOii 16*loading buffer,進(jìn)行凝膠電泳檢測，膠回收被切成線性的DNA分子。在EP 管中分別加入 H2O 3. 5 u I, T41igase Buffer Iu I, pET21b (Ndel, HindIIIdigested) 2u I,步驟3所得片段被Ndel, HindIII酶切過的回收產(chǎn)物3 yl，T4DNAIigaseO. 5 y 1，于 16°C連接 5h。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)菌種取一管BL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞(天根生化科技有限公司)，將10 Ul連接產(chǎn)物和100 ill感受態(tài)細(xì)胞混合，冰水浴中放置30min，42°C熱激90s，置于冰上5min，然后加入LB800iil，于37°C搖床中培養(yǎng)40min。14, OOOrpm離心，棄800 ill上清，用剩余液體懸浮沉淀的細(xì)胞，涂布于含有100 u g/ml Amp的LB平板 上，37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12-16h即可得到轉(zhuǎn)化子。然后對轉(zhuǎn)化子進(jìn)行菌落PCR鑒定(使用Fl，Rl為引物)，將含有約800bp插入片段的轉(zhuǎn)化子作為陽性克隆。于96孔深孔板中每孔加入LB+Amp培養(yǎng)基1ml，挑選94個陽性克隆接種入96孔板，在37°C搖床中震蕩培養(yǎng)16h，此即為突變體庫。步驟4 :將步驟3獲得的酮還原酶突變體庫進(jìn)行誘導(dǎo)發(fā)酵將培養(yǎng)過夜的突變體庫每孔取80 U I菌液接種入一個新的96孔板，該板每孔內(nèi)含新鮮LB+Amp培養(yǎng)基1ml，細(xì)胞在37°C，160rpm條件下生長至OD6tltl值達(dá)到0. 8^1. 0，隨后加A IPTG至終濃度為I. OmM,于30°C誘導(dǎo)培養(yǎng)16小時。離心，棄上清，收集菌體供檢測活性。步驟5 :篩選表達(dá)酮還原酶多肽的宿主細(xì)胞(大腸桿菌BL21 (DE3)/pET2Ib-KRED)利用酶促反應(yīng)篩選表達(dá)改進(jìn)的酮還原酶多肽的宿主細(xì)胞。0. 6毫升的酶促反應(yīng)體系，其中包括10g/L2_ (N-芐基-N-甲基氨基)_1_ (3_羥基)苯乙酮，0. lg/L NADPH, ImM Mg2+，500mM 磷酸鈉緩沖溶液(pH=6. 5)，10g/L 步驟四離心獲得的宿主細(xì)胞。于30°C反應(yīng)24h，加入等體積乙腈終止反應(yīng)，10，OOOrpm離心5min，吸取上清液至一塊新的96孔板上。使用HPLC分析來檢測酶活(方法檢測柱=CNW 柱(0 4.6 X 150 mm，5um);波長214nm ；流動相A 相(H20+0. 1%TFA) -B 相(CH3CN+0. 1%TFA)，流速為 I. Oml/min,等度洗脫，23%B+77%A 10. Omin stop,柱溫 28°C )，將獲得的產(chǎn)物峰的面積與BL21 (DE3) /pET2 Ib-KREDIk發(fā)酵菌液的反應(yīng)峰面積做比較，超過BL21 (DE3)/pET2Ib-KREDlk活性30%的即為篩選出的活性有所提高的突變體。步驟6:鑒定為了從所篩選出的(表達(dá)改進(jìn)的酮還原酶多肽)的宿主細(xì)胞中獲得酮還原酶的序列，將其所對應(yīng)的菌種送測序，測序結(jié)果顯示含有SEQ ID No. 3所示核苷酸序列，編碼SEQID No. 4所示氨基酸序列。該菌種命名為BL21 (DE3)/pET2 Ib-KREDmu。二、驗(yàn)證表達(dá)本發(fā)明的一種改進(jìn)的酮還原酶多肽的宿主細(xì)胞(上述步驟5獲得的大腸桿菌 BL21 (DE3)/pET2Ib-KREDmu)的效果以表達(dá)野生型酮還原酶多肽(SEQ ID No.2所示氨基酸序列)的大腸桿菌BL21 (DE3)/pET2Ib-KREDkl作為對照，驗(yàn)證上述步驟5獲得的宿主細(xì)胞表達(dá)的改進(jìn)的酮還原酶多肽的酶活性。
制備R型苯酚產(chǎn)物的50ml反應(yīng)體系10g/L 2- (N-芐基-N-甲基氨基)-1- (3_羥基)苯乙酮，10g/L酮還原酶菌體(大腸桿菌 BL21 (DE3)/pET2Ib-KREDkl 或者大腸桿菌 BL21 (DE3)/pET2Ib-KREDmu)，10g/L 葡萄糖脫氫酶菌體，200g/L葡萄糖,0. lg/LNADP+, ImM Mg2+, 50mM磷酸鈉緩沖溶液(pH=6. O)。反應(yīng)裝置利用250mL的三口瓶，30°C油浴，利用磁力攪拌。首先精確稱取0. 5克底物和10克葡萄糖，加入到反應(yīng)瓶中。然后加入40mL去離子水，ImM硫酸鎂，50mM, pH6. 0磷酸鈉緩沖液，快速攪拌lOmin，使反應(yīng)體系充分混勻。此時測定pH約為4. 