專利名稱：利用編碼花色苷3′位芳香族?；D(zhuǎn)移酶的基因的花色苷色素穩(wěn)定化和藍(lán)化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及下述使花色苷變得更藍(lán)且更穩(wěn)定的方法，其利用使芳香族?；D(zhuǎn)移到花色苷3'位上的酶或編碼該酶的基因，其可在花色苷色素的改變和穩(wěn)定化、進而在花色的改變和穩(wěn)定化上得到利用。更具體而言，涉及利用來自以龍膽(Gentiana triflora var.japonica)為代表的植物的花色苷3'位芳香族?；D(zhuǎn)移酶或編碼該酶的cDNA使花色呈現(xiàn)藍(lán)色并穩(wěn)定化的方法。此外，本發(fā)明還涉及下述使花色苷變得更藍(lán)且更穩(wěn)定的方法，其利用具有使芳香 族?；D(zhuǎn)移到花色苷多個位置糖上的活性的單一酶或編碼該酶的基因，其可在花色苷色素的改變和穩(wěn)定化、進而在花色的改變和穩(wěn)定化上得到利用。
背景技術(shù)：
花卉產(chǎn)業(yè)致力于各種新品種的開發(fā)。改變花色作為培育新品種的有效方法之一，利用傳統(tǒng)的育種方法，幾乎在所有的商業(yè)品種中均培育出呈現(xiàn)各種花色的品種。但是，在以往的育種方法中，因各個種的基因庫受到限制，所以單一種具有廣泛花色品種的情況很罕見。花色主要來源于兩類色素，即類黃酮和類胡蘿卜素。類黃酮主要呈現(xiàn)從黃色到紅色或藍(lán)色的較廣范圍花色，而類胡蘿卜素主要呈現(xiàn)橙色或黃色的色調(diào)。類黃酮中主要控制花色的是總稱為花色苷的一類化合物。花色苷的發(fā)色團是花色素，主要的花色素有花葵素、花青素、花翠素。已知植物中存在多種花色苷，其多樣性是花色多樣性的原因之一。已鑒定出數(shù)百種花色苷的結(jié)構(gòu)，幾乎所有花色苷的3位輕基均被糖修飾(Harbone, in TheFlavonoids:565, 1986)0關(guān)于花色苷的生物合成途徑，到3位糖苷化合物的生物合成為止，在幾乎所有的種子植物中均相同(Holton et al.，Plant Cell7:1071，1995)，之后，進行種和品種特異性糖苷化、?；⒓谆雀鞣N修飾。品種的修飾類型的不同是花色苷多樣性即花色五顏六色的原因之一。通常，修飾花色苷的芳香族?；蕉?，花色苷越穩(wěn)定、越藍(lán)(Harbone，inThe Flavonoids:565, 1986 ;齊藤規(guī)夫，蛋白質(zhì)核酸酶(日文原文蛋白質(zhì)核酸酵素)47 202，2002)。此外，上述花色苷與金屬的復(fù)合物的形成、黃酮醇和黃酮等類黃酮化合物的共色效應(yīng)(co-pigmentation)、局部存在花色苷的液泡的pH等均對花色產(chǎn)生影響(Forkmann, Plant Breeding 106:1,1991)。關(guān)于包含花色素的類黃酮的生物合成，正處于詳細(xì)研究階段。參與花色苷合成的酶的基因已全部被克隆，它們的轉(zhuǎn)錄因子的基因也已獲得。因此，通過人為改變這些基因的表達(dá)，可以改變花中積累的類黃酮的結(jié)構(gòu)和量，改變花色。
通過分子生物學(xué)方法和向植物導(dǎo)入基因來改變花色苷結(jié)構(gòu)、改變花色的例子已見諸報道(Forkmann G&Martens S (2001). Curr Opin. Biotechnolgy, 12:155-160TanakaY&Mason J(2003)In:Singh RP&Jaiwal PK(ed.)Plant genetic engineering, pp 361-385.SCI tech publishing, Houston)。作為使花色呈現(xiàn)藍(lán)色的方法之一，可以考慮增加花色苷B環(huán)的羥基數(shù)。催化花色苷3'位羥化反應(yīng)的酶(類黃酮3'-羥化酶F3' H)和催化花色苷3'位和5’位羥化反應(yīng)的酶(類黃酮3'，5’_羥化酶F3' 5’H)在改變花色上很重要。大體而言，花葵素(B環(huán)有一個羥基)多存在于橙色到紅色的花中，花青素(B環(huán)有兩個羥基)多存在于紅色到深紅色的花中，花翠素(B環(huán)有三個羥基)多存在于紫色到藍(lán)色的花中。多數(shù)情況下，沒有紫色到藍(lán)色品種的植物種欠缺產(chǎn)生花翠素的能力，其代表例子有月季、菊花、康乃馨。對從上述植物中通過生物工程培育紫色到藍(lán)色的品種，一直以來備受關(guān)注。實際上，通過使產(chǎn)生花翠素所必須的F3' 5’H基因表達(dá)，已培育出花色呈藍(lán)紫色的康乃馨(Tanaka Y&Mason J(2003)In:Singh RP&Jaiwal PK(ed.)Plant genetic engineering, pp 361-385. SCI tech publishing, Houston)，雖然可在花瓣中產(chǎn)生花翠素，但花色并非純藍(lán)色。即，為了使花色呈現(xiàn)純正的藍(lán)色，僅導(dǎo)入F 3' 5’H基因并不充分，還需進一步研究。實際上，藍(lán)色花中含有的花色苷，大多通過糖被芳香族?；揎?Honda&SaitoHeterocycles 56:633(2002))。因此，作為使花色更藍(lán)的方法之一，可以考慮通過咖啡酰基、香豆酰基、芥子?；确枷阕艴；揎椈ㄉ?Tanaka&Mason (2003)In: Singh RP&Jaiwal PK(ed. ) Plant genetic engineering.pp 361-385.SCI techpublishing, Houston)。通常，花色苷因糖苷化而稍稍變紅，通過糖與芳香族酰基結(jié)合的花色苷，其顏色變藍(lán)(Forkmann, Plant Breeding 106:1,1991)。此外，花色苷在中性溶液中是不穩(wěn)定的化合物，但通過糖、酰基的修飾，穩(wěn)定性提高(Forkmann, Plant Breeding 106:1,1991)。由利用牽牛花(Pharbitis nil)花色苷的實驗可知,酰化后的花色苷中，通過葡萄糖與芳香族?；缗c香豆酸、咖啡酸連接的花色苷，其最大吸收向長波長方向移動(Dangle etal.Phytochemistry 34 :1119,1993)。關(guān)于與芳香族酰基結(jié)合的花色苷，以來自鴨妬草(Commelina communis)的Awobanin (Go to and Kondo, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 30:17, 1991)為代表，來源于自然界的諸多分離例(Honda&Saito Heterocycles 56:633 (2002))已見諸報道。例如，關(guān)于藍(lán)色花的花色苷，以Cinerarin (來自瓜葉菊)、Gentiodelphin (來自龍膽)、Heavenly blueanthocyanin (來自牽?；?、Ternatin (來自蝶豆)、Lobelinin (來自山梗菜)等為代表,具有多個芳香族?；?。據(jù)報道，來自瓜葉菊(Seneciocruentus)的 Cinerarin (Goto etal.，Tetrahedron 25:6021, 1984)具有I個脂肪族?；?個芳香族?；@些芳香族?；兄谥行运芤褐猩氐姆€(wěn)定化(Goto et al. , Tetrahedron 25:6021,1984)。此外，作為龍膽花瓣主要色素的Gentiodelphin (DEL 3G_5CafG_3’ CafG),以花翠素3位糖苷化合物為基本骨架，在5位和3'位的羥基上具有由I分子葡萄糖和I分子咖啡酸形成的側(cè)鏈。