專利名稱：一種鼠源il-27重組蛋白真核表達載體及構建方法
技術領域：
本發明屬于免疫學及分子生物學技術領域。
背景技術：
IL-27 (Interleukin-27)，是近些年發現的新的白細胞介素，該細胞因子在免疫系統中對于炎癥及腫瘤有廣泛而重要的作用。IL-27重組蛋白在此領域的研究中具有重要意義。然而由于IL-27由EBI3和p28亞基共同組成一個異源二聚體，使得該蛋白的表達載體構建相對困難。

發明內容
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本發明的目的是解決IL-27重組蛋白的表達載體構建問題，提供一種高效表達IL-27的真核表達載體，以及方法簡單、操作方便的構建方法。本發明首先提供了一種鼠源IL-27重組蛋白真核表達載體pSZ12，以及用于構建該載體的相關引物引物PRM-149如序列表SEQ ID No. 1，PRM_150如序列表SEQ ID No. 2，PRM-151 如序列表 SEQ ID No. 3，PRM-152 如序列表 SEQ ID No. 4。本發明的關鍵片段pSZ12-insert，如序列表SEQ ID No. 7所示，其對應的氨基酸序列為E!BI3 (metl-pro228) - (GGGS) 4-p28 (phe29-ser234) -6 XHis-stop condon.本發明同時提供了 EBI3和p28的連接鏈(GGGS)4的編碼DNA序列，如序列表SEQIDNo. 9 所示。本發明將pcDNA3. 1+作為基礎載體實現了高效的蛋白表達效率。本發明所述鼠源IL-27重組蛋白真核表達載體的構建方法，包括下列步驟第I、設計引物引物PRM-149如序列表SEQ ID No. I所示，包含了 KpnI酶切位點和EBI3的5’端編碼序列的一部分；弓丨物PMR-150如序列表SEQID No. 2所示，包含了(GGGS)4鏈編碼序列、EBI3的3’端編碼序列的一部分和P28的5’端編碼序列的一部分；弓丨物PMR-151如序列表SEQID No. 3所示，包含了 p28的5’端編碼序列的一部分；引物PMR-152如序列表SEQ ID No. 4所示，包含了 p28的3’端編碼序列的一部分、6X組氨酸編碼序列，終止密碼子以及XhoI酶切位點；第2、擴增關鍵片段pSZ12_insert首先提取IFN- Y +CpG刺激的小鼠樹突狀細胞的總RNA，逆轉錄酶反轉成cDNA，以此為模板，以引物PRM-149和PRM-150擴增出片段pSZ12-L，如序列表SEQ ID No. 5所示，以弓丨物PRM-151和PRM-152擴增出片段pSZ12_R，如序列表SEQ ID No. 6所示；然后以純化后的pSZ12-L和pSZ12-R為模板，以PRM-149和PRM-152為引物做S0EPCR，擴增出關鍵片段pSZ12-insert，如序列表SEQ ID No. 7所示(附圖I)；
第3、將pSZ12-insert和pcDNA3. 1+載體用KpnI+XhoI雙酶切并純化后用T4連接酶連接，轉化大腸桿菌感受態細胞，涂布氨芐抗性LB培養基平板；第4、鑒定質粒pSZ12，如序列表SEQ ID No. 8所示；挑取單克隆，氨芐抗性液體LB培養基培養并提質粒。酶切鑒定(附圖2)，并測序鑒定，與預期設計完全一致。 本發明的優點和積極效果本發明中的關鍵片段pSZ12-inSert可克隆至其他載體上，以方便不同情況下的IL-27重組蛋白的表達應用。本發明提供了自主設計的(GGGS)4連接兩個亞基，可以保證兩個亞基的同時表達并形成類似內源性蛋白的結構。 本發明中pcDNA3. 1+所包含的neo抗性基因序列可以方便構建穩定表達細胞系。neo抗性基因序列使成功轉染的細胞具有對一定濃度G418的抗性，利用這一特點可以通過向培養基中加入適當濃度的G418來篩選出成功轉染該表達載體的細胞并進行培養，從而構建出穩定表達的細胞系。本發明中所包含的6X組氨酸編碼序列可以方便IL-27重組蛋白的純化。現在市場上已經有成熟的篩選帶有6X組氨酸標簽的蛋白的純化柱，可以很方便的將表達出的IL-27重組蛋白收集純化，且不影響IL-27重組蛋白的生物學活性。本發明的表達載體可以通過轉化入DH5 α感受態細胞進行擴增，其中pcDNA3. 1 +所包含的Ampicillin抗性基因序列可用于對轉化成功的細菌進行篩選，方便快捷。將該表達載體轉入細菌后用含有氨芐抗生素的液體培養基培養細菌至所需濃度，提取質粒即可得到大量擴增的重組蛋白表達載體，用于后續試驗。


