專利名稱：一種用于多不飽和脂肪酸生物合成的脫飽和酶ω3 Des的制作方法
技術領域：
本發明涉及多不飽和脂肪酸((Polyunsaturated fatty acids, PUFAs)的微生物制造領域，具體涉及在多不飽和脂肪酸生物合成途徑中起作用的脂肪酸脫飽和酶。
背景技術：
多不飽和脂肪酸(Polyunsaturated fatty acids, PUFAs)是指含有兩個或兩個以上雙鍵、碳原子數為16 26的直鏈脂肪酸。其中，《_3和《-6是兩類人體所必需的脂肪酸，不能在體內合成，只能通過食物攝取。屬于《-3的有a-亞麻酸(ALA, 18:3)、二十碳五烯酸(EPA，20:5)、二十二碳六烯酸(DHA，22:6)等；屬于《_6的有亞油酸(LA，18:2)、Y-亞麻酸(GLA，18:3)和花生四烯酸(ARA，20:4)等。多不飽和脂肪酸《_3和《_6在人體內有著多方面重要的生理功能，是所有細胞膜的重要組成成分，對激素代謝和許多酶的 活性起調控作用，特別對新生兒腦和視力的發育是必需的。PUFAs的生物合成途徑是以硬脂酸(Stearic acid)為底物，主要通過脂肪酸脫氫酶(Desaturase, Des)和延長酶(Elongase, Elo)的作用，生成不同的脂肪酸產物。主要的脂肪酸合成途徑有三條A 6脫氫酶-A 6延長酶-A 5脫氫酶-A 5延長酶-A 4脫氫酶途徑(A 6Des-A6E1。-A5Des_ A5E1。-A4Des),A 9延長酶-A 8脫氫酶途徑(A 9Elo_ A 8Des)和聚酮合成酶途徑(Polyketidesynthase, PKS)。研究PUFAs生物合成途徑中的關鍵酶和節點，對其合成通路進行解析和改造，對于PUFAs的微生物制造具有重要意義。高山被抱霉(Mortierella alpina, M. alpina)是目前產PUFAs真菌中唯一具有正式安全性評估的菌種(GRAS)，其PUFAs含量極為豐富，總的脂肪含量達到菌體生物量的50%，其中《_3達到總脂肪酸含量的3%，而《-6達到總脂肪酸含量的近30%，是名副其實的油脂細胞工廠。目前已有M. alpina菌株用于《_6脂肪酸花生四烯酸(ARA，20:4)商業化生產的報道。已知M. alpina編碼I個c5，兩個c6，3個c9，I個cl2和I個《 3區位選擇性脫氫酶，其具備所有已知的區位選擇性膜脫氫酶組。

發明內容
膜脫飽和酶可以在多種宿主中表達，例如大腸桿菌、啤酒酵母、米曲酶和高山被孢霉。申請人已經對PUFAs生物合成途徑中的關鍵酶(《3Des、A12Des和A9_IDes)的高效表達、純化和鑒定進行了大量工作。具體地，申請人在M. alpina全基因組測序的基礎上，設計了三對分別針對編碼M. alpine A 9Des、A 12Des和w 3Des這三個脫飽和酶的核苷酸的引物，具體引物序列在表I中列出。提取高山被孢霉RNA后進行反轉錄得到cDNA，用FFl和FRU FF2和FR2、FF3和FR3三對引物PCR擴增出三條序列，將其插入pET19b (PP)并測序，進而亞克隆至畢赤酵母表達載體pPink a -HC,構建上述三個脫飽和酶的表達載體,線性化后電轉化至pPink strain2，得到的重組菌能夠順利表達上述三種脫飽和酶。酶學活性分析結果表明重組菌中的脫飽和酶能夠發揮功能，并用Ni柱一步層析法得到純化的脫飽和酶蛋白。本發明提供了編碼M. alpina 3脫飽和酶(FADS15)和A 9脫飽和酶(FADS9-I)的基因，其核酸序列分別如SEQ ID NO: I和SEQ ID N0:3所示。本發明還提供了分別含有SEQ ID NO: I和SEQ ID NO:3的表達載體，能夠分別表達M. alpine 3脫飽和酶(FADS 15)和A 9脫飽和酶(FADS9-I)。