據(jù)報道，上述5位和3，位的糖-?；鶄?cè)鏈形成三明治式分子內(nèi)堆積，在水溶液中，色素穩(wěn)定化(Yoshida et al. Tetrahedron 48 :4313, 1992)。還證實2 條糖-芳香族?；鶄?cè)鏈中，3'位的糖_芳香族?；?位更有助于色素的穩(wěn)定化、藍(lán)化(Yoshida et al. Phytochemistry54:85，2000)。芳香族?；D(zhuǎn)移反應(yīng)于1980年在石竹科植物Silene (Kamsteeg et al. , Biochem.Physiol. Pflanzen 175:403, 1980)中首先發(fā)現(xiàn)，在Matthiola的可溶性酶組分中也發(fā)現(xiàn)同樣的芳香族酰基轉(zhuǎn)移酶活性(Teusch et al. , Phytochemistry 26:991,1986)。之后，從龍膽分離出使咖啡酸、香豆酸等芳香族?；D(zhuǎn)移到花色苷5位糖上的花色苷5位芳香族酸基轉(zhuǎn)移酶(以下稱 5AT) (Fujiwara et al.，Eur. J. Biochem. 249，45，1997),基于精制后的酶的內(nèi)部氨基酸序列信息，分離出編碼龍膽5AT的cDNA (Fujiwara et al.，PlantJ.，16，421，1998)。基于該基因，從蝴蝶草(W02005/017147)分離出同源物，進而，基于這些酶中保留的氨基酸序列，分離出編碼使芳香族酰基轉(zhuǎn)移到花色苷3位糖上的酶(3AT)的紫蘇的cDNA(Yonekura-Sakakibara et al. , Plant Cell Physiol 41:495,2000)。利用紫蘇 3AT 基因，從同為紫蘇科的薰衣草中克隆得到3AT基因(W096/25500)。 從矮牽牛花中得到使?；D(zhuǎn)移到花色素-3-蕓香糖苷上的酶基因(日本特表2003-528603)。將紫蘇3AT基因或蝴蝶草5AT基因?qū)朐录竞?，在花瓣中產(chǎn)生3位或5位與芳香族?；Y(jié)合的花色苷，但并未使花色顯著變藍(lán)，僅最大吸收值向長波長移動了 l_2nm左右。究其原因，可認(rèn)為如吉田等的報告(Yoshidaet al. Tetrahedron48 :4313, 1992)中所述，僅3位、5位等A環(huán)或C環(huán)酰化，效果并不理想，對于花色苷的藍(lán)化、穩(wěn)定化而言，3'位的?；蔀楸仨?，更優(yōu)選包括3'位在內(nèi)的多個位置?；嶋H上，因存在3'位糖與芳香族?；B接的花色苷，可推測存在對3,位糖上的芳香族?；D(zhuǎn)移反應(yīng)進行催化的酶(3; AT)。但迄今為止，3' AT的反應(yīng)還未被測定，3' AT酶或編碼:V AT的基因也未被克隆。迄今為止所報道的?；D(zhuǎn)移酶均為作用于花色苷3位或5位的酶，反應(yīng)的部位特異性高(Fujiwara et al. Plant J. , 16, 421, 1998, Yonekura-Sakakibara et al. , PlantCell Physiol. 41，495，2000)。因此認(rèn)為不能用已知的芳香族酰基轉(zhuǎn)移酶進行3'位的?；?。而且，至今還沒有關(guān)于具有使芳香族?；D(zhuǎn)移到花色苷多個位置上的活性的芳香族酰基轉(zhuǎn)移酶的報道。因此，以現(xiàn)有的技術(shù)水平，例如，制備基因重組植物、在花色苷的3'位、乃至包含3,位在內(nèi)的多個位置的糖上轉(zhuǎn)移芳香族?；遣豢赡艿摹＜?，很難通過在花色苷的3'位、乃至包含3,位在內(nèi)的多個位置糖上結(jié)合芳香族?；姆椒ㄊ够ㄉ崭{(lán)、更穩(wěn)定、進而使花色更藍(lán)、更穩(wěn)定。專利文獻1W096/25500專利文獻2W02005/017147專利文獻3日本特表2003-528603非專利文獻I Harbone, in The Flavonoids: 565, 1986非專利文獻2 Holton et al. , Plant Cell 7:1071, 1995非專利文獻3 Harbone, in The Flavonoids: 565, 1986非專利文獻4齊藤規(guī)夫、蛋白質(zhì)核酸酶(日文原文蛋白質(zhì)核酸酵素)47:202, 2002非專利文獻5 Forkmann, Plant Breeding 106:1,1991
非專利文獻6 Forkmann G&Martens S (2001) . Curr Op in.Biotechnolgy, 12:155-160非專利文獻7 Tanaka Y&Mason J (2003) In: Singh RP&Jaiwal PK (ed. ) Plantgenetic engineering, pp 361-385. SCI tech publishing, Houston非專利文獻8 Honda&Saito Heterocycles 56:633 (2002)非專利文獻9 Forkmann, Plant Breeding 106:1,1991非專利文獻10 Dangle et al. Phytochemistry 34 :1119, 1993非專利文獻11 Goto et al. , Tetrahedron 25:6021, 1984非專利文獻12 Yoshida et al. Tetrahedron 48 :4313, 1992
非專利文獻13 Yoshida et al. Phytochemistry 54:85, 2000非專利文獻14 Goto and Kondo, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 30:17, 1991非專利文獻15 Kamsteeg et al. , Biochem. Physiol. Pf lanzenl75:403, 1980非專利文獻16 Teusch et al. , Phytochemistry 26:991, 1986非專利文獻17 Fujiwara et al. , Eur. J. Biochem. 249, 45, 1997非專利文獻18 Fujiwara et al. , Plant J. , 16, 421, 1998非專利文獻19 Yonekura-Sakakibara et al. , Plant CellPhysiol 41:495, 2000

發(fā)明內(nèi)容
如上述Yoshida等的報告所述，花色苷的芳香族酰基有助于花色苷的穩(wěn)定化和藍(lán)化，特別是3'位的糖-酰基側(cè)鏈比5位的糖-?；鶄?cè)鏈的作用更大。而且，包含3'位在內(nèi)的多個位置的糖-?；鶄?cè)鏈?zhǔn)够ㄉ崭{(lán)更穩(wěn)定。因此，若利用使芳香族?；D(zhuǎn)移到花色苷3'位或包含3'位在內(nèi)的多個糖的位置上的酶或編碼該酶的基因，即可人為修飾花色苷，使花色苷變成更穩(wěn)定的化合物，而且還可以使該花色苷更藍(lán)。如上所述，為了使花色苷穩(wěn)定化、藍(lán)化，向3,位轉(zhuǎn)移芳香族?；欠浅Ｓ行У姆椒ā榇耍两駷橹刮磮蟮赖幕ㄉ?'位芳香族?；D(zhuǎn)移酶或編碼該酶的基因不可缺少。發(fā)明者等對從龍膽分離的花色苷5位芳香族?；D(zhuǎn)移酶的酶學(xué)性質(zhì)進行了詳細(xì)研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)龍膽的5位芳香族?；D(zhuǎn)移酶具有3'?；D(zhuǎn)移活性。即，該酶雖然是單一酶，但催化在花色苷5位和3,位這兩個位置的糖上分別轉(zhuǎn)移芳香族?；姆磻?yīng)。因此，本發(fā)明提供通過向花色苷的3'位附加芳香族酰基從而使花色苷更藍(lán)更穩(wěn)定的方法。本發(fā)明還提供通過將編碼該芳香族?；D(zhuǎn)移酶的基因?qū)胫参锊⒈磉_(dá)，從而使花色更穩(wěn)定更藍(lán)的方法。因此，本發(fā)明提供(I)花色苷的3'位的?；椒ǎ淅檬狗枷阕艴；D(zhuǎn)移到花色苷3'位糖上的酶或編碼該酶的基因。(2)本發(fā)明還提供花色苷的穩(wěn)定化方法，其利用使芳香族酰基轉(zhuǎn)移到花色苷3,位糖上的酶或編碼該酶的基因。(3)本發(fā)明還提供花色苷的藍(lán)化方法，其利用使芳香族?；D(zhuǎn)移到花色苷3,位糖上的酶或編碼該酶的基因。(4)本發(fā)明進一步提供目標(biāo)色素的?；椒?，其使編碼花色苷3'位芳香族?；D(zhuǎn)移酶的基因在植物中表達(dá)，在該植物體內(nèi)將目標(biāo)色素酰化。
