專利名稱：：粘毛黃芩查爾酮合成酶蛋白編碼序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及的是一種蛋白編碼序列，特別是一種粘毛黃芩查爾酮合成酶蛋白編碼序列，屬于基因工程領(lǐng)域。技術(shù)背景粘毛黃芩屬于唇形科黃芩屬多年生藥用草本植物。該屬植物約300多種，世界廣布，我國有100種以上，可作為黃芩藥用者約有7種左右，粘毛黃芩就是其中的一種。該植物主要藥用成分為黃芩苷，現(xiàn)代藥理學(xué)證實其具有清熱解毒、止血安胎、抗菌消炎、保肝利膽、降壓脫敏、防曬美白等作用。隨著國際上對黃芩苷等研究的持續(xù)升溫和認識的逐步深入，認為黃芩苷在清除氧自由基、減輕組織的缺血再灌注損傷、調(diào)節(jié)免疫、促進細胞凋亡以及抗腫瘤和HIV等多方面均有作用(Hwang,etal,2005)，具有重要的藥用價值和開發(fā)利用前景。然而目前獲得粘毛黃芩的主要技術(shù)是人工栽培，但存在生產(chǎn)周期長、成活率低、農(nóng)藥殘留超標和有效成分較低等弊端，使得該方式商業(yè)前景尚不明朗。因而，尋找新的藥源十分必要。植物次生代謝途徑分子生物生物學(xué)的飛速發(fā)展和植物生物技術(shù)的日趨成熟，使得利用基因工程獲得粘毛黃芩中重要的天然藥物黃苳苷成為可能。基因工程技術(shù)是實現(xiàn)遺傳改良和種質(zhì)創(chuàng)新的重要方法，開展黃芩苷代謝工程研究，進而獲得高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的新型藥源，而前提是闡明其生物合成的分子機理，即分離該途徑上多個酶促反應(yīng)步驟的基因，并考察目的基因在黃芩苷生物合成途徑中的作用，為黃芩苷的代謝工程提供候選基因和作用耙點十分必要。包括黃芩苷在內(nèi)的所有黃酮類化合物的直接通用前體物是柚皮苷査爾酮，它是由1分子桂皮酰輔酶A與3分子丙二酸單酰輔酶A縮合而成，前者來自苯丙酸中間途徑，后者由醋酸經(jīng)乙酰輔酶A羧化酶催化形成。該縮合反應(yīng)是由査爾酮合成酶(CHS)催化完成的，這是黃酮類化合物合成中第1個關(guān)鍵酶，具有限速作用(Stich,etal,1992)。對cfe基因調(diào)控作用的研究主要集中在植物花色表型和抗逆性狀的改變上，而這種改變實質(zhì)上也是基于細胞內(nèi)黃酮化合物的含量變化,例如通過對cfe基因的反義或共抑制操作獲得顏色變異的轉(zhuǎn)基因花卉(Eiichiro,etal,2006)，以及正調(diào)節(jié)馬鈴薯中的cfe基因引起花色素苷等黃酮類化合物的增加，從而改善了其抗氧化能力(Verhoeyen,eta1,2002)。用代謝工程技術(shù)突破CHS途徑中上下游限速瓶頸，是實現(xiàn)對目標產(chǎn)物的高量表達的一個切實可行的策略。可以推斷，要提髙粘毛黃芩中黃芩苷的含量，CHS將會是一個很有效的代謝工程靶點，然而遺憾的是，到目前為止，還未見從粘毛黃苳中克隆和鑒定cfe基因的報道。根據(jù)GeneBank中查爾酮合成酶的核苷酸序列，結(jié)合PCR技術(shù)我們從粘毛黃芩中克隆了相關(guān)序列，根據(jù)GeneB節(jié)k的搜索結(jié)果，將該基因命名為查爾酮合成酶基因。在對現(xiàn)有文獻的分析中，未見粘毛黃芩黃酮類化合物生物合成途徑上的cfe基因的克隆，至今尚未發(fā)現(xiàn)與本發(fā)明主題有密切聯(lián)系文獻的報道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種粘毛黃芩査爾酮合成酶蛋白編碼序列。本發(fā)明公開了粘毛黃吝查爾酮合成酶的氨基酸序列以及粘毛黃芩查爾酮合成酶基因的核苷酸序列，為最終采用打破黃酮類化合物生物合成途徑上的限速反應(yīng)步驟，實現(xiàn)黃零苷的代謝工程提供候選基因和作用靶點，并其在利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)提高黃芩苷等黃酮類化合物的含量方面的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的在本發(fā)明所分離出的DNA分子，該分子包括編碼具有粘毛黃芩査爾酮合成酶核苷酸序列，而且所述的核苷酸序列與SEQIDNO.3中從核苷酸第54-752位的核苷酸序列有70%的同源性；或者所述的核苷酸序列能在45—55'C條件下與SEQIDN0.3中從核苷酸第54-752位的核苷酸序列雜交。本發(fā)明所分離出的粘毛黃芩査爾酮合成酶蛋白編碼序列多肽，它包括具有SEQIDNO.3氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。較佳地，該多肽是具有SEQIDN0.3序列的多肽。本發(fā)明所提供的一種載體，它包含上述的DNA分子。一種核酸分子，它包含所述的DNA分子中8-100個連續(xù)核苷酸。