專利名稱：檢測及鑒別分枝桿菌的mPCR-DHPLC引物和方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域，具體地，涉及一種同步檢測分枝桿菌感染及鑒別結核分枝桿菌復合群、副結核分枝桿菌和鳥分枝桿菌的五重mPCR-DHPLC方法。
背景技術：
分枝桿菌屬(Mycobacterium),除結核分枝桿菌復合群(包括結核分枝桿菌、牛分枝桿菌、非洲分枝桿菌、田鼠分枝桿菌)和麻風分枝桿菌外，統稱為非結核分枝桿菌。據目前所知，自然界中有致病性和非致病分枝桿菌共200多種。結核病是威脅人類及動物健康的重大傳染病。世界衛生組織(WHO)專門發布了全球結核控制戰略，并把每年的3月24號定為世界防治結核病日。結核分枝桿菌復合群(Mycobacterium tuberculosis complex,MTC)是人及哺乳動物的結核病原菌,包括結核分枝桿菌(又稱人型結核分枝桿菌，Mycobacterium tuberculosis, M. tuberculosis),牛分枝桿菌(牛型結核分枝桿菌，Mycobacterium bovis, M. bovis),卡介苗 BCG (Mycobacteriumbovis BCG, BCG),非洲分枝桿菌(Mycobacterium africanum, M. africanum)和田鼠分枝桿菌(Mycobacterium microti, M. microti)。其中，結核分枝桿菌、牛分枝桿菌為主要的人畜結核致病菌。與結核分枝桿菌復合群對應的是各種非結核分枝桿菌，目前已發現上百種，廣泛存在于土壤、環境、動物中。臨床上，各種非結核分枝桿菌感染患者的臨床癥狀及病理變化與MTC引起的結核病極為相似，但多數非結核分枝桿菌對抗結核藥物有天然耐藥性；因此，鑒別結核分枝桿菌復合群與非結核分枝桿菌感染在臨床診療中就有著非常重要的作用。由于非結核分枝桿菌感染可造成結核菌素皮內變態反應或血清學檢測假陽性，因此準確鑒別結核分枝桿菌復合群與非結核分枝桿菌感染對動物結核病確診也非常重要。鳥分枝桿菌(Mycobacterium avium)是人型結核分枝桿菌的近支抗酸菌,在結核分枝桿菌以外的抗酸菌中是從人分離頻度最高的菌種。鳥分枝桿菌是鳥類和豬等家畜的病原，也可感染人。它是一種機會性細菌，在AIDS病人細菌感染合并癥中占第一位；在抗酸菌中對化療藥物耐藥性最強，并廣泛存在于天然土壤和水中。副結核分枝桿菌(Mycobacterium paratuberculosis)是引起牛、羊、羊5它等動物副結核病的病原。副結核病自1895年首次被報道后，現已廣泛流行于世界各國。2002年韓國某地區調查研究顯示162個奶牛場中存在副結核病流行；在我國該病分布廣泛，感染率在近年有上升趨勢，部分地區甚至達44. 8%，嚴重危害著畜牧業發展。目前副結核病尚無特效治療方法或藥物。對于副結核病的控制常采用檢測、隔離、淘汰病畜等方法。2000年第四次全國結核病流行病學抽樣調查報告顯示，我國現有活動性肺結核患者451萬，菌陽性肺結核患者196萬。分枝桿菌培養陽性者中，結核分枝桿菌占86. 4%，牛結核分枝桿菌占2. 5%,非結核分枝桿菌占11. 1%。而1990年第三次全國結核病流調時非結核分枝桿菌僅占4. 9%,由此可見,非結核分枝桿菌的比率較前明顯增加。非結核分枝桿菌患者對大多數一線抗結核藥物耐藥，采用目前標準的化療方案治療無效。傳統的分枝桿菌菌種鑒定和藥敏實驗方法建立在培養基礎上，煩瑣、費時，需I 2月時間，不能滿足臨床開展早期有效化療的需要，使非結核分枝桿菌患者經長期規則化療而療效不佳，療程延長，成為難治、復治患者，細菌可能在局部播散。因此，分枝桿菌的快速鑒定對結核病的早期診斷、鑒別診斷、有效化療和控制傳播都有極其重要的意義。目前國內外用于診斷分枝桿菌的檢驗方法，大體上可分為3類第一類是細菌學檢驗方法，如染色鏡檢、細菌培養和動物接種等；第二類是采用免疫學方法檢測結核菌的特異性抗體，如皮內變態反應、酶聯免疫吸附實驗(ELISA)和補體結合實驗(CF)方法等；第三類是采用分子生物學檢驗方法，如PCR-RFLP、PCR-核酸探針、多重PCR等。由于分枝桿菌生長緩慢，細菌分離培養周期長(常需數周時間)，傳統的細菌學檢查方法難于適應進出境檢驗檢疫快速通關需求，也不利于疾病臨床診療。皮內變態反應是世界動物衛生組織(OIE)推薦的牛結核病診斷方法，也是目前在進出境動物檢疫、牛結核病疾病防控、根除等方面常采用的方法，但由于試劑質量以及非典型分枝桿菌的干擾等原因，常造成非特異性反應。ELISA和CF方法等免疫學方法在特異性方面尚存在爭議，國內目前尚缺乏可靠的免疫學診斷試劑。隨著分子生物學技術的發展，國內外眾多實驗室開展了結核、副結核PCR方法研究，但檢測方法和試劑盒缺乏規范化、標準化是影響PCR結果準確性 的關鍵。世界衛生組織于2006年10月發表報告指出，世界迫切需要投資研究更有效和費用更低的結核病診斷方法，盡早發現病情盡早治療，以減少這種疾病對人類、特別是對發展中國家人口的危害。