(5)本發(fā)明進一步提供目標(biāo)色素的穩(wěn)定化方法，其將編碼花色苷3'位芳香族?；D(zhuǎn)移酶的基因?qū)胫参?，在該植物體內(nèi)目標(biāo)色素?；瑥亩乖撋胤€(wěn)定化。(6)本發(fā)明還提供目標(biāo)色素的藍(lán)化方法，其將編碼花色苷3'位芳香族?；D(zhuǎn)移酶的基因?qū)胫参?，在該植物體內(nèi)目標(biāo)色素酰化，從而使該色素藍(lán)化。(7)本發(fā)明進一步提供通過上述(4) (6)任一項所述的方法得到的植物體、該植物體的營養(yǎng)繁殖體或種子、或與該植物體具有同一性質(zhì)的該植物體后代的植物體、該植物體的營養(yǎng)繁殖體或種子。(8)本發(fā)明還提供在花色苷多個位置的糖上結(jié)合芳香族?；姆椒?，其特征在于，利用具有使芳香族酰基轉(zhuǎn)移到花色苷多個位置糖上的活性的單一酶或編碼該酶的基因。(9)本發(fā)明進一步提供花色苷的穩(wěn)定化方法，其特征在于，利用具有使芳香族?；D(zhuǎn)移到花色苷多個位置糖上的活性的單一酶或編碼該酶的基因。
0054](10)本發(fā)明還提供花色苷的藍(lán)化方法，其特征在于，利用具有使芳香族?；D(zhuǎn)移到花色苷多個位置糖上的活性的單一酶或編碼該酶的基因。(11)本發(fā)明進一步提供上述(8) (10)任一項所述的方法，其中，所述多個位置之一是花色苷的3,位的糖。( 12)本發(fā)明還提供目標(biāo)色素的?；椒ǎ涫咕哂惺狗枷阕艴；D(zhuǎn)移到花色苷多個位置糖上的活性的單一酶或編碼該酶的基因在植物中表達(dá)，在該植物體內(nèi)將目標(biāo)色素酰化。( 13)本發(fā)明還提供目標(biāo)色素的穩(wěn)定化方法，其將具有使芳香族?；D(zhuǎn)移到花色苷多個位置糖上的活性的單一酶或編碼該酶的基因?qū)胫参?，在該植物體內(nèi)目標(biāo)色素?；瑥亩乖撋胤€(wěn)定化。(14)本發(fā)明進一步提供目標(biāo)色素的藍(lán)化方法，其將具有使芳香族?；D(zhuǎn)移到花色苷多個位置糖上的活性的單一酶或編碼該酶的基因?qū)胫参铮谠撝参矬w內(nèi)目標(biāo)色素酰化，從而使該色素藍(lán)化。(15)本發(fā)明還提供上述(12) (14)任一項所述的方法，其中，所述多個位置之一是花色苷的3,位的糖。(16)本發(fā)明進一步提供通過上述(12) (15)任一項所述的方法得到的植物體、該植物體的營養(yǎng)繁殖體或種子、或與該植物體具有同一性質(zhì)的該植物體后代的植物體、該植物體的營養(yǎng)繁殖體或種子。(17)本發(fā)明還提供下述基因，所述基因是編碼具有序列號4或6所述氨基酸序列且具有使芳香族?；D(zhuǎn)移到花色苷3,位糖上的活性的蛋白質(zhì)的基因、或是編碼與該氨基酸序列具有70%以上的序列同一性且具有使芳香族?；D(zhuǎn)移到花色苷3'位糖上的活性的蛋白質(zhì)的基因、或是與序列號3或5所述核苷酸序列具有70%以上同一性且編碼具有使芳香族酰基轉(zhuǎn)移到花色苷3,位糖上的活性的蛋白質(zhì)的基因。(18)本發(fā)明還提供下述基因，所述基因是編碼具有序列號4或6所述氨基酸序列且具有使芳香族酰基轉(zhuǎn)移到花色苷多個位置糖上的活性的蛋白質(zhì)的基因、或是編碼與該氨基酸序列具有70%以上的序列同一性且具有使芳香族酰基轉(zhuǎn)移到花色苷多個位置糖上的活性的蛋白質(zhì)的基因、或是與序列號3或5所述核苷酸序列具有70%以上同一性且編碼具有使芳香族酰基轉(zhuǎn)移到花色苷多個位置糖上的活性的蛋白質(zhì)的基因。
(19)本發(fā)明還提供上述(18)所述的基因，其中，所述多個位置之一是花色苷的 位的糖。(20)本發(fā)明還提供包含上述(17) (19)任一項所述基因的載體。(21)本發(fā)明還提供由上述(20 )所述的載體轉(zhuǎn)化的宿主。(22)本發(fā)明還提供由上述(17) (19)任一項所述的基因所編碼的蛋白質(zhì)。(23)本發(fā)明進一步提供蛋白質(zhì)的制造方法，其特征在于，培養(yǎng)上述(21)所述的宿主，或使其生長發(fā)育，然后從該宿主獲取具有將糖轉(zhuǎn)移到類黃酮3,位上的活性的蛋白質(zhì)。(24)本發(fā)明還提供導(dǎo)入了上述(17) (19)任一項所述基因的植物或與其具有相同性質(zhì)的該植物的后代或它們的組織。 (25)本發(fā)明進一步提供上述(24)所述植物的切花或與其具有相同性質(zhì)的該植物后代的切花。(26)本發(fā)明還提供花色苷的3'位的?；椒?，其特征在于，利用上述(17)
(19)任一項所述的基因。(27)本發(fā)明還提供花色苷的穩(wěn)定化方法，其特征在于，利用上述(17) (19)任一項所述的基因。(28)本發(fā)明還提供花色苷的藍(lán)化方法，其特征在于，利用上述(17) (19)任一項所述的基因。(29)本發(fā)明進一步提供目標(biāo)色素的酰化方法，其將上述(17) (19)任一項所述的基因在植物中表達(dá)，在該植物體內(nèi)將目標(biāo)色素?；?。(30)本發(fā)明還提供目標(biāo)色素的穩(wěn)定化方法，其將上述(17) (19)任一項所述的基因?qū)胫参?，在該植物體內(nèi)目標(biāo)色素?；?，從而使該色素穩(wěn)定化。(31)本發(fā)明還提供目標(biāo)色素的藍(lán)化方法，其將上述(17) (19)任一項所述的基因?qū)胫参?，在該植物體內(nèi)目標(biāo)色素?；?，從而使該色素藍(lán)化。(32)本發(fā)明進一步提供在花色苷多個位置的糖上結(jié)合芳香族?；姆椒ǎ涮卣髟谟?，利用上述(17) (19)任一項所述的基因。(33)本發(fā)明進一步提供上述(32)所述的方法，其中，所述多個位置之一是花色苷的3'位的糖。