優選地，所述表達載體是畢赤酵母表達載體。本發明還提供了一種重組微生物，它能夠分別表達M.alpina 3脫飽和酶(FADS15)和A9脫飽和酶(FADS9-I)。優選地，所述重組微生物是重組畢赤酵母，包括PichiaPink strain KPichiaPink strain2>PichiaPink strain 3和PichiaPink strain4菌株，特別是PichiaPink strain 2，其中含有攜帶SEQ ID NO: I或SEQ ID NO: 3的畢赤酵母表達載體。

本發明成功表達和純化了來源于M. alpina，在多不飽和脂肪酸生物合成途徑中起關鍵作用的新的膜脫飽和酶《3脫飽和酶(FADS15)和A 9脫飽和酶(FADS9-I)，其氨基酸序列分別如SEQ ID N0:2和SEQ ID NO:4所示，并對上述兩種膜脫飽和酶進行了酶學活性驗證。I.本發明還涉及上述新的膜脫飽和酶A9脫飽和酶(FADS9-I)和《3脫飽和酶(FADS15)在多不飽和脂肪酸生物合成中的用途，特別是利用此基因在高山被孢霉或其他轉入此基因物種中用于不飽和脂肪酸的生產及人類健康治療，特別是將飽和脂肪酸轉化成單不飽和脂肪酸(△ 9脫飽和酶)和《 6多不飽和脂肪酸催化為《 3多不飽和脂肪酸(《 3脫飽和酶)，比如A 9脫飽和酶能將C14:0催化為C14:1A9，C16:0催化為C16:1A9，C18:0催化為C18:1A9，C20:0 催化為 C20:1A9，w 3 脫飽和酶能將 C18:1A9 催化為 C18:2 A9’15，C18:2A9’12催化為 C18:3 A9’12’15，C20:4A5’8’n’14 催化為 C20:5 A5’8’n’14’17表I引物序列表及其酶切位點
權利要求
1.如SEQID NO: I所示的核酸，特征在于編碼一種高山被孢霉的ω3脫飽和酶。
2.含有權利要求I所述核酸的表達載體，特征在于能夠表達高山被孢霉的ω3脫飽和酶。
3.根據權利要求2所述的表達載體，特征在于所述載體是畢赤酵母表達載體。
4.根據權利要求3所述的表達載體,特征在于所述載體是pPinka -HC。
5.含有權利要求2-4任一項所述表達載體的重組微生物,其特征在于能夠表達高山被孢霉的ω 3脫飽和酶。
6.根據權利要求5所述的重組微生物，特征在于所述微生物是畢赤酵母。
7.根據權利要求5所述的重組微生物,特征在于所述畢赤酵母是PichiaPinkstrain2菌株。
8.一種高山被孢霉的ω 3脫飽和酶，特征在于其氨基酸序列如SEQ ID Ν0:2所示。
9.權利要求8所述的脫飽和酶在多不飽和脂肪酸生物合成中的用途，其特征在于將ω6多不飽和脂肪酸催化為ω 3多不飽和脂肪酸。
10.根據權利要求9所述的用途，其特征在于利用此基因在高山被孢霉或其他轉入此基因物種中用于不飽和脂肪酸的生產及人類健康治療，特別的是將脂肪酸C18:l"9催化為018:2Δ9,15, 018:2Δ9,12 催化為(18:3Λ9’12’15，020:4%8,11,14 催化為 C20:5A5’8’n’14’17。
全文摘要
本發明提供了來自高山被孢霉的用于多不飽和脂肪酸生物合成的新的脂肪酸脫飽和酶基因，特別是ω3脫飽和酶(FADS15)。本發明還提供了編碼上述脫飽和酶的核酸序列、上述脫飽和酶的表達載體和表達上述脫飽和酶的重組微生物。
文檔編號C12N1/19GK102776213SQ20121030921
公開日2012年11月14日 申請日期2012年8月28日 優先權日2012年8月28日
發明者宋元達, 張灝, 田豐偉, 趙建新, 陳衛, 陳永泉, 陳海琴, 顧震南 申請人:江南大學