專利名稱：小球藻多肽微膠囊的制備方法
技術領域：
本發明涉及小球藻多肽微膠囊的制備方法，可應用于功能食品和醫藥，屬于小球藻深加工及生物技術領域。
背景技術：
小球藻(Chlorella pyenoidosa)是ー類普生性單細胞綠藻,屬于綠藻門、小球藻屬，生長速度快，易于培養，應用價值高.小球藻含有豐富的生物活性物質和藥用成分，作為ー種新型保健食品和藥物蘊藏著巨大潛力。小球藻具有抗腫瘤活性、増加免疫力、解毒保肝、降壓作用等，其粗蛋白含 量高(50%左右)，品質好，已經成為小球藻應用領域十分活躍、備受重視的ー個方面。生物活性肽是指那些具有特殊生理活性或功能特性的肽類。絕大多數蛋白質都是具有一定功能作用的生物活性肽的前體物質，其肽鏈結構中存在著具有一定生物活性的氨基酸序列片段(功能區)，在正常狀態下，其功能區肽段隱藏在肽鏈中，但一旦單獨從蛋白質肽鏈中釋放出來，在適當的環境下，就能顯示出獨特的生物活性，這個功能肽段就是生物活性肽。現代生物代謝研究發現人類攝取的蛋白質經過消化道的多種酶水解后，更多的是以低肽的形式直接吸收，具有更高的營養價值和生物效價。酶水解法獲得生物活性肽已經成為エ業化生產生物活性肽的主要手段。惡性腫瘤是嚴重威脅人類健康和生命的疾病之一，目前已有的抗腫瘤藥物雖對大多數腫瘤有一定療效，但仍存在著治療效率低、選擇性差、毒副反應大、易產生瘤細胞耐藥等問題。因此，從不同途徑尋找高效、低毒、特異強的抗腫瘤藥物仍是藥物治療腫瘤的當務之急。近年來，人們越來越重視生物活性肽的研究和開發，各種生物活性肽不斷被發現和制備，多肽類藥物因其分子量小、無免疫原性、結構簡單、副作用小，其抗腫瘤活性的研究正在引起國內外學者的廣泛關注。蛋白及其多肽類藥物在藥物投遞過程中極易受到復雜生理環境特別是大量酶類物質的作用而遭到破壞，另外其較弱穿透能力及天然脆性決定了較易喪失本身的活性，為了提高多肽的生物利用度，抵抗胃酸和胃蛋白酶的降解作用，必須對其進行適當的保護，使其在小腸內穩定的發揮作用。特別對于生物活性肽，微膠囊化可望提高其穩定性和生物利用度，達到更好的營養功能和生理功效。

發明內容
為拓展小球藻在食品和生物醫學領域的應用，本發明的目的是提供小球藻多肽微膠囊的制備方法。為實現本發明目的，采用如下技術方案
小球藻多肽微膠囊的制備方法，具體包括下列步驟
(I)將小球藻粉和純水混合后攪拌得混合溶液，在所述混合溶液中提取小球藻蛋白質，得到的粗提液作為下一次的待提取溶液進行再提取；(2)將步驟(I)所述再提取后得到的溶液離心，去除沉淀獲得蛋白上清液，再真空冷凍干燥，獲得小球藻蛋白質粉；
(3)在步驟(2)所得的小球藻蛋白質粉中，配置濃度為f4%(w/v，g/mL)的小球藻蛋白水溶液，加入水解酶進行水解，水解后，滅酶，冷卻至室溫后將水解液離心，取上清液；
(4)步驟(3)所述上清液經截留分子量為10KD的超濾離心管過濾，濾液再經過3 KD、5 KD的超濾離心管過濾，即獲得分子量大小范圍為< 3 KD,3-5 KD,5-10 KD, >10 KD的小球藻多肽水解液；
(5)以步驟(4)得到的3-5KD小球藻多肽水解液為基礎，使用離子交換色譜DEAE-52分離純化，按照出峰順序共收集到四個峰ΑΓΑ4，將收集到的吸收峰A2再進行凝膠色譜葡聚糖凝膠G-25分離純化，按照出峰順序共收集到ニ個峰A2-1和A2-2 ；
(6)以步驟(5)得到小球藻多肽水解液A2-1為基礎，采用復凝聚法制備小球藻多肽