本發(fā)明用上述載體轉(zhuǎn)化的宿主細胞是真核細胞。在本發(fā)明中，"分離的"、"純化的"DNA是指，該DNA或片段已從天然狀態(tài)下位于其兩側(cè)的序列中分離出來，還指該DNA或片段巳經(jīng)與天然狀態(tài)下伴隨核酸的組分分開，而且已經(jīng)與在細胞中伴隨其的蛋白質(zhì)分開。在本發(fā)明中，術(shù)語"粘毛黃芩査爾酮合成酶蛋白編碼序列"指編碼具有活性多肽的核苷酸序列，如SEQIDN0.3中第54-752位核苷酸序列及其簡并序列。該簡并序列是指，位于SEQIDNO.3序列的編碼框第54-752位核苷酸中，有一個或多個密碼子被編碼相同氨基酸的簡并密碼子所取代后而產(chǎn)生的序列。由于密碼子的簡并性，所以與SEQIDNO.3中第54-752位核苷酸序列同源性低至約70%的簡并序列也能編碼出SEQIDNO.3所述的序列。該術(shù)語還包括能在中度嚴緊條件下，更佳的在高度嚴緊條件下與SEQIDNO.3中從核苷酸第54-752位的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。該術(shù)語還包括與SEQIDNO.3中從核苷酸第54-752位的核苷酸序列的同源性至少70%，較佳地至少80%,更佳地至少卯％，最佳地至少95%的核苷酸序列。該術(shù)語還包括能編碼具有與粘毛黃芩查爾酮合成酶相同功能的蛋白的SEQIDNO,3中開放閱讀框序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(通常為1-90個，較佳地l-60個，更佳地l-20個，最佳地1-10個)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5，和/或3'端添加數(shù)個(通常為60個以內(nèi)，較佳地為30個以內(nèi)，更佳地為10個以內(nèi)，最佳地為5個以內(nèi))核苷酸。在本發(fā)明中，術(shù)語"粘毛黃芩查爾酮合成酶"指具有蛋白活性的SEQIDNO.3序列的多肽。該術(shù)語還包括具有相關(guān)相同功能的、SEQIDN0.3序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(通常為l-50個，較佳地l-30個，更佳地l-20個，最佳地1-10個)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個(通常為20個以內(nèi)，較佳地為IO個以內(nèi)，更佳地為5個以內(nèi))氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個氨基酸通常也不會改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語還包括其活性片段和活性衍生物。本發(fā)明的粘毛黃芩査爾酮合成酶基因的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導(dǎo)突變體、在高或低的嚴緊條件下能與DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用粘毛黃芩查爾酮合成酶蛋白多肽的血清獲得的多肽或蛋白。在本發(fā)明中，"粘毛黃芩查爾酮合成酶保守性變異多肽"指與SEQIDNO.3的氨基酸序列相比，有至多10個，較佳地至多8個，更佳地至多5個氨基酸性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據(jù)表1進行替換而產(chǎn)生。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>Asn(N)Gin;His;Lys;ArgGinAsp(D)GluGluCys(C)SerSerGin(Q)AsnAsnGlu(E)AspAspGly(G)Pro;AlaAlaHis問Asn;Gin;Lys;ArgArgHe(I)Leu;Val;Met;Ala;PheLeuLeu(L)He;Val;Met;Ala;PhelieLys(K)Arg;Gin;AsnArgMet(M)Leu;Phe;HeLeuPhe(F)Leu;Val;He;Ala;TyrLeuPro(P)AlaAlaSer(S)ThrThrThr(T)SerSerTip(W)Tyr;PheTyrTyr(Y)Trp;Phe;Thr;SerPheVal(V)He;Leu;Met;Phe;AlaLeu表296.1%identityin233aaoverlapQuery1匿QQGCFAGGTVLRMAKDLAE麗AGARVLVVCSEITAITFRGPSDTHLD麗QQGCFAGGTVLRMAKDLAE畫AGARVLWCSEITAITFRGPSDTHLDSbjct1MMYQQGCFAGGTVLRMAKDLAE剛AGARVLWCSEITAITFRGPSDTHLDQuery61SLVGQALFGDGAGAVIVGSDPIVGVERPLFQLVSAAQTILPDSEGAIDGHS國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:粘毛黃芩査爾酮合成酶的氨基酸序列Sbjct:黃零査爾酮合成酶的氨基酸序列(GenBankAccessionNo.AB008748)表2為本發(fā)明的粘毛黃芩查爾酮合成酶與黃芩查爾酮合成酶的氨基酸序列的同源比較(FASTA)表。