發明內容
本發明的主要目的在于，提供一組檢測分枝桿菌的核苷酸序列(分枝桿菌通用型檢測引物)，一組鑒別多種致病分枝桿菌群(種)的核苷酸序列。本發明的又一目的在于，提供一種同步檢測分枝桿菌及鑒別多種重要致病分枝桿菌群(種)的方法。為實現上述目的，本發明采用以下技術方案一組檢測及鑒別分枝桿菌的mPCR-DHPLC方法中使用的引物，其特征在于，其組成為檢測分枝桿菌的引物對，上游引物和下游引物的核苷酸序列分別如序列表SEQ ID No. I和SEQ ID No. 2所示；鑒別結核分枝桿菌復合群的兩組引物對，其中一對的上游引物和下游引物的核苷酸序列分別如SEQ ID No. 4和SEQ ID No. 5所示；另一對的上游引物和下游引物的核苷酸序列分別如SEQID No. 7和SEQ ID No. 8所示；鑒別副結核分枝桿菌的引物對，上游引物和下游引物的核苷酸序列分別如SEQ ID No. 10和SEQ ID No. 11所示；鑒別鳥分枝桿菌的引物對，上游引物和下游引物的核苷酸序列分別如SEQ ID No. 13和SEQ IDNo. 14所示。一組檢測及鑒別分枝桿菌的mPCR-DHPLC方法中使用的核酸，其特征在于，該組核酸包括核苷酸序列分別如序列表SEQ ID No. I和SEQ ID No. 2所示的檢測分枝桿菌的引物對和作為陽性對照的序列如SEQ ID No. 3所示的PCR擴增產物；核苷酸序列分別如序列表SEQ ID No. 4和SEQ ID No. 5、SEQ ID No. 7和SEQ ID No. 8所示的鑒別結核分枝桿菌復合群的兩組引物對和作為陽性對照的序列如SEQ ID No. 6,SEQ ID No. 9所示的PCR擴增產物；核苷酸序列分別如序列表SEQ ID No. 10和SEQ ID No. 11所示的副結核分枝桿菌的引物對和作為陽性對照的序列如SEQ ID No. 12所示的PCR擴增產物；核苷酸序列分別如序列表SEQ ID No. 13和SEQ ID No. 14所示的鑒別鳥分枝桿菌的引物對和作為陽性對照的序列如SEQ ID No. 15所示的PCR擴增產物。一種檢測及鑒別分枝桿菌的mPCR-DHPLC的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括PCR 緩沖液；檢測分枝桿菌的上游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No. I所示；檢測分枝桿菌的下游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No. 2所示；鑒別結核分枝桿菌復合群的第一上游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ IDNo. 4所示；

鑒別結核分枝桿菌復合群的第一下游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ IDNo. 5所示；鑒別結核分枝桿菌復合群的第二上游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ IDNo. 7所示；鑒別結核分枝桿菌復合群的第二下游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ IDNo. 8所示；鑒別副結核分枝桿菌的上游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No. 10所示；鑒別副結核分枝桿菌的下游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No. 10和SEQ IDNo. 11所示；鑒別鳥分枝桿菌的上游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No. 