圖I所示為本發(fā)明相關(guān)的花色苷類化合物的結(jié)構(gòu)式、名稱及簡稱。圖2所示為本發(fā)明相關(guān)的花色苷類化合物的結(jié)構(gòu)式、名稱及簡稱。圖3表示以50μΜ的DEL 3G-5G-3, G作為底物使用時反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)時變化的圖表。圖中，triG 表示 DEL 3G-5G-3 ' G、5Caf 表示 DEL3G_5CafG_3 ' G、3 ' Caf 表示 DEL3G-5G-3' CafG、5，3' Caf 表示 Gentiodelphin (DEL 3G_5CafG_3' CafG)0圖4表示以ΙΟΟμΜ的DEL 3G-5G-3, G作為底物使用時反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)時變化的圖表。圖中，triG 表示 DEL 3G-5G-3 ' G、5Caf 表示 DEL3G_5CafG_3 ' G、3' Caf 表示 DEL3G-5G-3' CafG、5，3' Caf 表示 Gentiodelphin (DEL 3G_5CafG_3' CafG)0圖5表示以200 μ M的DEL 3G-5G-3; G作為底物使用時反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)時變化的圖表。圖中，triG 表示 DEL 3G-5G-3 ' G、5Caf 表示 DEL3G_5CafG_3 ' G、3' Caf 表示 DEL3G-5G-3' CafG、5，3' Caf 表示 Gentiodelphin (DEL 3G_5CafG_3' CafG)D圖6表示從龍膽花瓣部分精制的蛋白質(zhì)的SDS-PAGE以及Western印跡的結(jié)果。左邊為SDS-PAGE的結(jié)果，右邊為使用了 GAT4抗體的Western印跡的結(jié)果。圖中，M為分子量標(biāo)記,Lanel為40 70%硫酸銨沉淀組分的結(jié)果,Lane2為經(jīng)Dyematrix柱后的活性組分的結(jié)果。圖7所示為采用了 Medio榨汁液的花色模擬結(jié)果。
具體實施例方式本說明書中對利用來自龍膽的花色苷3'位芳香族?；D(zhuǎn)移酶或編碼該酶的基因的方法進行說明，但所用的基因或該基因所編碼的蛋白質(zhì)不限于此。眾所周知，具有經(jīng)多個氨基酸添加、缺失或與其他氨基酸取代而修飾后的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，維持與原來的蛋 白質(zhì)同等的酶活性。因此，只要保持對3'位糖的芳香族?；D(zhuǎn)移活性，具有龍膽的該酶的 氨基酸序列經(jīng)I個或多個氨基酸添加、缺失和/或與其他氨基酸取代而修飾后的氨基酸序列的蛋白質(zhì)以及編碼該蛋白質(zhì)的基因的利用也屬于本發(fā)明。本發(fā)明還包括編碼下述蛋白質(zhì)的基因，所述蛋白質(zhì)具有與龍膽的花色苷3'位芳香族?；D(zhuǎn)移酶的氨基酸序列、序列號4或6所述氨基酸序列有70%以上、優(yōu)選90%以上同一性的氨基酸序列，且具有使芳香族?；D(zhuǎn)移到花色苷3'位糖上的活性。此外，下述基因的利用也屬于本發(fā)明，所述基因在5xSSC、50°C這樣較溫和的條件下與編碼龍膽的3'位糖的芳香族酰基轉(zhuǎn)移酶的DNA雜交，且編碼具有3'位芳香族?；D(zhuǎn)移活性的蛋白質(zhì)。而且，下述基因的利用也屬于本發(fā)明，所述基因在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與編碼龍膽的3'位芳香族酰基轉(zhuǎn)移酶的DNA雜交，且編碼具有3'位芳香族?；D(zhuǎn)移活性的蛋白質(zhì)。這里所述的嚴(yán)謹(jǐn)條件，例如指2xSSC、65°C，但雜交的條件根據(jù)探針?biāo)玫腄NA的長度以及堿基組成而不同，因此，并不限于上述條件。通過上述雜交篩選的基因，可列舉來自天然的基因，例如，來源于含有3'位與芳香族酰基結(jié)合的花色苷的植物，如蝶豆、山梗菜、瓜葉菊的基因，但不限于來源于植物。即，只要是編碼具有花色苷3'位芳香族?；D(zhuǎn)移活性的酶的基因，均可利用。此外，通過雜交篩選的基因，可以是cDNA，也可以是基因組DNA。而且，從山梗菜、蝶豆等含有3,位與芳香族?；Y(jié)合的花色苷的植物，采用該龍膽的酶的精制方法或局部改變后的方法，可精制3'位芳香族酰基轉(zhuǎn)移酶。通過確定精制后的酶的氨基酸序列，可克隆編碼該酶的基因。編碼具有改變后的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的DNA，可采用公知的定點誘變法、PCR法來合成。例如，通過cDNA或基因組DNA的限制酶處理，得到欲改變氨基酸序列的DNA片段，以此為模板，采用與所需的氨基酸序列的改變對應(yīng)的引物，實施定點誘變或PCR法，可以得到與所需的氨基酸序列的改變對應(yīng)的DNA片段。之后，將導(dǎo)入了該改變的DNA片段與編碼目標(biāo)酶的其他部分的DNA片段連接即可?；蛘撸瑸榱说玫骄幋a由縮短后的氨基酸序列構(gòu)成的酶的DNA，例如，將編碼比目標(biāo)氨基酸序列長的氨基酸序列、例如全長氨基酸序列的DNA通過所需的限制酶進行切割，當(dāng)?shù)玫降腄NA片段并非對目標(biāo)氨基酸序列整體進行編碼時，只要合成與缺失部分的氨基酸序列對應(yīng)的DNA片段，連接即可。將按照上述方法得到的基因用大腸桿菌或酵母中的基因表達(dá)體系進行表達(dá)，通過測定該大腸桿菌或酵母的提取液中3'位芳香族?；D(zhuǎn)移酶活性，可以確認(rèn)所得基因?qū)Ψ枷阕艴；D(zhuǎn)移酶進行編碼。另外，還可以合成編碼目標(biāo)氨基酸序列的DNA。本發(fā)明還包括下述情況，即利用含有芳香族?；D(zhuǎn)移酶基因的重組載體、特別是表達(dá)載體、以及從由該載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞中提取的芳香族?；D(zhuǎn)移酶。作為宿主，可以使用原核生物或真核生物。作為原核生物，可以使用以往公知的宿主細(xì)胞，如細(xì)菌，例如埃希氏菌(Escherichia)屬的細(xì)菌，如大腸桿菌(Escherichia coli),芽抱桿菌(Bacillus)屬微生物，例如枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)等。作為真核細(xì)胞，例如真核微生物，可優(yōu)選使用酵母或絲狀菌。作為酵母，可列舉釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)等酵母(Saccharomyces)屬酵母，作為絲狀菌，可列舉米曲霉(Aspergillus oryzae)、黑曲霉(Aspergillus niger)等曲霉(Aspergillus)屬微生物，以及青霉(Penicillium)屬微生物等。此外，動物細(xì)胞或植物細(xì)胞也可以作為宿主細(xì)胞使用，作為動物細(xì)胞，可使用小鼠、倉鼠、猴、人等的細(xì)胞系。另外，昆蟲細(xì)胞，例如蠶細(xì)胞，或蠶的成蟲自身也可作為宿主使用。 作為表達(dá)載體，含有取決于其應(yīng)導(dǎo)入的宿主的生物種類的啟動子和終止子等表達(dá)調(diào)控區(qū)、以及復(fù)制起點等。作為細(xì)菌用、特別是大腸桿菌中的表達(dá)載體的啟動子，可以使用以往公知的啟動子，例如trc啟動子、tac啟動子、Iac啟動子等。作為酵母用啟動子，可以使用3-磷酸甘油醛脫氫酶啟動子、PH05啟動子等，作為絲狀菌用啟動子，可以使用淀粉酶、trpC等的啟動子，但并不限于上述啟動子。另外，作為動物細(xì)胞用啟動子，可以使用病毒性啟動子，例如SV40早期啟動子、SV40晚期啟動子等。關(guān)于表達(dá)載體的制備，可以使用限制酶、連接酶等按照常法進行。表達(dá)載體對宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)化也可以按照以往公知的方法進行。作為植物的表達(dá)載體，例如，當(dāng)使用農(nóng)桿菌時，可以采用PBI121等雙元載體，當(dāng)使用基因槍時，可以采用PUC19等大腸桿菌載體。此外，將經(jīng)該表達(dá)載體轉(zhuǎn)化后的植物細(xì)胞例如用抗生素抗性基因等標(biāo)記基因進行篩選，在合適的植物激素等的條件下使其再分化，可得到轉(zhuǎn)化后的植物體。