其中，相同的氨基酸在兩個序列之間用氨基酸單字符標出。發(fā)明還包括粘毛黃芩查爾酮合成酶蛋白或多肽的類似物。這些類似物與粘毛黃芩查爾酮合成酶蛋白相關(guān)多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導(dǎo)的遺傳變異體。誘導(dǎo)變異體可以通過各種技術(shù)得到，如通過輻射或暴露于誘變劑而產(chǎn)生隨機誘變，還可通過定點誘變法或其他已知分子生物學(xué)的技術(shù)。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如p、Y-氨基酸)的類似物。應(yīng)理解，本發(fā)明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。修飾(通常不改變一級結(jié)構(gòu))形式包括體內(nèi)或體外的多肽的化學(xué)衍生形式如乙酰化或羧基化。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進一步加工步驟中進行糖基化修飾而產(chǎn)生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露于進行糖基化的酶(如哺乳動物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸、磷酸絲氨酸、磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。在本發(fā)明中，可選用本領(lǐng)域已知的各種載體，如市售的載體，包括質(zhì)粒，粘粒等。在生產(chǎn)本發(fā)明的粘毛黃芩查爾酮合成酶蛋白時，可以將粘毛黃芩查爾酮合成酶基因的編碼序列可操作地連于表達調(diào)控序列，從而形成粘毛黃芩查爾酮合成酶基因表達載體。如本發(fā)明所用，"可操作地連于"指這樣一種狀況，即線性DNA序列的某些部分能夠影響同一線性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信號肽DNA作為前體表達并參與多肽的分泌，那么信號肽(分泌前導(dǎo)序列)DNA就是可操作地連于多肽DNA;如果啟動子控制序列的轉(zhuǎn)錄，那么它是可操作地連于編碼序列；如果核糖體結(jié)合位點被置于能使其翻譯的位置時，那么它是可操作地連于編碼序列。一般，"可操作地連于"意味著相鄰，而對于分泌前導(dǎo)序列則意味著在閱讀框中相鄰。在本發(fā)明中，術(shù)語"宿主細胞"為真核細胞。常用的真核宿主細胞包括酵母細胞、煙草細胞和其它植物細胞。此外，本發(fā)明中可用作探針的核酸分子，該分子通常具有粘毛黃芩査爾酮合成酶基因編碼序列的8-100個連續(xù)核苷酸，較佳地具有15-50個連續(xù)核苷酸。該探針可用于檢測樣品中是否存在編碼粘毛黃芩查爾酮合成酶的核酸分子。本發(fā)明涉及檢測樣品中是否存在粘毛黃芩査爾酮合成酶基因核苷酸序列的方法，它包括用上述的探針與樣品進行雜交，然后檢測探針是否發(fā)生了結(jié)合。較佳地，該樣品是PCR擴增后的產(chǎn)物，其中PCR擴增引物對應(yīng)于粘毛黃芩査爾酮合成酶基因核苷酸編碼序列，并可位于該編碼序列的兩側(cè)或中間。引物長度一般為15-50個核苷酸。本發(fā)明的粘毛黃芩査爾酮合成酶基因核苷酸全長序列或其片段通常可以用PCR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關(guān)核苷酸序列來設(shè)計引物，并用市售的cDNA庫或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫作為模板，擴增而得有關(guān)序列。當(dāng)序列較長時，常常需要進行兩次或多次PCR擴增，然后再將各次擴增出的片段按正確次序拼接在一起。一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細胞中分離得到有關(guān)序列。此外，還可通過化學(xué)合成將突變引入本發(fā)明蛋白序列中。除了用重組法產(chǎn)生之外，本發(fā)明蛋白的片段還可用固相技術(shù)，通過直接合成肽而加以生產(chǎn)(Stewart等人，(1969)Solid-PhasePeptideSynthesis,WHFreemanCo.,SanFrancisco;MerrifieldJ.