微膠囊。上述的小球藻多肽微膠囊的制備方法，步驟(I)所述小球藻粉和純水的質量比為1:10 1:40 ;所述攪拌的時間為30 120分鐘；所述提取小球藻蛋白質為在溫度4°C 10°C、壓カ為50MPa 250MPa的條件下提取。上述的小球藻多肽微膠囊的制備方法，步驟(I)所述再提取所提取的次數為I次 8次，姆次提取的時間為IOmin 60min。上述的小球藻多肽微膠囊的制備方法，步驟(2)所述離心為在溫度Γ8 0C ,轉速為 5000 10000 r/min 下離心 10 60 min。上述的小球藻多肽微膠囊的制備方法，步驟(3)所述的水解酶為木瓜蛋白酶，酶解條件是溫度3(T80 °C, pH= 5 10，酶與小球藻蛋白質水溶液的比1°/Γ5% (w/v, g/mL),水解時間3 IOh ;所述滅酶為在100で水中滅酶10 min ;所述離心為在8000 r/min下離心25 min。上述的小球藻多肽微膠囊的制備方法，步驟(4)所述濾為在8000 g、4で條件下經超濾離心管過濾。上述的小球藻多肽微膠囊的制備方法，步驟(5)所述使用離子交換色譜DEAE-52分離純化的具體分離條件是上樣體積為:Γ15 mL，洗脫速度為O. 2^2 mL/min，洗脫液為蒸餾水，檢測波長為280 nm ;所述凝膠色譜葡聚糖凝膠G-25分離純化的具體分離條件是上樣體積為3 15 mL，洗脫速度為O. 2^2 mL/min，洗脫液為蒸餾水，檢測波長為280 nm。上述的小球藻多肽微膠囊的制備方法，步驟(6)所述復凝聚法具體步驟為取殼聚糖溶于廣3% (w/v, g/mL)醋酸溶液中再加入無水氯化鈣，攪拌溶解，制得殼聚糖氯化鈣溶液；另取廣5% (w/v, g/mL)的海藻酸鈉水溶液，加入步驟(5)制得的小球藻多肽水解液A2-1，混合均勻制得海藻酸鈉小球藻多肽溶液；最后將海藻酸鈉小球藻多肽溶液滴加到等體積的殼聚糖氯化鈣溶液中，3(T60°C水浴，并用醋酸調節pH值為3 8，攪拌IOlOmin后移開水浴，8000 r/min下離心，將沉淀物干3(T60°C烘箱中干燥可得小球藻多肽微膠囊。上述的小球藻多肽微膠囊的制備方法，其特征在于所述殼聚糖在醋酸溶液中的濃度為O. 5^3% (w/v, g/mL);所述氯化I丐在殼聚糖-醋酸溶液中的濃度為1 5% (w/v, g/mL)；所述小球藻多肽在海藻酸鈉水溶液中的濃度為2 10mg/ml。與現有技術相比，本發明具有如下優點和技術效果本發明得到的小球藻多肽微膠囊具有下述抗腫瘤活性對人肝癌細胞HepG2體外生長具有一定的抑制作用，當濃度為400 μ g/mL時，抑制率可達38%.因而本發明得到的小球藻多肽微膠囊有利于抗腫瘤保健食品和醫藥產品的開發利用。


圖I為實施例I中小球藻木瓜蛋白酶3-5 KD水解液(活性組分A)離子交換色譜DEAE-52柱層析洗脫曲線；
圖2為實施例I中小球藻活性組分A2凝膠色譜葡聚糖凝膠G-25柱層析洗脫曲線；
圖3為實施例I所制備的小球藻多肽微膠囊干燥后的掃描電鏡(SEM)圖。
具體實施方式
以下結合附圖和實例對本發明的具體實施作進ー步說明，但本發明的實施和保護范圍不限于此。實施例I
小球藻多肽微膠囊的制備方法，步驟如下