將按照上述方法轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞或轉(zhuǎn)化植物體進行培養(yǎng)或栽培，從培養(yǎng)物等按照常法、例如通過過濾、離心分離、細(xì)胞破碎、凝膠過濾色譜、離子交換色譜等，回收、精制花色苷3'位芳香族?；D(zhuǎn)移酶，該酶的利用也屬于本發(fā)明。以現(xiàn)有的技術(shù)水平，可以向植物導(dǎo)入基因，使該基因組成性或組織特異性表達(dá)，還可以通過反義法、共抑制法等抑制目標(biāo)基因的表達(dá)。作為可轉(zhuǎn)化的植物的例子，可列舉月季、菊花、康乃馨、金魚草、仙客來、蘭花、土耳其桔梗、小蒼蘭、大丁草花、唐菖蒲、絲石竹、伽藍(lán)菜、百合、天竺葵(Pelargonium)、Geranium、矮牽牛花、蝴蝶草、郁金香、稻、大麥、小麥、油菜子、馬鈴薯、西紅柿、楊樹、香蕉、藍(lán)桉、番薯、大豆、紫花苜蓿、羽扇豆、玉米、花椰菜等，但并不限于這些。因此，本發(fā)明所提供的花色苷3'位芳香族?；椒?，不限于使用來自龍膽的?；D(zhuǎn)移酶以及編碼該酶的龍膽的cDNA或基因、將該cDNA或基因在大腸桿菌等宿主中表達(dá)而得到的重組酶，也可以廣泛使用來自其他生物的花色苷3'位芳香族?；D(zhuǎn)移酶、編碼該酶的cDNA或基因、上述cDNA或基因在大腸桿菌等宿主中表達(dá)而得到的重組酶來代替。另外，在本說明書中包含花色苷的類黃酮的酰基轉(zhuǎn)移反應(yīng)中，作為?；墓w，列舉了 P-香豆酰CoA、咖啡酰CoA等CoA酯，但也可以利用P-香豆?；?、阿魏酰基或芥子?；?1-0-葡萄糖之類輕基肉桂?；?1-0-葡萄糖作為芳香族酰基的供體(Glassgen andSeitz, Planta 186:582, 1992)，因此，使用本發(fā)明所涉及的酶的應(yīng)用成為可能。實施例下面，基于實施例，詳細(xì)說明本發(fā)明。關(guān)于實驗的操作順序，只要無特殊說明，遵照 Sambrook 等的 Molecular Cloning (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)、PCT-JP96-00348、Fujiwara 等的報告(1997、1998)。實施例I.來自龍膽的?；D(zhuǎn)移酶cDNA在大腸桿菌中的表達(dá)和重組蛋白質(zhì)的精制從來自龍膽的酰基轉(zhuǎn)移酶cDNA的大腸桿菌表達(dá)用結(jié)構(gòu)pGeAT102 (Fujiwara etal.，Plant J.，16，421，1998中記載)通過NcoI/HindHI切割，將包含?；D(zhuǎn)移酶的編碼區(qū)域和3'非翻譯區(qū)域的片斷亞克隆到大腸桿菌表達(dá)載體pQE60(QIAGEN公司)的NcoI/HindIII，得到大腸桿菌表達(dá)用結(jié)構(gòu)pQE8。 將導(dǎo)入了 pQE8的大腸桿菌JM109株用SB培養(yǎng)基在37°C下培養(yǎng)至0D600nm=0. 8后，將培養(yǎng)溫度下降至15°C再培養(yǎng)I小時，添加IPTG使IPTG最終濃度為O. 1M，誘導(dǎo)龍膽?；D(zhuǎn)移酶基因的表達(dá)。將15°C、I小時培養(yǎng)、集菌后的菌體進行超聲波破壞，用于下述精制。將破壞后的菌體加入DE52 (Whatman)，通過含有150mM NaCl的25mMTris_HCl (pH7. 5)，回收徑直通過的組分。進而，通過硫酸銨鹽析，回收40 60%硫酸銨飽和組分，溶解于少量的20mMTris-HCl (pH7. 5)中，采用經(jīng) 20mM Tris-HCl (pH7. 5)平衡后的 S印hadexG-25 (Pharmacia 公司)，進行脫鹽。將其負(fù)載于DEAE-T0Y0PEAL (T0S0H 公司)后，利用從 20mMTris-HCl (ρΗ7· 5)到含有O. 5Μ NaCl的20mM Tris-HCl (pH7. 5)的直線濃度梯度進行洗脫，在約120 240mM NaCl的洗脫組分中發(fā)現(xiàn)對花翠素-3，5-二葡萄糖苷(DEL 3G-5G)具有5位芳香族酰基轉(zhuǎn)移酶活性。將活性組分對20mM Tris-HCl (pH7. 5)緩沖液透析后，負(fù)載于BlueSepharose (Pharmacia公司)。徑直通過Blue Sepharose的組分沒有活性,用含IM NaCl的20mM Tris-HCl (pH7. 5)對吸附的活性組分進行洗脫。然后，使該組分吸附于Phenyl Sepharose(Pharmacia公司),利用從含有40%飽和硫酸銨的20mM Tris-HCl (pH7. 5)到20mMTris_HCl (pH7. 5)的直線濃度梯度進行洗脫?；钚越M分被0%硫酸銨洗脫。將其對20mM Tris-HCl (pH7. 5)透析后，使其吸附于Dyematrix柱 Orange A(Amicon 公司)，用含 O. 3M NaCl 和 O. 5mM DTT 的 IOmMTris-HCl (ρΗ7· 5)洗脫。徑直通過的組分沒有活性，僅在吸附組分中發(fā)現(xiàn)活性，將其通過Centricon-10 (Amicon公司)濃縮。實施例2.重組釀基轉(zhuǎn)移酶的活件測定以圖I和圖2中所示的3種花翠素衍生物、即花翠素-3，5，3'-三葡萄糖苷(DEL 3G-5G-3' G)、花翠素-3-葡萄糖基-5-咖啡酰葡萄糖基-3 '-葡萄糖苷(DEL3G-5CafG-3' G)和花翠素-3-葡萄糖基-5-葡萄糖基-3 '-咖啡酰葡萄糖苷(DEL3G-5G-3' CafG)為底物，用實施例I中得到的重組酶，測定該酶活性。總量50 μ I的反應(yīng)液中，含有IOOmM磷酸鉀緩沖液(pH8. 5),0. 2mM咖啡酰CoA、250mM上述各底物、酶液5 μ 1，在30°C下，反應(yīng)15分鐘。添加與反應(yīng)液等量且含有O. 1%三氟乙酸(TFA)的90%乙腈水溶液，終止反應(yīng)。
為了分析反應(yīng)產(chǎn)物的經(jīng)時變化，用稀釋至25倍的酶液5 μ 1，以50 μ M、100 μ M或200μΜ的DEL 3G-5G-3' G為底物，在2. 5、5、10、20分鐘后停止反應(yīng)，對產(chǎn)物進行分析。關(guān)于反應(yīng)產(chǎn)物的分析，通過使用了 DE-41柱(4. 6X250mm、Shodex公司)的反相高效液相色譜(HPLC)進行。關(guān)于樣品的洗脫，用含有O. 5%TFA的20-50%直線濃度梯度的乙腈水溶液以O(shè). 6ml/min洗脫15分鐘，然后用50%的乙腈水溶液以O(shè). 6ml/min洗脫10分鐘，用Sro-MlOA (島津制作所制造)在250-600nm的波長下檢測。將已知樣品的HPLC洗脫時間和吸收光譜與產(chǎn)物的洗脫時間和吸收光譜進行比較，進行產(chǎn)物結(jié)構(gòu)的鑒定。上述3種化合物作為底物時的反應(yīng)結(jié)果顯示，重組?；D(zhuǎn)移酶與任一底物均反應(yīng)。以 250mM 的 DEL3G-5CafG-3 ' G 為底物時，94. 1% 轉(zhuǎn)變?yōu)?DEL3G_5CafG_3 ' CafG。以 250mM 的 DEL3G-5G-3 ' CafG 為底物時，95. 2% 轉(zhuǎn)變?yōu)?DEL3G_5CafG_3 ' CafG。以250mM的DEL3G-5G-3 ' G為底物時，7. 2%轉(zhuǎn)變?yōu)閮H5位與芳香族?；Y(jié)合的DEL3G-5CafG-3' G, 58. 7% 轉(zhuǎn)變?yōu)?DEL3G_5CafG_3' CafG,只有痕量(1% 以下)轉(zhuǎn)變?yōu)閮H 3'位與芳香族?；Y(jié)合的DEL3G-5G-3' CafG。用稀釋后的酶液，測定以DEL3G-5G-3' G為底物時反應(yīng)經(jīng)時變化，結(jié)果顯示 伴隨反應(yīng)時間的延長，DEL3G-5CafG-3 ' G和DEL3G_5CafG_3 ' CafG的生成量增加。而DEL3G-5G-3' CafG的生成量與其他兩種相比非常少，即使增加底物量、延長反應(yīng)時間，也僅檢測出極少量(圖3、圖4和圖5)。該結(jié)果與用未稀釋的酶液與DEL3G-5G-3' G反應(yīng)時的
