專利名稱：轉bar基因農作物的可視化檢測方法
技術領域：
本發明屬于基因工程技術領域，涉及一種轉基因農作物的檢測技術，具體涉及轉BAR基因農作物的可視化檢測方法。
背景技術：
轉基因農作物是利用組織培養技術和基因重組技術引入其它生物或物種的基因而培育出來的，這種農作物往往具有抗病蟲害、抗除草劑或者營養高于非轉基因作物等特性。目前中國的轉基因植物已經超過20種，其中轉基因大豆、馬鈴薯、玉米、煙草、花生、菠菜、甜椒、小麥等進行了田間試驗，轉基因棉花已經大規模應用，國外轉基因大豆等也大量進入我國。雖然轉基因作物有諸多優勢，但是轉基因農作物的安全性問題以及轉基因作物對生態環境的潛在影響，仍然是我們必須謹慎對待的問題。特別是對于國外進口的產品，更·應該確定其是否為轉基因產品。目前轉基因產品的檢測方法根據檢測靶標的不同可分為基于核酸(DNA)的檢測方法和基于外源蛋白質的檢測方法。其中以第一類方法使用較為廣泛，基于核酸的檢測方法主要是建立在熒光定量PCR之上的檢測方法，熒光定量PCR有很多優勢，包括靈敏度高，特異性性高，既可定性又可定量等，但是其所需要用的儀器設備，以及熒光探針的檢測成本都要遠遠高于普通PCR。本發明利用DNAzyme的特性，可以建立一種基于普通PCR反應的可視化檢測方法，同時這種非標記的探針成本也大大下降，顯色反應的操作也非常簡單方便，可以實現高通量，多樣本的檢測。BAR基因是一種來自于吸水鏈霉菌的抗除草劑基因，它在作為抗除草劑基因使用的同時，也被廣泛地用作顯性的選擇標記，在現有的轉基因產品中含有BAR基因的轉基因作物的數量是非常可觀的，這也預示著研究高效、簡單的轉BAR基因農作物檢測方法具有廣闊的應用前景。

發明內容
本發明的目的是提供一種轉基因農作物的檢測方法。本發明上述方法是利用在PCR體系中加入DNAzyme標記的檢測BAR基因的特異性探針 CCCTACCCAGITCCTGCGGCTCGGTACGGAAGITGACCTGGGTAGGGCGGGITGGGAAA-NH2，用正反引物(BAR-2 GCACCATCGTCAACCACTACATC BAR-6 GAGGTCGTCCGTCCACTC)對BAR基因進行擴增，利用核酸聚合酶5’ -3’外切酶活性將探針中的DNAzyme標記釋放，通過檢測PCR產物中釋放出的標記物來判斷該樣品是否為轉基因樣品。本發明上述方法包括下列步驟DNA 的提取；PCR 反應顯色反應。本發明具有明顯優于現有技術的優點，其主要優點包括
I.快速性。采用本發明方法檢測十分快速，3-4小時即可得知檢測結果。2.通用性。本發明所涉及的PCR檢測方法，對于含有BAR基因的不同樣品均可檢測。實用性。現有的實時熒光PCR技術通常對檢測設備具有較高的要求，從而使檢測具有一定的局限性，而本發明檢測方法僅需要普通PCR儀，因此，使得轉基因產品的檢測變得更加簡單、實用、方便。經濟性。現有的實時熒光PCR技術，試劑和探針的合成費用都較高，而本發明中所涉及的探針序列和標記物都由普通的核苷酸組成，不用修飾和改性，合成方便，試劑較為廉價，因此,大大降低了檢測成本。對于含有轉BAR基因的轉基因作物，只要檢測到BAR基因的存在，就可以判斷該樣品是轉基因產品。所以本方法可以為海關，出入境檢驗檢疫局、商檢、食品藥品的監督管理等提供一種聞效、簡便且成本合理的轉基因廣品的檢測技術。·


圖I是轉BAR基因水稻的檢測結果，其中1為陰性對照，為非轉基因水稻，檢測結果為無色；2為轉基因水稻，檢測結果為綠色；3為陽性對照，含BAR基因質粒，檢測結果為綠色。圖2是轉BAR基因棉花的檢測結果，其中1為陰性對照，為非轉基因棉花，檢測結果為無色；2為轉基因棉花，檢測結果為綠色；3為陽性對照，含BAR基因質粒，檢測結果為綠色。
具體實施例方式下面將結合附圖舉例說明本發明的方法。實施例I :水稻中BAR基因的檢測I.水稻基因組DNA的提取；水稻基因組DNA的提取是采用改良的CTAB法提取。①水稻葉片或種子適量在液氮保護下于研缽中研磨成細粉取粉末少量于1.5mL EP管中，加入65°C預熱的CTAB提取緩沖液700 yl，充分振蕩混勻，65 °C溫浴2h ;②樣品冷卻至室溫后加氯仿-異戊醇(24 l)600iil，顛倒混勻5分鐘； 7500r. min-1離心10分鐘，轉移上清液至一新的EP管中；④加入等體積_20°C預冷的異丙醇，混勻，20°C放置30分鐘； 10，000r. min-1離心15分鐘，棄上清液； 沉淀用70%乙醇、無水乙醇各洗滌一次，10，OOOr. min-1離心3分鐘，棄上清液，室溫揮干乙醇，無菌高純水溶解DNA，備用。所述CTAB提取緩沖液含有2%CTAB (十六烷基三甲基溴化銨)，IOOmM Tris (pH8. 0), 20mM EDTA (pH8. 0)，2. 5M NaCl。PCR 反應；10 X Taq buffer 5 U I ；Taq 酶 5 個單位；正向引物IyM;反向引物IyM;dNTPsO. 2mM ；DNA 提取液 I U I ;探針0.6iiM;滅菌水補足50 ill。95 °C 3分鐘；94 V 30秒，60。。I分鐘30秒，循環35次；72 °C延伸5分鐘，得擴增樣品。分別設置I :陰性對照，為非轉基因水稻；2 :轉基因水稻；3 :陽性對照，為含BAR基因質粒。3.顯色反應；將PCR 產物加 200mM NaCl，94°C 加熱 lmin，室溫放置 lh，加 I. 8 y M hemin,2. IuMABTS，2. IuM H202，用肉眼觀察顏色變化。4.檢測結果如附圖I所示，陰性對照不顯色，樣品與陽性對照都可見濃綠的顏色。實施例2 :棉花中BAR基因的檢測I.棉花基因組DNA的提取；