13所示；鑒別鳥分枝桿菌的下游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No. 14所示；dNTP ；MgCl2 ；Pfu快速高保真聚合酶；雙蒸水； 陰性對照滅菌生理鹽水；陽性對照攜帶有分枝桿菌屬特異性16s rRNA的序列、結核分枝桿菌復合群的特異性序列IS6110、IS1081、副結核分枝桿菌的特異性序列f57基因和鳥分枝桿菌的特異性序列IS1245的質粒DNA，所述特異序列依次如序列表SEQID No. 3、SEQ ID No. 5、SEQ IDNo. 9,SEQ ID No. 12和SEQ ID No. 15所示；所述質?？梢允潜绢I域內任意的可用質粒載體。一種檢測及鑒別分枝桿菌的mPCR-DHPLC方法(I)采集樣品并提取核酸本發明可檢測細菌培養液、動物活體采集的樣品如血液、奶液、痰液和糞便等，以及通過剖檢采集的組織樣品，如淋巴結等；采集到的樣品通過蛋白酶K消化、高溫裂解之后用氯仿抽提提取核酸。(2)在反應管中分別加入反應液和核酸，記錄樣品編號和對應管號，放入PCR儀中擴增；其中，優選的PCR反應體系如下
權利要求
1.一組檢測及鑒別分枝桿菌的mPCR-DHPLC方法中使用的引物，其特征在于，其組成為 檢測分枝桿菌的引物對，上游引物和下游引物的核苷酸序列分別如序列表SEQ IDNo. I 和 SEQ ID No. 2 所示； 鑒別結核分枝桿菌復合群的兩組引物對，其中一對的上游引物和下游引物的核苷酸序列分別如SEQ ID No. 4和SEQ ID No. 5所示；另一對的上游引物和下游引物的核苷酸序列分別如 SEQ ID No. 7 和 SEQ ID No. 8 所示； 鑒別副結核分枝桿菌的引物對，上游引物和下游引物的核苷酸序列分別如SEQ IDNo. 10 和 SEQ ID No. 11 所示； 鑒別鳥分枝桿菌的引物對，上游引物和下游引物的核苷酸序列分別如SEQID No. 13和SEQ ID No. 14 所示。
2.一組檢測及鑒別分枝桿菌的mPCR-DHPLC方法中使用的核酸，其特征在于，該組核酸的組成為 核苷酸序列分別如序列表SEQ ID No. I和SEQ ID No. 2所示的檢測分枝桿菌的引物對和作為陽性對照的序列如SEQ ID No. 3所示的PCR擴增產物； 核苷酸序列分別如序列表SEQ ID No. 4和SEQ ID No. 5,SEQ ID No. 7和SEQ ID No. 8所示的鑒別結核分枝桿菌復合群的兩組引物對和作為陽性對照的序列如SEQ ID No. 6,SEQID No. 9所示的PCR擴增產物； 核苷酸序列分別如序列表SEQ ID No. 10和SEQ ID No. 11所示的副結核分枝桿菌的引物對和作為陽性對照的序列如SEQ ID No. 12所示的PCR擴增產物； 核苷酸序列分別如序列表SEQ ID No. 13和SEQ ID No. 14所示的鑒別鳥分枝桿菌的引物對和作為陽性對照的序列如SEQ ID No. 15所示的PCR擴增產物。
3.—種檢測及鑒別分枝桿菌的mPCR-DHPLC的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括 PCR緩沖液； 檢測分枝桿菌的上游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No. I所示； 檢測分枝桿菌的下游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No. 2所示； 鑒別結核分枝桿菌復合群的第一上游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ IDNo. 4所示； 鑒別結核分枝桿菌復合群的第一下游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ IDNo. 5所示； 鑒別結核分枝桿菌復合群的第二上游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ IDNo. 7所示； 鑒別結核分枝桿菌復合群的第二下游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ IDNo. 8所示； 