(1963)J.AmChem.Soc85:2149-2154)。在體外合成蛋白質(zhì)可以用手工或自動進行。例如，可以用AppliedBiosystems的431A型肽合成儀(FosterCity,CA)來自動合成肽。可以分別化學(xué)合成本發(fā)明蛋白的各片段，然后用化學(xué)方法加以連接以產(chǎn)生全長的分子。利用本發(fā)明的粘毛黃芩査爾酮合成酶，通過各種常規(guī)篩選方法，可篩選出與粘毛黃芩査爾酮合成酶相關(guān)發(fā)生相互作用的物質(zhì)，或者受體、抑制劑或拮劑等。本發(fā)明在提高粘毛黃芩黃酮類化合物含量上具有明顯的作用。提高該化合物的產(chǎn)量，以滿足全世界對黃芩苷等藥物的巨大需求。因此，本發(fā)明具有很大的應(yīng)用價值。具體實施方式下面結(jié)合實驗室具體的試驗數(shù)據(jù)和結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等《分子克隆實驗室手冊》(NewYork:CoWSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實施例1粘毛黃芩査爾酮合成酶的克隆1.組織分離(isolation)粘毛黃芩從山西大學(xué)購買，將種子播種于溫室中，待粘毛黃萃苗長至10cm高時，準備抽取DNA或RNA。2.RNA的分離(RNAisolation)取部分組織，用研缽研碎，加入盛有裂解液的1.5mLEP管，充分振蕩后，再移入玻璃勻漿器內(nèi)。勻漿后移至1.5mLEP管中，抽提總RNA(TRIzolReagents,GIBCOBRL,USA)。用甲醛變性膠電泳鑒定總RNA質(zhì)量，然后在分光光度計上測定RNA含量。3.基因的全長克隆(CloningofFull-lengthcDNA)根據(jù)各種植物的査爾酮合成酶基因的核苷酸保守序列，利用同源性基因克隆原理，采用RACE方法(Clontech試劑盒)進行cDNA全長克隆，分三個階段進行(1)核心片斷的克隆PCR[BP001(5，-TTCATGATGTACCAGCAGGGCTGCT曙3，)+BP002(5，-GGAGGMCTTCCTCATCTCATCCA-3，)]得到579bp的核心片斷，回收后連接到pGEMT-Easy載體上，用SP6或T7作為通用引物，采用終止物熒光標記(Big-Dye，Perkin-Elmer，USA)的方法，在ABI377測序儀(Perkin-Elmer，USA)上進行測序。測序結(jié)果用GCG軟件包(Wisconsingroup,USA)中的BLAST和FASTA軟件搜索已有的數(shù)據(jù)庫(Genebank+EMBL)，知其核酸序列及編碼蛋白與己知黃芩的CHS基因的同源性很高，故初步認為它是一個查爾酮基因。(2)3，-RACE第一輪PCR[AP+BP003(5，-TAACCTTCCACCTCCTCAAGGAC-3，)〗連同第二輪PCR〖AP+BP004(5，-TTCGTGATGGATGAGATGAGGAAG-3，)]得到531bp3,端序列，回收，連接到pGEMT-Easy載體上，用SP6或T7作為通用引物，采用終止物熒光標記(Big-Dye，Perkin-Elmer,USA)的方法，在ABI377測序儀(Perkin-Elmer，USA)上進行測序。測序結(jié)果用GCG軟件包(Wisconsingroup,USA)中的BLAST和FASTA軟件搜索己有的數(shù)據(jù)庫(Genebank+EMBL)，知其核酸序列及編碼蛋白與黃芩的CHS基因的同源性很高，故初步認為它是一個查爾酮合成酶基因。(3)5'-RACE第一輪PCR[UMP+BP005(5，-CGTCAATGGCACCCTCGCTGTC-3，)]連同第二輪PCR[(NUP+BP006(5，-TGATGGCGGTGATCTCGGAGCAGA-3，)]得到201bp5'端序列，回收，連接到pGEMT-Easy載體上，用SP6或T7作為通用引物，采用終止物熒光標記(Big-Dye,Perkin-Elmer,USA)的方法，在ABI377測序儀(Perkin-Elmer,USA)上進行測序。測序結(jié)果用GCG軟件包(Wisconsingroup,USA)中的BLAST和FASTA軟件搜索已有的數(shù)據(jù)庫(Genebank+EMBL)，知其核酸序列及編碼蛋白與黃芩的CHS基因的同源性很高，故初步認為它是一個查爾酮合成酶基因。將測序結(jié)果的重疊區(qū)拼接，得到全長片段序列信息，并設(shè)計一對特異引物進行PCR擴增CHS編碼區(qū)(BP007F1(5，-ATGATGTACCAGCAGGGCTGCT-3，)+BP007R1(5，-TCAGTTGAGAGGCACACTATGC-3，))得到CHS的編碼區(qū)(699bp)。BLAST的結(jié)果證明從粘毛黃芩中新得到的基因確為一個查爾酮基因。