結(jié)果一致。以上結(jié)果表明使來自龍膽的酰基轉(zhuǎn)移酶基因在大腸桿菌中表達(dá)而得到的重組蛋白質(zhì)，具有使芳香族?；D(zhuǎn)移到花色苷的5位和3'位兩個位置糖上的活性。即，根據(jù)以往的報道(Fujiwara et al.，Plant J.，16，421，1998)，該酶僅使芳香族?；禺愋赞D(zhuǎn)移到花色苷的5位，但本發(fā)明表明，該酶可使芳香族酰基轉(zhuǎn)移到3'位和5位兩個位置的糖上。此夕卜，從以DEL 3G-5G-3' G為底物時的反應(yīng)產(chǎn)物分析，可認(rèn)為芳香族?；扰c5位葡萄糖結(jié)合再與3'位葡萄糖結(jié)合的可能性高。實施例3.來自龍膽的芳香族酰基轉(zhuǎn)移酶的精制已證明使來自龍膽的芳香族?；D(zhuǎn)移酶cDNA在大腸桿菌中表達(dá)而得到的酶，具有花色苷5位和3'位葡萄糖的芳香族?；D(zhuǎn)移活性(實施例2)，但對于龍膽花瓣中存在的天然酶，為了確認(rèn)單一酶具有5位芳香族?；D(zhuǎn)移酶活性和3'位芳香族酰基轉(zhuǎn)移酶活性，從龍膽花瓣進行該酶的精制。在一系列的精制中，與實施例2同樣，對各柱色譜的洗脫組分分別測定以DEL 3G-5G為底物時5位?；D(zhuǎn)移酶活性和以DEL 3G-5G-3' G為底物時5位、3'位?；D(zhuǎn)移酶活性。根據(jù)對龍膽5位芳香族酰基轉(zhuǎn)移酶進行了精制的Fujiwara等的報告(Fujiwaraet al.，Eur. J. Biochem. 249，45，1997)，從約IOOg龍膽花瓣的破碎提取物中得到40-70%飽和硫酸銨的鹽析組分。將其通過經(jīng)含有10 μ M對氨基苯甲基磺酰氟(APMSF)、lmM DTT的20mMTris-HCl (pH 7. O)(以下記為 Tris 緩沖液)平衡后的 SephadexG-25 (Pharmacia 公司)脫鹽，然后負(fù)載于經(jīng)Tr i s緩沖液平衡后的MONO Q (Pharmacia公司)。用Tris緩沖液將未吸附組分洗凈后，以流速5ml/min使含有O O. 5M NaCl的Tris緩沖液流過，對吸附組分進行20min洗脫。芳香族?；D(zhuǎn)移活性存在于被O. 2 O. 42M NaCl洗脫的組分中。將其負(fù)載于HiTrap Blue (Pharmacia公司)，用Tris緩沖液充分洗凈后，用含O.9M NaCl的Tris緩沖液洗脫吸附組分。吸附組分具有活性。然后，將活性組分負(fù)載于DEAE-Sepharose(Pharmacia公司)。用Tris緩沖液充分洗凈后，以O(shè). 5ml/min使含有O
O.5M NaCl的Tris緩沖液流過，對吸附組分進行60min洗脫。在被含有O. 22 O. 3mM NaCl的Tris緩沖液洗脫的組分中發(fā)現(xiàn)了活性。然后,將活性組分用Centricon 30 (Amicon公司)濃縮后，負(fù)載于Dyematrix柱Red (Amicon公司)。用Tris緩沖液將未吸附組分洗凈后，用含I. 5M KCl的Tris緩沖液將吸附的組分洗脫。利用SDS-PAGE對其進行解析，結(jié)果顯示在?；D(zhuǎn)移酶的推定分子量52kDa附近，僅檢測出單一條帶。在一系列的精制中，對各柱色譜的洗脫組分，測定以DEL 3G-5G為底物時5位酰基轉(zhuǎn)移酶活性和以DEL 3G-5G-3' G為底物時5位、3'位?；D(zhuǎn)移酶活性，結(jié)果顯示，兩活性的活性最強的組分完全一致。用Dyematrix柱Red上吸附的活性組分，與實施例2同樣，測定對 3 種底物、即 DEL 3G-5G-3' G, DEL 3G-5CafG-3/ G 和 DEL 3G-5G-3' CafG 的活性，結(jié)果顯示與任一底物均反應(yīng)，呈現(xiàn)與實施例2同樣的反應(yīng)特性。將Dyematrix柱Red上吸附的活性組分通過SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，基 于公知的方法(Towbin et al. Proc. Natl. Acad. Sci, 76, 4350, 1979),將分離后的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜Hybond-ECL (Amersham公司)后，用龍膽的花色苷5位酰基轉(zhuǎn)移酶的特異性抗體(Fujiwara et al. , Eur. J. Biochem. 249, 45, 1997),通過 Western 法檢測，結(jié)果觀察到一條明顯的條帶(圖6)。以上結(jié)果表明，龍膽花瓣中存在的花色苷3'位芳香族?；D(zhuǎn)移活性和花色苷5位芳香族酰基轉(zhuǎn)移活性均來自單一的蛋白質(zhì)。實施例4.通過龍膽的釀基轉(zhuǎn)移酶的花色苷的穩(wěn)定化、藍(lán)化已有關(guān)于 DEL 3G-5G-3 ' G、DEL 3G-5CafG-3 ; G、DEL 3G-5G-3 ' CafG、DEL3G-5CafG-3' CafG的相對穩(wěn)定性的報道。即，在pH6. 5的水溶液中，DEL 3G-5CafG-3' CafG最穩(wěn)定且難退色，其次，穩(wěn)定順序依次為DEL 3G-5G-3 ' CafG、DEL 3G-5CafG-3 ' G、DEL3G-5G-3 ' G (Yoshida et al. , Phytochemistry 54,85,2000)。另外，關(guān)于最大吸收，DEL3G-5CafG-3 ' CafG 波長最長，其次為 DEL 3G-5G-3 ' CafG、DEL3G_5CafG_3 ' G、DEL3G-5G-3' G0 即，看上去最藍(lán)的是 DEL3G-5CafG-3' CafG，其次是 DEL 3G-5G-3 ' CafG(Yoshida et al. , Phytochemistry 54,85,2000)。為了推測將來自龍膽的花色苷5，3'位芳香族酰基轉(zhuǎn)移酶基因?qū)朐录?、月季花瓣中產(chǎn)生DEL 3G-5CafG-3^ CafG時的花色，對月季(品種Medeo)花瓣的榨汁液中的精制色素的發(fā)色進行分析。作為精制色素，使用DEL 3G-5CafG-3' CafG以及作為比較對照的DEL36-56、花青素-3，5-二葡萄糖苷(0￥4 3G-5G)、花葵素-3，5-二葡萄糖苷(PEL3G-5G)、二甲花翠素-3，5-二葡萄糖苷(MAL 3G-5G)。將_80°C下冷凍I小時以上的Medeo花瓣約20g用家庭用大蒜榨汁機榨汁，以IOOOrpm離心lmin，除去花瓣殘渣，得到上清液，作為榨汁液。向榨汁液Iml中添加上述精制色素的50mM DMSO溶液20 μ 1，靜置10分鐘后，用分光測色計UV-2500PC (島津制作所制造)測定380-780nm的吸收光譜和透過光譜。將透過光譜換算成CIE ΙΛΛ/表色系(JISZ8729)。關(guān)于英國皇家園藝學(xué)會色譜標(biāo)準(zhǔn)(RHSCC)編號，基于上述儀器測定所得色彩值(CIE IZaVi表色系)，用色彩分類系統(tǒng)Version〗. I. I (株式會社日本綜合研究所、日本；日本特開2002-016935)，進行近似色的核對。