(I)采用低溫超高壓連續流細胞破碎機對小球藻蛋白質進行提取將小球藻粉和純水以1:20的質量比混合后攪拌50分鐘得混合溶液。將上述混合溶液在溫度為6°C、壓カ為IOOMPa的條件下提取小球藻蛋白質，得到粗提液作為下一次的待提取溶液進行再提取，提取的次數為3次，每次提取的時間為20min。最后，將獲得的溶液于溫度4 V，轉速為6000r/min下離心30 min,去除沉淀獲得蛋白上清液，再迅速真空冷凍干燥，獲得小球藻蛋白質粉。(2)以步驟(I)得到的小球藻蛋白質粉為基礎，配置濃度為2%的小球藻蛋白溶液，加入木瓜蛋白酶進行水解。實驗條件是溫度40°C，pH= 5，酶與底物的比3%.水解5 h后，在100で水中滅酶10 min，室溫冷卻后將水解液在8000 r/min下離心25 min，取上清液。然后，在8000 g、4で條件下，經截留分子量為10 KD的超濾離心管過濾，濾液再經過3 KD,5 KD的超濾離心管過濾。即可獲得分子量大小范圍為0-3 KD,3-5 KD,5-10 KD、>10 KD的小球藻多肽水解液。(3)以步驟(2)得到的3-5 KD木瓜蛋白酶水解液(活性組分A)為基礎，使用離子交換色譜DEAE-52分離純化.具體分離條件為上樣體積為10 mL，洗脫速度為O. 3 mL/min，洗脫液為蒸餾水，檢測波長為280 nm。并且按照出峰順序共收集到四個峰Af A4 (如圖I).將收集到的吸收峰A2再進行凝膠色譜葡聚糖凝膠G-25分離純化。具體分離條件為上樣體積為5 mL,洗脫速度為O. 2 mL/min,洗脫液為蒸懼水,檢測波長為280 nm。并且按照出峰順序共收集到ニ個峰A2-1和A2-2 (如圖2)。(4)以步驟(3)得到的純化的小球藻多肽水解液A2-1為基礎，再采用復凝聚法制備小球藻多肽微膠囊。具體程序為取適量殼聚糖，溶于1%醋酸溶液中，使殼聚糖在醋酸溶液中的濃度為I. 5%，再加入無水氯化鈣，攪拌溶解，使氯化鈣在殼聚糖-醋酸溶液中的濃度為3%。另配制3%的海藻酸鈉水溶液，在海藻酸鈉水溶液中加入小球藻多肽水解液，使其終濃度為5mg/ml，混合均勻，將海藻酸鈉小球藻多肽溶液緩慢滴加到等體積的殼聚糖氯化鈣溶液中，45°C水浴，并用醋酸調節pH值為5，不斷攪拌，20min后移開水浴，8000 r/min下離心，將沉淀物干45°C烘箱中干燥即得小球藻多肽微膠囊。通過步驟(I) (4)所得的小球藻多肽微膠囊進行掃描電鏡(SEM)分析，從圖3中可以看出，小球藻多肽微膠囊呈球形或近似球形的形態，粒徑大小比較均一，平均直徑約為 200-300 μ m。從小球藻多肽微膠囊進行抗腫瘤活性檢測(使用MTT檢測方法)，結果表明，小球藻多肽微膠囊對人肝癌細胞HepG2體外生長具有一定的抑制作用，當濃度為400 μ g/mL吋，抑制率可達38%.
實施例2
小球藻多肽微膠囊的制備方法，步驟如下
(I)采用低溫超高壓連續流細胞破碎機對小球藻蛋白質進行提取將小球藻粉和純水以1:30的質量比混合后攪拌80分鐘得混合溶液。將上述混合溶液在溫度為8°C、壓カ為150MPa的條件下提取小球藻蛋白質，得到粗提液作為下一次的待提取溶液進行再提取，提取的次數為6次，每次提取的時間為50min。最后，將獲得的溶液于溫度4 V，轉速為5000r/min下離心20 min,去除沉淀獲得蛋白上清液，再迅速真空冷凍干燥,獲得小球藻蛋白質粉。(2)以步驟(I)得到的小球藻蛋白質粉為基礎，配置濃度為2%的小球藻蛋白溶液，加入木瓜蛋白酶進行水解.實驗條件是溫度70 °C，pH= 9，酶與底物的比4%.水解6 h后，在100で水中滅酶10 min，室溫冷卻后將水解液在8000 r/min下離心25 min，取上清液。然后，在8000 g、4で條件下經截留分子量為10 KD的超濾離心管過濾。濾液再經過3 KD,5 KD的超濾離心管過濾。即可獲得分子量大小范圍為0-3 KD,3-5 KD,5-10 KD、>10 KD的小球藻多肽水解液。