由于已知的同源査爾酮合成酶基因具有將桂皮酰輔酶A與丙二酸單酰輔酶A縮合成柚皮苷査爾酮的功能，故推測此基因具有相同的功能。通過組合使用上述3種方法,獲得了候選的粘毛黃芩査爾酮合成酶的全長編碼序列。在拼接得到全長(包含完整的開放讀框)的基礎(chǔ)上，進一步設(shè)計引物BP008Fl:5，-CTGACTACCAGCTGACCAAGCT-3，(SEQIDNO.1)為正向引物，BP009Rl:5，-CATTGTATATTAAGCCTTCCATG-3，(SEQIDNO,2)為反向引物，以總RNA為模板，進行RT-PCR擴增，F(xiàn)l/R2的PCR條件為94'C預(yù)變性2min;然后94變性45s、50退火45s、72延伸2min;30個循環(huán)；最后72延伸8min;電泳檢測PCR產(chǎn)物，獲得擴增片斷長度為1142bp。然后按常規(guī)方法以PCR擴增產(chǎn)物進行克隆，測序，獲得SEQIDN0.3所示的序列。實施例2粘毛黃芩查爾酮合成酶基因序列信息與同源性分析本發(fā)明新的査爾酮合成酶基因序列全長cDNA的長度為1142bp，詳細序列見SEQIDNO.3，其中開放讀框位于54-752位核苷酸(699個核苷酸)。根據(jù)全長cDNA推導(dǎo)出粘毛黃芩査爾酮合成酶氨基酸序列，共233個氨基酸殘基，分子量為24.78kDa，等電點(pl)為4.80。詳細序列見SEQIDN0.4。將粘毛黃芩查爾酮合成酶基因基因相關(guān)的全長cDNA序列及其編碼蛋白質(zhì)用BLAST程序在Non-redundantGenBank+EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundantGenBankCDStranslations+PDB+SwissProt+Superdate+PIR數(shù)據(jù)庫中進行核苷酸和蛋白質(zhì)同源性檢索，結(jié)果發(fā)現(xiàn)它與黃芩査爾酮合成酶基因基因序列在核苷酸水平上具有98%的相同性(附表2);在氨基酸水平上，它與黃芩查爾酮合成酶基因CHS在蛋白水平上具有97。/。的相同性，(附表3)。由此可見，粘毛黃芩査爾酮合成酶基因與黃芩査爾酮合成酶基因無論從核酸還是蛋白水平上都存在較高的同源性，故可以認為粘毛黃芩查爾酮合成酶在黃酮類化合物生物合成途徑上也具有相似的作用。實施例3粘毛黃芩查爾酮合成酶蛋白或多肽在粘毛黃芩中進行真核細胞表達及轉(zhuǎn)基因植株中黃^苷含量的檢測。含目的基因的表達載體的構(gòu)建，根據(jù)粘毛黃芩査爾酮合成酶基因編碼序列(SEQIDNO.3)，設(shè)計擴增出完整編碼閱讀框的引物，并在上游和下游引物上分別引入限制性內(nèi)切酶位點(這可視選用的載體而定)，以便構(gòu)建表達載體。以實施例1中獲得的擴增產(chǎn)物為模板，經(jīng)PCR擴增后，將粘毛黃芩査爾酮合成酶基因cDNA克隆至中間載體(如pBluescript)，進一步克隆到雙元表達載體(如pBI121和改進的pCAMBIA1304),在保證閱讀框架正確的前提下鑒定好的表達載體，再將其轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中，利用葉盤法技術(shù)轉(zhuǎn)化粘毛黃芩。1.發(fā)苗采取粘毛黃芩成熟的種子，用0.1%(M/V)升汞(HgCl2)溶液浸泡5分鐘，用無菌水沖洗6次；將粘毛黃芩種子接種在種子萌發(fā)培養(yǎng)基上(培養(yǎng)基盛于150ml的三角瓶中，于12lGC滅菌20分鐘)，該培養(yǎng)基配方為MS基本培養(yǎng)基，添加30g-L'1蔗糖，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH值為5.8，再添加5%瓊脂粉。在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)粘毛黃芩的幼芽，培養(yǎng)條件為25GC，黑暗條件下培養(yǎng)。待種子萌動后，改變培養(yǎng)條件為25QC，12小時光照，光照強度為25^111101111、-1。等到植株片長到3cm高時可用于遺傳轉(zhuǎn)化。2.轉(zhuǎn)化共培養(yǎng)將粘毛黃芩無菌苗的幼嫩葉片用小刀片削成約lcr^放入事先培養(yǎng)好的菌液中(OD值0.4-0.6)侵染3-5分鐘。接著取出放入共培養(yǎng)基暗培養(yǎng)2天。3.除菌培養(yǎng)共培養(yǎng)結(jié)束后，將外植體放入除菌培養(yǎng)基培養(yǎng)。4周繼代一次。待除菌培養(yǎng)結(jié)束后，轉(zhuǎn)入抗性篩選培養(yǎng)基進行轉(zhuǎn)基因毛狀根初步篩選。除菌培養(yǎng)基MS+cb(250mg'I/1)篩選培養(yǎng)基MS+hygr(30mg丄")4.