7，用2. 5N的NaOH將pH調(diào)節(jié)至5. I。向體系中加入500mg酮還原酶菌體細(xì)胞，500mg葡萄糖脫氫酶菌體細(xì)胞和5mg的氧化型輔酶II (NADP+鈉鹽)。整個反應(yīng)過程中pH控制在5. 05-5. 15之間，溫度控制在30°C。反應(yīng)20h后HPLC分析(如步驟5所述)。HPLC分析結(jié)果顯示具有SEQ ID No. 4所示氨基酸序列的改進(jìn)的酮還原酶多肽在篩選條件下能完全轉(zhuǎn)化苯乙酮底物；而具有SEQ ID No. 2所示氨基酸序列的野生型酮還原酶只能轉(zhuǎn)化10%不到的苯乙酮底物。 同時，為了確定突變體的立體選擇性，使用了低濃度底物作反應(yīng)，以確保底物被完全轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物，反應(yīng)體系為lg/L 2- (N-芐基-N-甲基氨基)-1_ (3-羥基)苯乙酮，0. Ig/L NADPH, ImM Mg2+，500mM磷酸鈉緩沖溶液(pH=6. 5)，10g/L 的 BL21 (DE3) /pET2Ib-KREDkl 或BL21 (DE3)/pET2Ib-KREDmu，于30°C反應(yīng)24h。反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行手性HPLC分析，結(jié)果顯示突變體可以將2- (N-芐基-N-甲基氨基)-1- (3-羥基)苯乙酮還原為3- ((R)-2- (N-芐基-N-甲基氨基)-I-羥基)苯酚，其立體選擇性不低于野生型酮還原酶，e. e.值>99. 9%。
權(quán)利要求
1.一種改進(jìn)的酮還原酶多肽，其特征在于， 該改進(jìn)的酮還原酶多肽的酶活性高于野生型酮還原酶多肽的酶活性； 所述酶活性是指催化酮類化合物發(fā)生還原反應(yīng)生成手性醇的酶活性； 所述野生型酮還原酶多肽具有SEQ ID No. 2所示氨基酸序列，且來源于高加索乳酸桿菌 Lactobacillus kefiri DSM 20587 ； 所述改進(jìn)的酮還原酶多肽包含與SEQ ID No. 2所示氨基酸序列有至少90%序列同源性的氨基酸序列，并且該改進(jìn)的酮還原酶多肽的氨基酸序列中對應(yīng)于SEQ ID No. 2所示氨基酸序列中的第94位殘基為酪氨酸殘基。
2.如權(quán)利要求I所述的改進(jìn)的酮還原酶多肽，其特征在于所述酶活性是指催化底物I-(3-羥基苯基)-2-[甲基(苯基甲基)氨基]乙酮發(fā)生還原反應(yīng)生成3-((R)-2-(N-芐基-N-甲基氨基)-I-羥基)的酶活性。
3.如權(quán)利要求I所述的改進(jìn)的酮還原酶多肽，其特征在于所述改進(jìn)的酮還原酶多肽具有如SEQ ID No. 4所示氨基酸序列。
4.如權(quán)利要求I所述的改進(jìn)的酮還原酶多肽，其特征在于該改進(jìn)的酮還原酶多肽的酶活性是所述野生型酮還原酶多肽的酶活性的至少2倍。
5.一種編碼如權(quán)利要求1-4中任意一項(xiàng)所述改進(jìn)的酮還原酶多肽的基因，其特征在于 編碼所述改進(jìn)的酮還原酶多肽的基因包含與SEQ ID No. I所示核苷酸序列有至少90%序列同源性的核苷酸序列。
6.如權(quán)利要求5所述的基因，其特征在于該基因具有如SEQID No. 3所示核苷酸序列。
7.一種細(xì)胞，其特征在于該細(xì)胞表達(dá)權(quán)利要求1-4中任意一項(xiàng)所述的改進(jìn)的酮還原酶多肽。
8.如權(quán)利要求7所述細(xì)胞，其特征在于所述細(xì)胞屬于乳酸桿菌或大腸桿菌。
9.如權(quán)利要求8所述細(xì)胞，其特征在于所述乳酸桿菌屬于高加索乳酸桿菌。
10.如權(quán)利要求8所述細(xì)胞，其特征在于所述大腸桿菌為E.coli. BL21 (DE3)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種改進(jìn)的酮還原酶多肽，該改進(jìn)的酮還原酶多肽的酶活性高于野生型酮還原酶多肽的酶活性；所述酶活性是指催化酮類化合物發(fā)生還原反應(yīng)生成手性醇的酶活性；所述野生型酮還原酶多肽具有SEQ ID No.2所示氨基酸序列，且來源于高加索乳酸桿菌Lactobacillus kefiri DSM 20587；所述改進(jìn)的酮還原酶多肽包含與SEQ ID No.2所示氨基酸序列有至少90%序列同源性的氨基酸序列，并且該改進(jìn)的酮還原酶多肽的氨基酸序列中對應(yīng)于SEQ ID No.2所示氨基酸序列中的第94位殘基為酪氨酸殘基。
文檔編號C12N15/53GK102776157SQ201210299300
公開日2012年11月14日 申請日期2012年8月21日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月21日
發(fā)明者孫勇, 文軍, 王娟, 王波, 郭浩 申請人:尚科生物醫(yī)藥(上海)有限公司