鑒別副結核分枝桿菌的上游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No. 10所示； 鑒別副結核分枝桿菌的下游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No. 10和SEQ IDNo. 11所示； 鑒別鳥分枝桿菌的上游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No. 13所示； 鑒別鳥分枝桿菌的下游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No. 14所示； dNTP ； MgCl2 ； Pfu快速高保真聚合酶； 雙蒸水；陰性對照滅菌生理鹽水； 陽性對照攜帶有分枝桿菌屬特異性16s rRNA的序列、結核分枝桿菌復合群的特異性序列IS6110、IS1081、副結核分枝桿菌的特異性序列f57基因和鳥分枝桿菌的特異性序列IS1245的質粒DNA，所述特異序列依次如序列表SEQID No. 3、SEQ ID No. 5、SEQ ID No. 9、SEQ ID No. 12 和 SEQ ID No. 15 所示。
4.一種檢測及鑒別分枝桿菌的mPCR-DHPLC方法 (I)采集樣品并提取核酸； (2 )對提取的核酸進行PCR擴增，其中 PCR的反應體系為 序列如 SEQ ID No. I 所示的引物10iimol/L，0. L ; 序列如 SEQ ID No. 2 所示的引物10iimol/L，0. L ; 序列如 SEQ ID No. 4 所示的引物10iimol/L，0. 5iiL; 序列如 SEQ ID No. 5 所示的引物10iimol/L，0. L ; 序列如 SEQ ID No. 7 所示的引物10iimol/L，0. 5iiL; 序列如SEQ ID吣.8所示的引物101111101/1，0.51^; 序列如 SEQ ID No. 10 所示的引物10iimol/L，0. 5iiL; 序列如 SEQ ID No. 11 所示的引物10iimol/L，0. L ; 序列如 SEQ ID No. 13 所示的引物10iimol/L，0.5iiL; 序列如 SEQ ID No. 14 所示的引物10iimol/L，0. L ; PCR 緩沖液10X，3iiL ;MgSO425mmol/L,I. 8 u L ；dNTP 2mmol/L, 3 u L ；KOD-Plus lU/u L,0. 6u L ；模板5 ii L ;雙蒸水11. 4 ii L ；總計30 u L ； PCR的反應條件為 第一步95°C 2分鐘；第二步95°C 5秒，62°C 5秒，68°C 5秒，40個循環；第三步，72°C I分鐘； (3)對擴增產物進行DHPLC檢測；陰性對照為滅菌生理鹽水；陽性對照為分別攜帶有如序列表 SEQ ID No. 3、SEQ ID No. 5、SEQ ID No. 9、SEQ ID No. 12 和 SEQ ID No. 15 所示的序列的質粒DNA ； (4) 分析、判定結果樣品的洗脫峰與陽性對照的洗脫峰位置一致，且陰性對照無相應的洗脫峰，則樣品為陽性。
全文摘要
本發明提供了一組用于檢測分枝桿菌及鑒別致病分枝桿菌的五重mPCR-DHPLC方法中使用的核酸，包括核苷酸序列分別如SEQ ID No.1和SEQID No.2、SEQ ID No.4和SEQ ID No.5、SEQ ID No.7和SEQ ID No.8、SEQ IDNo.10和SEQ ID No.11、SEQ ID No.13和SEQ ID No.14所示的五對引物，以及作為陽性對照的核苷酸序列如SEQ ID No.3、SEQ ID No.5、SEQ ID No.9、SEQ ID No.12和SEQ ID No.15所示的PCR擴增產物。本發明還提供了一種利用上述核酸的試劑盒及檢測方法，其特異性好，靈敏度高，操作簡單，高通量，對于臨床辨別分枝桿菌感染與其它致病原具有重要實用意義。
文檔編號C12N15/11GK102808031SQ20121030610
公開日2012年12月5日 申請日期2012年8月24日 優先權日2012年8月24日
發明者陳茹, 高小博, 馬旭, 陸彩玲, 劉志玲, 馬靜云 申請人:廣東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心, 國家人口計生委科學技術研究所