毛狀根的離體培養(yǎng)當(dāng)毛狀根長至大約4cm長時切下，在不含任何植物激素的MS培養(yǎng)基上于25il.(TC無光照的直溫培養(yǎng)箱中繼代培養(yǎng)。每三周繼代一次，經(jīng)過幾次繼代培養(yǎng)后可進行液體發(fā)酵培養(yǎng)，以進一步進行分子檢測。5.轉(zhuǎn)基因粘毛黃芩的分子檢測毛狀根DNA的提取和純化均參照《分子克隆實驗指南》(Sambrook，J.Wa/1993)根據(jù)Fumer等的Ri質(zhì)粒基因序列分析設(shè)計wW、ra/C基因的特異性引物。ro/5基因的一對引物為5'-GCTCTTGCAGTGCTAGATTT-3，和5，-GAAGGTGCAAGCTACCTCTC-3，。ra/C基因的一對引物為5，-CTCCTGACATCAAACTCGTC-3，和5'-TGCTTCGAGTTATGGGTACA-3，。w/5、ra/C基因的片段大小分別423bp和626bp。同時對基因進行PCR檢測。6.査爾酮合成酶基因在粘毛黃芩毛狀根中的northernblot分析1)RNA的提取利用TRIzol試劑盒(GIBCOBRL，USA)提取并參考《分子克隆實驗指南》有關(guān)RNA的制備章節(jié)(Sambrook等，1989)提取粘毛黃芩轉(zhuǎn)基因毛狀根各個單克隆的RNA。2)RNA的定量參考《分子克隆實驗指南》(Sambrook等，1989)，分光光度計測OD260;RNA含量計算1OD26o-4(Hig.mr1。3)總RNA瓊脂糖凝膠電泳分離①取6ml25X(倍)電泳緩沖液，加入117ml無菌水，混勻。②稱取1.5g瓊脂糖，加入到上述溶液中，于微波爐里加熱融化，轉(zhuǎn)入55。C水浴中。③于通風(fēng)櫥中取26.8ml甲醛，加入到55。C的凝膠溶液中，混勻。④迅速倒入制膠板中，室溫水平放置30分鐘，待膠凝固。⑤將提取的RNA(20pg)溶解于RNA變性溶液中，在65。C下加熱10分鐘，然后立即放在冰上。⑥在樣品中加入2ul10X上樣緩沖液，混勻。⑦在電泳液未蓋過膠的條件下點樣，5V/cm電壓電泳5小時左右。4)RNA尼龍膜上轉(zhuǎn)移①轉(zhuǎn)移之前，將尼龍膜用10XSSC浸泡。②將濕潤的膜準確地蓋在膜上，將兩張與膜大小相同的濾紙置2XSSC溶液中濕潤，蓋在膜上，排除氣泡。③濾紙上放一疊與膜大小相同的吸水紙，在吸水紙上放一玻璃板和一重物，水平放置，轉(zhuǎn)移12-20小時。轉(zhuǎn)移后，將膜于80。C烘烤2小時。5)膜上雜交信號的檢出①將膜浸在5XDendart，s，0.I%SDS,O.lmg'mr1鮭魚精DNA，65°C下預(yù)雜交2小時。②將用GeneImagesContentsCDP-Starlabellingmodule標記的探針在沸水中變性5分鐘，直接加入①的雜交液中，于65。C雜交16-24小時。③取出膜，置于洗膜液I(1XSSC，1%SDS)中，于65。C漂洗3次，每次15分鐘。轉(zhuǎn)入洗膜液II(O.IXSSC，1%SDS)中于65°C漂洗3次，每次15分鐘。用X光片壓片60-90分鐘，然后顯影、定影(方法參照RocheDIGlabeled試劑盒說明書)。7.轉(zhuǎn)査爾酮合成酶基因的粘毛黃芩毛狀根黃芩苷的HPLC分析黃芩苷的提取將培養(yǎng)30d的單克隆毛狀根洗凈，用吸水紙吸干水分，稱鮮重后冷凍千燥30h至恒重，研磨成粉，稱取100mg干粉加入10mL甲醇超聲破碎20min,過濾，再提取一次，合并濾液，將甲醇提取液濃縮蒸干，用甲醇定容至IOml，-2(TC保存，作為供試樣品溶液，可用于HPLC分析。高壓液相檢測標準品的制備精密稱取2mg黃芩苷標準對照品，用色譜純甲醇溶解過濾，配成濃度為1000;/g'mi;1，分別梯度稀釋成280、140、70、35、17.5〃g'mi;1。在相應(yīng)的色譜條件下進樣，且每一濃度進樣三次，記錄圖譜及色譜參數(shù)，分別以峰面積對進樣量回歸分析，得對照品的線性回歸方程和標準曲線。高壓液相檢測條件色譜柱為Symmetry-d8柱(4.6mmxl50mm，5pm)，流動相甲醇0.2mol.L"磷酸二氫鈉溶液(45:55)，流速0.8mL'min'1，柱溫25。C。檢測波長280nm。黃芩苷大約在7.7min處出峰。本發(fā)明涉及的序列及記號分列如下(1)SEQIDNO.1的信息(i)序列特征(A)長度:22bp(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii).分子類型寡核苷酸(iii).序列描述SEQIDNO.1AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG(2)SEQIDNO.2的信息(i)序列特征(A)長度23bp(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii).分子類型寡核苷酸(iii).