(3)以步驟(2)得到的3-5 KD木瓜蛋白酶水解液(活性組分A)為基礎，使用離子交換色譜DEAE-52分離純化.具體分離條件為上樣體積為10 mL，洗脫速度為O. 5 mL/min，洗脫液為蒸餾水，檢測波長為280 nm。并且按照出峰順序共收集到四個峰Af A4.將收集到的吸收峰A2再進行凝膠色譜葡聚糖凝膠G-25分離純化。具體分離條件為上樣體積為5 mL，洗脫速度為I. 2 mL/min，洗脫液為蒸餾水，檢測波長為280 nm。并且按照出峰順序共收集到ニ個峰A2-1和A2-2。(4)以步驟(3)得到的純化的小球藻多肽水解液A2-1為基礎，再采用復凝聚法制備小球藻多肽微膠囊。具體程序為稱取適量殼聚糖，溶于1%醋酸溶液中，使殼聚糖在醋酸溶液中的濃度為2%，再加入無水氯化鈣，攪拌溶解，使氯化鈣在殼聚糖-醋酸溶液中的濃度為2%。另配制3%的海藻酸鈉水溶液，在海藻酸鈉水溶液中加入小球藻多肽，使其終濃度為8mg/ml，混合均勻，將海藻酸鈉小球藻多肽溶液緩慢滴加到等體積的殼聚糖氯化鈣溶液中，45°C水浴，并用醋酸調節pH值為7，不斷攪拌，20min后移開水浴，8000 r/min下離心，將沉淀物干45°C烘箱中干燥即得小球藻多肽微膠囊。檢測方法與結果同實施例I。實施例3
小球藻多肽微膠囊的制備方法，步驟如下
(I)采用低溫超高壓連續流細胞破碎機對小球藻蛋白質進行提取將小球藻粉和純水以1:35的質量比混合后攪拌100分鐘得混合溶液。將上述混合溶液在溫度為9°C、壓カ為200MPa的條件下提取小球藻蛋白質，得到粗提液作為下一次的待提取溶液進行再提取，提取的次數為2次，每次提取的時間為lOmin。最后，將獲得的溶液于溫度4 V,轉速為8000r/min下離心30 min,去除沉淀獲得蛋白上清液，再迅速真空冷凍干燥,獲得小球藻蛋白質粉。(2)以步驟(I)得到的小球藻蛋白質粉為基礎，配置濃度為2%的小球藻蛋白溶液，加入木瓜蛋白酶進行水解.實驗條件是溫度40°C，pH= 5，酶與底物的比4%.水解4h后，在100で水中滅酶10 min，室溫冷卻后將水解液在8000 r/min下離心25 min，取上清液。然后，在8000 g、4で條件下經截留分子量為10 KD的超濾離心管過濾。濾液再經過3 KD,5 KD的超濾離心管過濾。即可獲得分子量大小范圍為0-3 KD,3-5 KD,5-10 KD、>10 KD的小球藻多肽水解液。(3)以步驟(2)得到的3-5 KD木瓜蛋白酶水解液(活性組分A)為基礎，使用離子交換色譜DEAE-52分離純化.具體分離條件為上樣體積為10 mL，洗脫速度為I mL/min，洗脫液為蒸餾水，檢測波長為280 nm。并且按照出峰順序共收集到四個峰Af A4.將 收集到的吸收峰A2再進行凝膠色譜葡聚糖凝膠G-25分離純化。具體分離條件為上樣體積為5 mL,洗脫速度為I. 5 mL/min,洗脫液為蒸懼水,檢測波長為280 nm。并且按照出峰順序共收集到ニ個峰A2-1和A2-2。(4)以步驟(3)得到的純化的小球藻多肽水解液A2-1為基礎，再采用復凝聚法制備小球藻多肽微膠囊。具體程序為稱取適量殼聚糖，溶于1%醋酸溶液中，使殼聚糖在醋酸溶液中的濃度為3%，再加入無水氯化鈣，攪拌溶解，使氯化鈣在殼聚糖-醋酸溶液中的濃度為4%。另配制3%的海藻酸鈉水溶液，在海藻酸鈉水溶液中加入一定比例的小球藻多肽，使其終濃度為3mg/ml，混合均勻，將海藻酸鈉小球藻多肽溶液緩慢滴加到等體積的殼聚糖氯化鈣溶液中，45°C水浴，并用醋酸調節pH值為4，不斷攪拌，20min后移開水浴，8000 r/min下離心，將沉淀物干45°C烘箱中干燥即得小球藻多肽微膠囊。檢測方法與結果同實施例I。實施例4