棉花基因組DNA的提取是采用改良的CTAB法提取。①棉花葉片或種子適量在液氮保護下于研缽中研磨成細粉取粉末少量于I. 5mL EP管中，加65°C預熱的CTAB提取緩沖液700 yl，充分振蕩混勻，65 °C溫浴2h;②樣品冷卻至室溫后加氯仿-異戊醇(24 l)600iil，顛倒混勻5分鐘； 7500r. min-1離心10分鐘，轉移上清液至一新的EP管中；④加入等體積_20°C預冷的異丙醇，混勻，20°C放置30分鐘； 10，OOOr. min-1離心15分鐘，棄上清液； 沉淀用70%乙醇、無水乙醇各洗滌一次，10，OOOr. min-1離心3分鐘，棄上清液，室溫揮干乙醇，無菌高純水溶解DNA，備用。PCR 反應；IOXTaq buffer5li I ；Taq 酶 5 個單位；正向引物IyM;反向引物IyM;dNTPsO. 2mM ；DNA 提取液 I U I ;探針0. 6 ii M ;滅菌水補足501。950C 3分鐘-MV 30 #, 600C I分鐘30秒，循40次；72°C延伸5分鐘，得擴增樣品。分別設置I :陰性對照，為非轉基因棉花；2 :轉基因棉花；3 :陽性對照，為含BAR基因質粒。3.顯色反應；將PCR 產物加 200mM NaCl，94°C 加熱 lmin，室溫放置 lh，加 I. 8 y M hemin,2. IuMABTS，2. IuM H202，用肉眼觀察顏色變化。4.檢測結果如附圖2所示，陰性對照不顯色，樣品與陽性對照都可見濃綠的顏色。
權利要求
1.一種轉BAR基因農作物的PCR可視化檢測方法，其特征在于，所述方法是利用在PCR體系中加入DNAzyme標記的檢測BAR基因的特異性探針，用正反引物對BAR基因進行擴增，利用核酸聚合酶5’-3’外切酶活性將探針中的DNAzyme標記釋放通過檢測PCR產物中釋放出的標記物來判斷該樣品是否為轉基因樣品。
2.根據權利要求I所述的方法，其特征在于，檢測BAR基因的探針是CCCTACCCAGTTCCTGCGGCTCGGTACGGAAGTTGACCTGGGTAGGGCGGGTTGGGAAA-N H2。
3.根據權利要求I所述的方法，其特征在于，PCR反應中特異性的引物是BAR-2 GCACCATCGTCAACCACTACATCBAR-6 GAGGTCGTCCGTCCACTCo
4.根據權利要求I所述的檢測方法，其特征在于，所述方法包括下列步驟 DDNA的提取； 2)PCR反應； 3)顯色反應。
5.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，PCR反應體系及條件IOxTaq buffer 5|j I;Taq 酶 5 個單位；正向引物1|J M;反向引物1|J M ;dNTPs 0.2mM ;DNA 提取液 1jj I ;探針0.6m M ;滅菌水補足50m I ； 950C 3分鐘；94°C 30秒，60°C I分鐘30秒，循環35-40次；72°C延伸5分鐘，得擴增樣品。
6.根據權利要求I所述PCR產物中釋放出的DNAzyme標記物,其特征在于,該標記物是與口卜啉鐵等結合具有過氧化物酶活性DNAzyme,可在PCR反應結束后,加入hemin、顯色底物(ABTS.DAB等)、H202，在室溫下顯色，直接用肉眼觀察顏色變化從而判斷該樣品是否為轉基因。
7.根據權利要求I所述的檢測方法，其特征在于所檢測對象為轉BAR基因的農作物，包括水稻、小麥、棉花等。
全文摘要
本發明屬于基因工程技術領域，涉及一種轉基因農作物的檢測技術，具體涉及轉BAR基因農作物的可視化檢測方法。利用在PCR體系中加入DNAzyme標記的檢測BAR基因的特異性探針，用正反引物對BAR基因進行擴增，利用核酸聚合酶5’-3’外切酶活性將探針中的DNAzyme標記釋放，通過檢測PCR產物中釋放出的標記物來判斷該樣品是否為轉基因樣品。本發明具有高效、簡便、成本低等特點。
文檔編號C12Q1/68GK102787175SQ20121033267
公開日2012年11月21日 申請日期2012年9月11日 優先權日2012年9月11日
發明者余懋群, 唐卓, 陳蓉, 龍海 申請人:中國科學院成都生物研究所