序列描述SEQIDNO.2CATTGTATATTAAGCCTTCCATG(3)SEQIDNO.3的信息(i)序列特征(A)長度:1142bp(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii).分子類型核苷酸(iii).序列描述SEQIDNO.3SEQIDNO.3〈110〉西南大學(xué)<120>粘毛黃芩查爾酮合成酶蛋白編碼序列〈140>〈141>〈160〉2〈170〉Patentlnversion3.1〈210〉1〈211〉1142〈212〉畫<213>粘毛黃吝(ScMfe//an'aBunge)<220>1<221>CDS〈222〉(54)..(752)<223><400>1CTGACTACCAGCTGACCAAGCTGCTCGGCCTCCGTCCCTCCGTCAAGCGCTTCATGATGMetMet59TACCAGTyrGinGCTGAGAlaGluATCACTlieThr40CTGTTCLeuPheGTGGAGValGlu75AGCGAGSerGluCTCAAGLeuLysGCCTTCAlaPhe130CCCGGAProGlyGAGATCGlulie165GCCTGCAlaCysTGCACCCysThrCAGGin5AACAsnTTCPheGGCGlyCGGArgGGTGly95GACAspGGCTGCTTCGlyCysPheAACGCCGGAAsnAlaGly25CGGGGGCCCGlyProArgGACAsp60CCTProGCCAlaGTCValGCGCCGAlaProGGCGlyATGMetGTGVal185ACCThrCCCPro150GCCAlaATClieACCThrGGCGCCGlyAlaCTCTTCleuPhe80ATTGAClieAspCCCGGGProGly115CTGGACLeuAspGCCATTAlalieCAGACCGinThr170TTCGTGPheValGGAGAAGlyGluGCCAlaGCTAlaAGCSer45GGGGlyCAGGinGGCGlyCTGLeuATClie135CTTLeuAGGArgATGMetGGGGlyGGCGGCGlyGly10AGGGTTArgValGACACCAspThrGCGGTCAlaVia65CTGGTCLeuValCACCTTHisLeu100ATCTCClieSerTCCGACSerAspGACCAGAspGin155CAGGTGGinValGATGAGAspGlu190AAGGACLysAspACGThrCTTLeu30CACHisATClieGTGCTCValLeuGTCGTCValValCTCGACLeuAsp50GTTGGAValGlyCGTATGArgMet15TGCTCCCysSerAGCCTGSerLeuTCCGACSerAsp70CAGACGTCGGCGGCGSerAlaAlaGinThr85CGCGAGATTGlulieGCCAlaGAGGlu35GTCValCCCProATClieAAGLysATClieGGCGlyATClieCTCLeuArgAAGLys120TGGTrpGGGGly105AACATCGAGAsnlieGluAACTCCCTCAsnSerLeu140GAGGAGAAGGluGluLys90CTAACCTTCLeuThrPheGACAspACCThrCAGGin55GTGValCCGProCACHisCTGLeu20GCCAlaGCCAlaGGGGlyGACAspCTCLeuAAGLysAGCSer125TTCTGG110CTGAAGGAALeuLysGluATTPheTrplieGTGValGTGGAGGAGAAGCTCValGluGluLysLeu160CTGAGCGACTACGGGLeuSerAspTyrGly175ATGAGGAAGGCCTCCMetArgLysAlaSer195TGGGGGGTTCTTTTCTrpGlyValLeuPhe145GGGCTCAAGGlyLeuLysAACAsnATGMet180GCCAAGAlaLysGGCTTCGlyPheTCCSerGACAspCACHisCCCProAGCSerGGCGly200GGCCCGGlyPhe113167221275329383437491545599653707205210GGCCTCACCGTTGAGACTGTAGTTCTGCATGlyLeuThrValGluThrValValLeuHis220225GACGTGGCGGGGCGCCTTTGATATTTCTTGTTATTTCGAATTTTAGATGTATTTATCGTTTATTTCGTGTGGGAAATTTATATCTATTAATGGGACTATAAAATTACATTTCAAGTTTCAGATTGCTTCAATTGTTGTTTGTTTTTTCAGTTTTAAACTGCTCAAACTGGATATATGTGATTTTTGATGATACATTGTATAGACATGGAAAAA215AGTGTGCCTCTCAATTGAGGTGGT761SerValProLeuAsn承230GGATCATTGCGATTTTTATCTGTT815TATATTCGCCGGATATAATGCATG869TTCTCATTGTGTTCGTAGATAAAT923AGGCATCATGCATTTGATGTGMT977TTGAATATAGAGCTTTGAAAGCAA1031TTGAAATGATGCTTATTTCAAATA1085GGCTTAATATACAATGAAAAAAAA11391142(4)SEQIDNO.4的信息(i)序列特征(A)長度233(B)類型氨基酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii).分子類型多肽(iii).序列描述SEQIDNO.4SEQIDNO.4〈210〉2〈211>233〈212〉PRT〈213>粘毛黃萃v/w'c/w/aBunge)〈400〉2MetMetTyrGinGinGlyCysPheAlaGlyGlyThrValLeuArgMet151015AlaLysAspLeuAlaGluAsnAsnAlaGlyAlaArgValLeuValVal202530CysSerGlulieThrAlalieThrPhe3540LeuAspSerLeuValGlyGinAlaLeu5055VallieValGlySerAspProlieVal6570GinLeuValSerAlaAlaGinThrlie85GlyHisLeuArgArgGlyProSerAspThrHis45GlyAlaGlyAlaPheGlyAsp60GlyValGluArgPro75LeuProAspSerGlu90LeuThrPhelieAspGlyHisLeuArgGlulieGlyLeuThrPheHisLeu100105110AspValProGlyLeulieSerLysAsnlieGluLysSerLeu115120125AlaProLeuAsplieSerAspTrpAsnSerLeuPhe135AlalieLeuAlaPhe130ValHisProGly145GlyLeuLysProTyrGlyAsnMet180ArgLysAlaSer195AspTrpGly210ValVal225GlyPro150GlulieMetAlaGin165SerSerAlaCysVal185AlaLysAspGlyCys200ValLeuPheGlyPheGly215LeuHisSerValProLeuAsn230TrpAsnSer140AspGinValGluGlu155ThrArgGinValLeu170liePheValleuPhe80GlyAla95LeuLysLysGluTrplieLysLeu160SerAsp175GluMetMetAsp190ThrThrThrGlyGlu.GlyLys205PheGlyLeuThrValGluThr220*權(quán)利要求1、一種粘毛黃芩查爾酮合成酶蛋白編碼序列，其特征在于，所分離出的DNA分子包括編碼具有查爾酮合成酶活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列與SEQIDNO.3中從核苷酸第54-752位的核苷酸序列有70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在45-55℃條件下與SEQIDNO.3中從核苷酸第54-752位的核苷酸序列雜交。2、根據(jù)權(quán)利要求l所述的粘毛黃芩查爾酮合成酶蛋白編碼序列，其特征是，所述核苷酸序列由SEQIDN0.3中從核苷酸第54-752位的核苷酸序列構(gòu)成。3、根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的粘毛黃芩查爾酮合成酶蛋白編碼序列，其特征是，所述的序列編碼具有SEQIDN0.3所示的氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。4、根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的粘毛黃芩査爾酮合成酶蛋白編碼序列轉(zhuǎn)化的宿主細胞，其特征是，所述宿主細胞是真核細胞。全文摘要一種粘毛黃芩查爾酮合成酶蛋白編碼序列，屬于基因工程領(lǐng)域。包括編碼具有查爾酮合成酶蛋白活性的多肽的核苷酸序列，而且所述的核苷酸序列與SEQIDNO.3中從核苷酸第54-752位的核苷酸序列有70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在45-55℃條件下與SEQIDNO.3中從核苷酸第54-752位的核苷酸序列雜交。本發(fā)明對提高粘毛黃芩植物體中黃芩苷等黃酮類化合物含量具有明顯的作用，本發(fā)明具有很大的應(yīng)用價值。文檔編號C12N9/00GK101240266SQ200810069440公開日2008年8月13日申請日期2008年3月10日優(yōu)先權(quán)日2008年3月10日發(fā)明者敏孫,桅雷申請人:西南大學(xué)