小球藻多肽微膠囊的制備方法，步驟如下
(I)采用低溫超高壓連續流細胞破碎機對小球藻蛋白質進行提取將小球藻粉和純水以1:10的質量比混合后攪拌90分鐘得混合溶液。將上述混合溶液在溫度為9°C、壓カ為250MPa的條件下提取小球藻蛋白質，得到粗提液作為下一次的待提取溶液進行再提取，提取的次數為4次，每次提取的時間為40minn。最后，將獲得的溶液于溫度4で，轉速為10000 r/min下離心60 min,去除沉淀獲得蛋白上清液，再迅速真空冷凍干燥,獲得小球藻蛋白質粉。(2)以步驟(I)得到的小球藻蛋白質粉為基礎，配置濃度為2%的小球藻蛋白溶液，加入木瓜蛋白酶進行水解.實驗條件是溫度60°C，pH= 7，酶與底物的比5%.水解IOh后，在100で水中滅酶10 min，室溫冷卻后將水解液在8000 r/min下離心25 min，取上清液。然后，在8000 g、4で條件下經截留分子量為10 KD的超濾離心管過濾。濾液再經過3 KD,5 KD的超濾離心管過濾。即可獲得分子量大小范圍為0-3 KD,3-5 KD,5-10 KD、>10 KD的小球藻多肽水解液。(3)以步驟(2)得到的3-5 KD木瓜蛋白酶水解液(活性組分A)為基礎，使用離子交換色譜DEAE-52分離純化.具體分離條件為上樣體積為10 mL，洗脫速度為I. 5 mL/min，洗脫液為蒸餾水，檢測波長為280 nm。并且按照出峰順序共收集到四個峰Af A4.將收集到的吸收峰A2再進行凝膠色譜葡聚糖凝膠G-25分離純化。具體分離條件為上樣體積為5 mL，洗脫速度為2 mL/min，洗脫液為蒸餾水，檢測波長為280 nm。并且按照出峰順序共收集到ニ個峰A2-1和A2-2。(4)以步驟(3)得到的純化的小球藻多肽水解液A2-1為基礎，再采用復凝聚法制備小球藻多肽微膠囊。具體程序為稱取適量殼聚糖，溶于1%醋酸溶液中，使殼聚糖在醋酸溶液中的濃度為3%，再加入無水氯化鈣，攪拌溶解，使氯化鈣在殼聚糖-醋酸溶液中的濃度為1%。另配制3%的海藻酸鈉水溶液，在海藻酸鈉水溶液中加入小球藻多肽，使其終濃度為6mg/ml，混合均勻，將海藻酸鈉小球藻多肽溶液緩慢滴加到等體積的殼聚糖氯化鈣溶液中，45°C水浴，并用醋酸調節pH值為8，不斷攪拌，20min后移開水浴，8000 r/min下離心，將沉淀物干45°C烘箱中干燥即得小球藻多肽微膠囊。檢測方法與結果基本 同實施例I。
權利要求
1.小球藻多肽微膠囊的制備方法，其特征在于具體包括下列步驟 (1)將小球藻粉和純水混合后攪拌得混合溶液，在所述混合溶液中提取小球藻蛋白質，得到的粗提液作為下一次的待提取溶液進行再提取； (2)將步驟(I)所述再提取后得到的溶液離心，去除沉淀獲得蛋白上清液，再真空冷凍干燥，獲得小球藻蛋白質粉； (3)在步驟(2)所得的小球藻蛋白質粉中，配置濃度為f4%(w/v)的小球藻蛋白水溶液，加入水解酶進行水解，水解后，滅酶，冷卻至室溫后將水解液離心，取上清液； (4)步驟(3)所述上清液經截留分子量為10KD的超濾離心管過濾，濾液再經過3 KD、5 KD的超濾離心管過濾，即獲得分子量大小范圍為< 3 KD,3-5 KD,5-10 KD, >10 KD的小球藻多肽水解液； (5)以步驟(4)得到的3-5KD小球藻多肽水解液為基礎，使用離子交換色譜DEAE-52 分離純化，按照出峰順序共收集到四個峰ΑΓΑ4，將收集到的吸收峰A2再進行凝膠色譜葡聚糖凝膠G-25分離純化，按照出峰順序共收集到二個峰A2-1和A2-2 ； (6)以步驟(5)得到小球藻多肽水解液A2-1為基礎，采用復凝聚法制備小球藻多肽微膠囊。