使用該系統(tǒng)，能客觀地選擇近似的RHSCC編號。榨汁液中添加的色素的最終濃度，與月季花瓣液泡中的平均花色苷濃度近似。但是，由于3G-5CafG-3' CafG的吸光度過高，所以4倍稀釋后測定。另外，Medeo是具有月季園藝品種的平均花瓣pH值(pH4. 38)的品種。如圖7所示，上述5種精制色素中，DEL3G-5CafG-3' CafG在月季花瓣榨汁液中顯示出最大的最大吸收光譜?；谟赏高^光譜換算的LiW值，用RHSCC(英國皇家園藝學(xué)會色譜標(biāo)準(zhǔn))求近似色，為89A，如圖7所示，在5種精制色素中，顏色最藍(lán)。從該結(jié)果可知，例如在月季花瓣中使花色苷_5，3'位芳香族酰基轉(zhuǎn)移酶基因與F3, 5’H基因(W02004/020637)以及:V位糖轉(zhuǎn)移酶基因(W001/92509)—起表達(dá)，可在月季花瓣中產(chǎn)生DEL3G-5CafG-3' CafG，從而可以培育出呈現(xiàn)藍(lán)色的月季花。同樣，也可以在康乃馨、菊花、矮牽牛花、美人櫻、銀杯草、百合等中培育出藍(lán)色花的品種。實施例5.從龍膽近緣種分離花色苷5，3'位芳香族?；D(zhuǎn)移酶同源物 龍膽屬(Gentiana)中，除了龍膽，還存在蛾眉山龍膽、屋久島龍膽等各種近緣種。嘗試通過PCR從這些龍膽近緣種中獲得5，3'位芳香族?；D(zhuǎn)移酶同源物。已知來自龍膽的5，3'位芳香族?；D(zhuǎn)移酶基因不含內(nèi)含子，因此，以從近緣種的葉子提取的基因組DNA為模板，用5，3'位芳香族?；D(zhuǎn)移酶基因的特異性引物進行PCR。關(guān)于基因組DNA的提取，用QIAGEN公司的DNeasy，按照制造廠家推薦的方法進行。5，3,位芳香族?；D(zhuǎn)移酶基因的特異性引物GAT4-Met-F和GAT4-B具有如下序列，將其作為引物，進行PCR，使包含整個編碼區(qū)域的全長cDNA得到擴增。PCR的反應(yīng)條件如下所示。引物的序列GAT4-Met-F TCA TTA TGG AGC AAA TCC AAA (序列號1)GAT4-B CAT GTC AGG TGT GAG GTT CAA C (序列號2)PCR 條件變性反應(yīng) 94°C 5分、I循環(huán)擴增反應(yīng) 94°C I分、55°C I分30秒、72°C 3分、30循環(huán)延伸反應(yīng) 72°C 7分、I循環(huán)通過上述PCR,在屋久島龍膽、Ochroleuca、Wutariensis這3種中，所期待的I. 5kb左右的條帶得到擴增。將其回收，克隆到pCRII-TOPO (Invitrogen)，確定堿基序列。從各種中得到的擴增片段的核苷酸序列以及對應(yīng)的氨基酸序列見序列表。屋久島龍膽序列號3和4Ochroleuca 和 Wutariensis 序列號5 和 6從Ochroleuca和Wutariensis得到的片段編碼同一氨基酸序列。關(guān)于與最先從龍膽得到的5,3'位芳香族?；D(zhuǎn)移酶的同一'丨生，來自屋久島龍膽的為95%,來自O(shè)chroleuca的和來自Wutariensis的分別為90%。從上述較高的同一性可認(rèn)為它們是花色苷5，3 ^位芳香族?；D(zhuǎn)移酶的同源物。實施例6.龍膽的花色苷5,3'位芳香族釀基轉(zhuǎn)移酶在銀杯草中的表汰將龍膽的5，3'位芳香族酰基轉(zhuǎn)移酶基因與同樣來自龍膽的3'位糖轉(zhuǎn)移酶基因、來自三色堇的F 3' 5’H基因一起導(dǎo)入銀杯草。由此得到的轉(zhuǎn)化體中，首先，通過龍膽:V位糖轉(zhuǎn)移酶的作用，DEL 3G-5G的:T位發(fā)生糖苷化，生成DEL 3G-5G-3 ; G，通過龍膽花色苷5，3'位芳香族酰基轉(zhuǎn)移酶對DEL 3G-5G-3' G的作用，可期待生成最終產(chǎn)物Gentiodelphin (DEL 3G-5CafG-3; CafG)。
表達(dá)用結(jié)構(gòu)pSPB1536通過在植物表達(dá)用雙元載體(van EngelenFA et al. (1995)Transgenic Res4:288-290)的HindIII和EcoRI位點導(dǎo)入3'位糖轉(zhuǎn)移酶表達(dá)盒、在PacI位點導(dǎo)入來自三色堇的F3' 5’H的表達(dá)盒、在AscI位點導(dǎo)入5，3'位芳香族酰基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)盒來制備。任一表達(dá)盒均受來自花椰菜花葉病毒的35S啟動子控制，各自的結(jié)構(gòu)基因的下游具有來自農(nóng)桿菌的胭脂堿合成酶基因的終止子序列。關(guān)于向銀杯草中的基因?qū)?，按田中等的報?Tanaka et al. (2005)Plant Cell Tiss. Org. Cult. 80:1-24)所述的方法進行。通過RT-PCR確認(rèn)在得到的銀杯草轉(zhuǎn)化體中3種導(dǎo)入基因(龍膽的5，3'位芳香族?；D(zhuǎn)移酶基因、龍膽的3'位糖轉(zhuǎn)移酶基因、三色堇的F3' 5’H基因)的表達(dá)。對已確認(rèn)這3種基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的系統(tǒng),根據(jù)水谷等的報告(Fukuchi-Mizutani et al. (2003) PlantPhysioll32:1652-1663)中所述的方法，進行花瓣的色素分析，但任一系統(tǒng)中均未檢測出所期待的最終產(chǎn)物Gentiodelphin。另一方面，按照藤原等的報告(Fujiwaraet al. (1997) Eur JBiochem249:45-51)中所述的方法，從3種導(dǎo)入基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物已確認(rèn)的轉(zhuǎn)化體的花瓣中提取粗酶液。將其作 為酶液使用，與實施例2同樣，以DEL3G-5G-3' G為底物，測定體外的5，3'位芳香族酰基轉(zhuǎn)移酶活性，確認(rèn)了 Gentiodelphin的生成。另一方面，當(dāng)使用作為對照的來自非重組銀杯草的粗酶時，未檢測出Gentiodelphin。該結(jié)果表明，重組銀杯草具有5, 3'位芳香族?；D(zhuǎn)移酶的活性，即具有使芳香族?；D(zhuǎn)移到底物DEL3G-5G-3' G的5位和3'位上的活性。但是，使用同一銀杯草轉(zhuǎn)化體的粗酶液，按照水谷等的報告(Fukuchi-Mizutaniet al. (2003)Plant Physiol 132:1652-1663)中所述的方法，測定體外的Y位糖轉(zhuǎn)移酶的活性，并未檢測出3'位糖轉(zhuǎn)移酶活性。以上的結(jié)果證實在銀杯草轉(zhuǎn)化體的細(xì)胞內(nèi)，存在具有5，3,位芳香族酰基轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)。然而未在轉(zhuǎn)化體的花瓣中檢測出所期待的Gentiodelphin,其原因可認(rèn)為是在銀杯草的細(xì)胞內(nèi)，本應(yīng)在5,3'位芳香族酰基轉(zhuǎn)移酶發(fā)揮作用的前一階段發(fā)揮作用的3'位糖轉(zhuǎn)移酶的蛋白質(zhì)未被合成，或即使合成也沒有發(fā)揮作用。綜上所述，本發(fā)明表明，使來自龍膽的芳香族?；D(zhuǎn)移酶基因在大腸桿菌中表達(dá)而得到的重組芳香族?