圖I.鼠源IL-27重組蛋白真核表達載體pSZ12的關鍵序列pSZ12-insert示意圖。圖2. pSZ12的酶切鑒定。圖中，M表示DNA標準條帶，從上到下依次是8000bp、5000bp、3000bp、2000bp、IOOObp0 1-6表示用XhoI對pSZ12進行單酶切，條帶大小為6743bp，7-12表示用XhoI和KpnI對pSZ12進行雙酶切，條帶大小為5364bp和1379bp。圖3. pSZ12轉染293T細胞的蛋白表達水平鑒定。圖中，Control表示對照質粒pcDNA3. I+,ND表示未檢測出。對照質粒和pSZ12轉染293T細胞后24小時及48小時收細胞上清，用ELISA方法檢測其中的IL-27含量。
具體實施例方式實施例I (附圖I、附圖2 )鼠源IL-27重組蛋白真核表達載體的構建方法I.引物設計與關鍵片段pSZ12_insert的擴增弓丨物PRM-149如序列表SEQID No. I所示，包含了 KpnI酶切位點和EBI3的5’端編碼序列的一部分；弓丨物PMR-150如序列表SEQID No. 2所示，包含了(GGGS)4鏈編碼序列、EBI3的3’端編碼序列的一部分和P28的5’端編碼序列的一部分；弓丨物PMR-151如序列表SEQID No. 3所示，包含了 p28的5’端編碼序列的一部分；弓丨物PMR-152如序列表SEQID No. 4所示，包含了 p28的3’端編碼序列的一部分，6X組氨酸編碼序列，終止密碼子以及XhoI酶切位點；首先提取IFN- Y +CpG刺激的小鼠樹突狀細胞的總RNA，逆轉錄酶反轉成cDNA，以此為模板，以引物PRM-149和PRM-150擴增出片段pSZ12-L，如序列表SEQ ID No. 5所示，以弓丨物PRM-151和PRM-152擴增出片段pSZ12_R，如序列表SEQ ID No. 6所示；然后以純化后的pSZ12-L和pSZ12-R為模板，以PRM-149和PRM-152為引物做S0EPCR，擴增出關鍵片段pSZ12-insert，如序列表SEQ ID No. 7所示(附圖I)。擴增的反應條件為98°C預變性2min,以98°C變性10s，57。。退火15s，72。。延伸lmin，擴增30個循環， 末次循環后再72°C延伸lOmin，之后4°C保溫。PCR產物均經1%瓊脂糖凝膠電泳，將目的條帶切下后，用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收純化。2.鼠源IL-27重組蛋白真核表達載體pSZ12的構建與鑒定將pSZ12-insert和pcDNA3. 1+載體用KpnI+XhoI雙酶切，分別用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收純化酶切產物，在T4 DNA連接酶作用下定向連接pSZ12-insert至pcDNA3. 1+，將連接產物轉化入DH5a感受態細菌中，在LB (Amp+)培養基中篩選培養。挑取陽性克隆，培養后小量提取質粒，分別對PSZ12進行XhoI單酶切與KpnI和XhoI雙酶切鑒定(附圖2)，選取陽性克隆進行測序，測序結果與預期設計完全一致。實施例2 (附圖3)利用鼠源IL-27重組蛋白真核表達載體PSZ12體外表達IL-27重組蛋白I. 293T細胞培養在IOcm細胞培養盤中，加入IOml含10%小牛血清的DMEM新鮮培養基至80%左右生長密度。