2.根據權利要求I所述的小球藻多肽微膠囊的制備方法，其特征在于步驟(I)所述小球藻粉和純水的質量比為1:10 1:40 ;所述攪拌的時間為30 120分鐘；所述提取小球藻蛋白質為在溫度4°C 10°C、壓力為50MPa 250MPa的條件下提取。
3.根據權利要求I所述的小球藻多肽微膠囊的制備方法，其特征在于步驟(I)所述再提取所提取的次數為I次 8次，每次提取的時間為IOmin 60min。
4.根據權利要求I所述的小球藻多肽微膠囊的制備方法，其特征在于步驟(2)所述離心為在溫度4 8 0C ,轉速為5000 10000 r/min下離心10 60 min。
5.根據權利要求I所述的小球藻多肽微膠囊的制備方法，其特征在于步驟(3)所述的水解酶為木瓜蛋白酶，酶解條件是溫度3(T80 °C, pH= 5 10，酶與小球藻蛋白質水溶液的比1% 5% (w/v)，水解時間3 IOh ;所述滅酶為在100 °〇水中滅酶10 min ;所述離心為在8000 r/min 下離心 25 min。
6.根據權利要求I所述的小球藻多肽微膠囊的制備方法，其特征在于步驟(4)所述濾為在8000 g、4 °C條件下經超濾離心管過濾。
7.根據權利要求I所述的小球藻多肽微膠囊的制備方法，其特征在于步驟(5)所述使用離子交換色譜DEAE-52分離純化的具體分離條件是上樣體積為3 15 mL，洗脫速度為O.2^2 mL/min，洗脫液為蒸餾水，檢測波長為280 nm ;所述凝膠色譜葡聚糖凝膠G-25分離純化的具體分離條件是上樣體積為3 15 mL，洗脫速度為0.2 2 mL/min，洗脫液為蒸餾水，檢測波長為280 nm。
8.根據權利要求I所述的小球藻多肽微膠囊的制備方法，其特征在于步驟(6)所述復凝聚法具體步驟為取殼聚糖溶于廣3% (w/v)醋酸溶液中再加入無水氯化鈣，攪拌溶解，制得殼聚糖氯化鈣溶液；另取廣5% (w/v)的海藻酸鈉水溶液，加入步驟(5)制得的小球藻多肽水解液A2-1，混合均勻制得海藻酸鈉小球藻多肽溶液；最后將海藻酸鈉小球藻多肽溶液滴加到等體積的殼聚糖氯化鈣溶液中，3(T60°C水浴，并用醋酸調節pH值為3 8，攪拌l(T30min后移開水浴，8000 r/min下離心，將沉淀物于3(T60°C烘箱中干燥可得小球藻多肽微膠囊。
9.根據權利要求8所述的小球藻多肽微膠囊的制備方法，其特征在于所述殼聚糖在醋 酸溶液中的濃度為O. 5^3% (w/v);所述氯化鈣在殼聚糖-醋酸溶液中的濃度為f 5% (w/v);所述小球藻多肽在海藻酸鈉水溶液中的濃度為2 10mg/ml。
全文摘要
本發明提供小球藻多肽微膠囊的制備方法，首先采用低溫超高壓連續流細胞破碎機提取小球藻蛋白，木瓜蛋白酶水解小球藻蛋白，超濾離心管過濾,離子交換色譜DEAE-52和凝膠色譜葡聚糖凝膠G-25柱分離純化，再采用復凝聚法制備小球藻多肽微膠囊。本發明得到的小球藻多肽微膠囊具有下述抗腫瘤活性對人肝癌細胞HepG2體外生長具有一定的抑制作用，當濃度為400μg/mL時，抑制率可達38%。因而，本發明得到的小球藻多肽微膠囊有利于抗腫瘤保健食品和醫藥產品的開發利用。
文檔編號A23L1/29GK102847134SQ20121031807
公開日2013年1月2日 申請日期2012年8月31日 優先權日2012年8月31日
發明者張學武, 王曉琴 申請人:華南理工大學