；D(zhuǎn)移酶，不僅具有使芳香族酰基轉(zhuǎn)移到花翠苷5位糖上的活性，同時還具有使芳香族?；D(zhuǎn)移到3,位糖上的活性。此外，從龍膽花瓣精制的天然花色苷5位芳香族酰基轉(zhuǎn)移酶也同時具有使芳香族?；D(zhuǎn)移到3'位糖上的活性，即，與迄今已知的花色苷芳香族?；D(zhuǎn)移酶不同，單一酶使芳香族?；D(zhuǎn)移到花色苷5位和3'位兩個位置的糖上。另外，使該基因在異種植物中表達(dá)，可獲得5，3,位芳香族?；D(zhuǎn)移酶活性。—般認(rèn)為，與5位的芳香族酰基相比，3'位的芳香族?；兄诨ㄉ盏姆€(wěn)定化和藍(lán)化，更理想的情況為，具有包括3'位在內(nèi)的多個位置的糖-?；鶄?cè)鏈。因此，如本發(fā)明所述，利用使芳香族酰基轉(zhuǎn)移到5位和3'位兩個位置的5位，3'位芳香族?；D(zhuǎn)移酶，進行花色苷糖苷5位和3,位的芳香族酰化，從而可以制備更穩(wěn)定更藍(lán)的花色苷。此外，使編碼該酶的基因與其他必要的花色苷合成系統(tǒng)或花色苷修飾基因一起在植物體中表達(dá)，可以使以花色苷為主的花色更穩(wěn)定、更藍(lán)。本發(fā)明包括如下內(nèi)容I.花色苷3,位的?；椒?，其利用使芳香族酰基轉(zhuǎn)移到花色苷3,位糖上的酶或編碼該酶的基因。2.花色苷的穩(wěn)定化方法，其利用使芳香族?；D(zhuǎn)移到花色苷3,位糖上的酶或編碼該酶的基因。3.花色苷的藍(lán)化方法，其利用使芳香族?；D(zhuǎn)移到花色苷3,位糖上的酶或編碼該酶的基因。4.目標(biāo)色素的酰化方法，其使編碼花色苷3'位芳香族?；D(zhuǎn)移酶的基因在植物中表達(dá)，在該植物體內(nèi)將目標(biāo)色素酰化。5.目標(biāo)色素的穩(wěn)定化方法，其將編碼花色苷3'位芳香族?；D(zhuǎn)移酶的基因?qū)胫参铮谠撝参矬w內(nèi)目標(biāo)色素?；?，從而使該色素穩(wěn)定化。6.目標(biāo)色素的藍(lán)化方法，其將編碼花色苷3'位芳香族?；D(zhuǎn)移酶的基因?qū)胫参铮谠撝参矬w內(nèi)目標(biāo)色素?；?，從而使該色素藍(lán)化。7.通過項目4 6任一項所述的方法得到的植物體、該植物體的營養(yǎng)繁殖體或種子、或與該植物體具有同一性質(zhì)的該植物體后代的植物體、該植物體的營養(yǎng)繁殖體或種子。8.在花色苷的多個位置的糖上結(jié)合芳香族?；姆椒?，其特征在于，利用具有使芳香族酰基轉(zhuǎn)移到花色苷多個位置糖上的活性的單一酶或編碼該酶的基因。9.花色苷的穩(wěn)定化方法，其特征在于，利用具有使芳香族酰基轉(zhuǎn)移到花色苷多個位置糖上的活性的單一酶或編碼該酶的基因。10.花色苷的藍(lán)化方法，其特征在于，利用具有使芳香族?；D(zhuǎn)移到花色苷多個位置糖上的活性的單一酶或編碼該酶的基因。11.根據(jù)項目8 10任一項所述的方法，其中，所述多個位置之一是花色苷的3'位的糖。12.目標(biāo)色素的?；椒ǎ涫咕哂惺狗枷阕艴；D(zhuǎn)移到花色苷多個位置糖上的活性的單一酶或編碼該酶的基因在植物中表達(dá)，在該植物體內(nèi)將目標(biāo)色素?；?。13.目標(biāo)色素的穩(wěn)定化方法，其將具有使芳香族?；D(zhuǎn)移到花色苷多個位置糖上的活性的單一酶或編碼該酶的基因?qū)胫参?，在該植物體內(nèi)目標(biāo)色素?；?，從而使該色素
穩(wěn)定化。14.目標(biāo)色素的藍(lán)化方法，其將具有使芳香族?；D(zhuǎn)移到花色苷多個位置糖上的活性的單一酶或編碼該酶的基因?qū)胫参?，在該植物體內(nèi)目標(biāo)色素?；瑥亩乖撋厮{(lán)化。15.根據(jù)項目12 14任一項所述的方法，其中，所述多個位置之一是花色苷的 位的糖。16.通過項目12 15任一項所述的方法得到的植物體、該植物體的營養(yǎng)繁殖體或種子、或與該植物體具有同一性質(zhì)的該植物體后代的植物體、該植物體的營養(yǎng)繁殖體或種 子。17.基因，其是編碼具有序列號4或6所述氨基酸序列且具有使芳香族酰基轉(zhuǎn)移到花色苷3'位糖上的活性的蛋白質(zhì)的基因、或是編碼與該氨基酸序列有70%以上的序列同一性且具有使芳香族?；D(zhuǎn)移到花色苷3,位糖上的活性的蛋白質(zhì)的基因、或是與序列號3或5所述核苷酸序列有70%以上同一性且編碼具有使芳香族?；D(zhuǎn)移到花色苷3'位糖上的活性的蛋白質(zhì)的基因。
18.基因，其是編碼具有序列號4或6所述氨基酸序列且具有使芳香族?；D(zhuǎn)移到花色苷多個位置糖上的活性的蛋白質(zhì)的基因、或是編碼與該氨基酸序列有70%以上的序列同一性且具有使芳香族?；D(zhuǎn)移到花色苷多個位置糖上的活性的蛋白質(zhì)的基因、或是與序列號3或5所述核苷酸序列有70%以上同一性且編碼具有使芳香族?；D(zhuǎn)移到花色苷多個位置糖上的活性的蛋白質(zhì)的基因。19.根據(jù)項目18所述的基因，其中，所述多個位置之一是花色苷的3'位的糖。20.載體，其包含項目17 19任一項所述的基因。21.宿主，其是由項目20所述的載體轉(zhuǎn)化的宿主。22.蛋白質(zhì)，其是由項目17 19任一項所述的基因所編碼的蛋白質(zhì)。23.蛋白質(zhì)的制造方法，其特征在于，培養(yǎng)項目21所述的宿主或使其生長發(fā)育，然 后從該宿主獲取具有將糖轉(zhuǎn)移到類黃酮3'位上的活性的蛋白質(zhì)。24.導(dǎo)入了項目17 19任一項所述的基因的植物或與其具有相同性質(zhì)的該植物的后代或它們的組織。25.項目24所述植物的切花或與其具有相同性質(zhì)的該植物后代的切花。26.花色苷Y位的?；椒ǎ涮卣髟谟?，利用項目17 19任一項所述的基因。27.花色苷的穩(wěn)定化方法，其特征在于，利用項目17 19任一項所述的基因。28.花色苷的藍(lán)化方法，其特征在于，利用項目17 19任一項所述的基因。29.目標(biāo)色素的?；椒?，其使項目17 19任一項所述的基因在植物中表達(dá)，在該植物體內(nèi)將目標(biāo)色素?；?0.目標(biāo)色素的穩(wěn)定化方法，其將項目17 19任一項所述的基因?qū)胫参?，在該植物體內(nèi)目標(biāo)色素酰化，從而使該色素穩(wěn)定化。31.目標(biāo)色素的藍(lán)化方法，其將項目17 19任一項所述的基因?qū)胫参?，在該植物體內(nèi)目標(biāo)色素?；?，從而使該色素藍(lán)化。32.在花色苷的多個位置的糖上結(jié)合芳香族酰基的方法，其特征在于，利用項目17 19任一項所述的基因。33.根據(jù)項目32所述的方法，其中，所述多個位置之一是花色苷的3'位的糖。
權(quán)利要求
1.在花色苷的3,位和5位的糖上加入芳香族?；姆椒?，該方法包括 使用編碼包含示于SEQ ID NO :4或6的氨基酸序列的、且具有使芳香族?；D(zhuǎn)移到花色苷的3'位和5位的糖上的活性的蛋白質(zhì)的基因，或編碼包含具有與示于SEQ ID N0:4或6的氨基酸序列90%以上的序列一致性、且具有使芳香族酰基轉(zhuǎn)移到花色苷的3'位和5位的糖上的活性蛋白質(zhì)的基因。
全文摘要
本發(fā)明涉及花色苷3′位的?；椒ǎ淅檬狗枷阕艴；D(zhuǎn)移到花色苷3′位糖上的酶或編碼該酶的基因。
文檔編號C12P19/60GK102864195SQ20121030251
公開日2013年1月9日 申請日期2005年10月28日 優(yōu)先權(quán)日2004年10月29日
發(fā)明者田中良和, 勝元幸久, 水谷正子, 福井祐子, 戶上純一 申請人:三得利控股株式會社