2.將10 μ g的pSZ12質粒和control對照質粒分別加入500 μ LOpti-MEM培養基，混勻，再加入15 μ L FuGENE HD轉染試劑，混勻。室溫放置15分鐘。3.將轉染試劑混合物滴加入細胞培養盤，輕輕晃勻，繼續放入培養箱培養。4.轉染后24小時和48小時分別收集細胞上清，用IL-27的ELISA試劑盒檢測上清中表達的IL-27重組蛋白。在用control對照質粒轉染的293T細胞上清中均檢測不到IL-27重組蛋白的表達；在用pSZ12質粒轉染的293T細胞上清中則能夠檢測到IL-27重組蛋白的表達，且表達量較高。
權利要求
1.一種鼠源IL-27重組蛋白真核表達載體PSZ12，如序列表SEQ ID No. 8所示。
2.一種鼠源IL-27重組蛋白真核表達載體的構建方法，包括下列步驟 第I、設計引物 引物PRM-149如序列表SEQ ID No. I所示，包含了 KpnI酶切位點和EBI3的5’端編碼序列的一部分； 引物PMR-150如序列表SEQ ID No. 2所示，包含了(GGGS)4鏈編碼序列、EBI3的3’端編碼序列的一部分和P28的5’端編碼序列的一部分； 引物PMR-151如序列表SEQ ID No. 3所示，包含了 p28的5’端編碼序列的一部分； 引物PMR-152如序列表SEQ ID No. 4所示，包含了 p28的3’端編碼序列的一部分，6X組氨酸編碼序列，終止密碼子以及XhoI酶切位點； 第2、擴增關鍵片段pSZ12-insert 首先提取IFN- Y +CpG刺激的小鼠樹突狀細胞的總RNA，逆轉錄酶反轉成cDNA，以此為模板，以引物PRM-149和PRM-150擴增出片段pSZ12-L，如序列表SEQ ID No. 5所示，以引物PRM-151和PRM-152擴增出片段pSZ12_R，如序列表SEQ ID No. 6所示； 然后以純化后的PSZ12-L和pSZ12-R為模板，以PRM-149和PRM-152為引物做S0EPCR，擴增出關鍵片段pSZ12-insert，如序列表SEQ ID No. 7所示; 第3、將pSZ12-insert和pcDNA3. 1+載體用KpnI+XhoI雙酶切并純化后用T4連接酶連接，轉化大腸桿菌感受態細胞，涂布氨芐抗性LB培養基平板； 第4、鑒定質粒pSZ12 挑取單克隆，氨芐抗性液體LB培養基培養并提質粒，酶切鑒定并測序鑒定。
3.引物PRM-149 如序列表 SEQ ID No. 1，PRM-150 如序列表 SEQ ID No. 2，PRM-151 如序列表 SEQ ID No. 3，PRM-152 如序列表 SEQ ID No. 4。
4.一種鼠源IL-27重組蛋白真核表達載體pSZ12中的關鍵片段pSZ12-insert的序列，如序列表SEQ ID No. 7所示。
5.EBI3和p28的連接鏈(GGGS) 4的編碼DNA序列，如序列表SEQ ID No. 9所示。
全文摘要
本發明公開了一種鼠源IL-27重組蛋白真核表達載體及構建方法。其構建流程是設計引物分別將編碼小鼠EBI3氨基酸1-228的cDNA序列與編碼小鼠p28氨基酸29-234的cDNA序列擴增，然后通過SOEPCR的方法獲得整合的DNA片段。將此片段與pcDNA3.1+載體連接后得到鼠源IL-27重組蛋白真核表達載體pSZ12。其中EBI3和p28通過預先設計的氨基酸編碼序列連接。本發明所構建的載體，不僅能高效表達由EBI3和p28組成的異源二聚體IL-27，而且包含6×組氨酸編碼序列，極大方便了重組蛋白的純化。并且可將其關鍵片段克隆至其他載體上以方便不同情況下的蛋白表達應用，為研究IL-27功能及基因治療方法的研究提供了一個有效工具。
文檔編號C12N15/66GK102816794SQ20121030203
公開日2012年12月12日 申請日期2012年8月23日 優先權日2012年8月23日
發明者張松, 梁瑞芳, 劉暢, 尹芝南 申請人:南開大學