專利名稱：一種KCC2基因cRNA原位雜交的探針及其設計方法
技術領域：
本發明屬于生物醫學領域，涉及一種探針及其設計方法，尤其是一種KCC2基因cRNA原位雜交的探針及其設計方法。
背景技術：
氯離子是細胞內最重要陰離子。在神經系統，神經元內外氯離子濃度保持相對平衡狀態，是維持神經元和局部環路形態和機能穩定的內環境基礎。一旦氯離子失去平衡，將直接導致神經系統疾病產生。目前已經發現，氯離子失衡可導致是包括帕金森病、癲癇、缺血缺氧、阿爾茨海默病、腦震蕩、神經病理性痛、脊髓損傷、糖尿病性神經病、精神分裂癥和小腦共濟失調等多種神經系統疾病的重要因素。氯離子是由細胞膜上的氯離子轉運體負責運入或者運出細胞。目前為止共克隆得到8個氯離子轉運體蛋白分子:包括2個NKCC蛋白、
4個KCC蛋白、I個NCC蛋白以及I個CIP蛋白。KCC2是神經系統內最重要的升高神經元內氯離子濃度的蛋白。KCC2全名為 鈉離子鉀離子濃度梯度驅動的氯離子內向轉運體。KCC2的工作原理是:按1:1: 2的比例將I個鈉離子和I個鉀離子轉運出胞體，而同時將2個氯離子轉運入胞體。

發明內容
本發明的目的在于提供一種KCC2基因cRNA原位雜交的探針及其設計方法。本發明的目的是通過以下技術方案來解決的:一種KCC2基因cRNA原位雜交的探針，該探針的序列為:5' tt ccaggttatg agtgtggtgt caggcttcag tcctcttatc agtgctgggattttctctgccacactttcc tctgccctgg catctctcgt cagtgcccca aaagtgtttcaggctttatgcaaagacaat atctatcctg gaattgcaat ttttggaaag ggctatggcaagaacaacgagcccctgcga ggatattttc ttacctttgg cattgcgtta gcttttattc taattgcggagttgaacgtcattgccccaa tcatttccaa ctttttcctg gcatcatacg ctctcatcaa cttctcggtgtttcacgcttcgctggccaa ttcccctgga tggaggccaa gcttcaagta ctacaacatgtgggcgtctctggccggggc aatcctatgt tgtgttgtca tgtttatcat caattggtgggcagcgcttttgaccaacgt cattgtctta tccctttaca tctacgtcag ctacaaaaaaccagatgtgaattggggttc gtcaac3J 。所述探針的設計方法，按照如下步驟:(I)根據KCC2的Gene bank序列我們設計了 KCC2特異的引物，并且此對引物擴增出518bp的KCC2片段作為KCC2特異的探針序列；(2)構建KCC2的cRNA原位雜交的探針質粒；將探針質粒轉化細菌后，細菌培養后進行測序；(3)制備KCC2的cRNA原位雜交探針；(4)檢測KCC2的cRNA探針的原位雜交。
所述步驟⑴中KCC2特異的引物是:上游引物是5’CTA CTT CAC CCT GCT CGT TG 3’ ；下游引物是5’GCA CAA GCC AAG TTC ACA AA 3’。所述步驟(2)按照如下步驟進行:(a)將小鼠的cDNA用設計的弓丨物進行PCR擴增；(b)將PCR產物用TIANGEN膠回收試劑盒進行膠回收；(c)將回收后的產物于4°C與多克隆位點兩端具有T7，SP6啟動子的載體進行連接;(d)將連接好的質粒轉化細菌后，細菌培養后進行測序。所述步驟(3)按照如下步驟進行:(a)步驟(2)的到的細菌測序正確后，經判斷確認KCC2探針序列插入載體的順序是反向的；(b)需要使用Xba I限制性內切酶對質粒進行酶切；(c)將酶切產物用TIANGEN膠回收試劑盒進行膠回收；(d)用T7RNA聚合酶對探針進行體外轉錄標記。所述步驟(4)按照如下步`驟進行:(a)將小鼠用0.4%戊巴比妥鈉深麻后，經左心室插管至升主動脈，用0.0lmol/L的DEPC-PBS的快速沖洗去除血液，再以4%多聚甲醛灌注固定；(b)取材后進行腦組織的后固定:于4°C，用4%的多聚甲醛后固定24小時；(c)將固定好的組織進行切片:將組織切成25 30 μ m組織切片，并將切好的切片保存與DEPC-PBS中，放于4°C冰箱備用；(d)將切好的組織片用DEPC-PBS清洗I次，室溫，每次5分鐘；(e)將上述清洗過的片子用5xSSC清洗2次，室溫，每次5分鐘；(f)將5xSSC清洗后的組織片浸入預雜交液中，于55°C，在雜交爐孵育I小時；(g)將預雜交孵育后的組織切片浸入雜交液中，于55°C，在雜交爐中孵育16-20小時；(h)雜交后用IxSSC洗滌雜交的組織切片，37°C，2次，每次10分鐘；⑴用2xSSC洗滌上述的組織切片，37°C，2次，每次10分鐘；(j)用 10ug/ml 的 RNase A 處理，37°C , I 次，每次 3O 分鐘；(k)用2xSSC洗滌上述的組織切片，室溫，I次，每次10分鐘；(I)用PBS洗滌上述的組織切片，室溫，I次，每次10分鐘；(m)按1:2000的抗體效價,在PBS溶液中加入Ant1-Digoxigenin -AP抗體,對洗滌后的組織切片進行孵育，室溫，放置過夜；(η)將經過上步抗體孵育的組織片進行PBS的洗滌，于室溫，清洗3次，每次10分鐘；(ο)用TS9.5洗滌上述PBS洗滌后的組織片，室溫，清洗2次，每次15分鐘；(P)將上述切片放于NBT-BCIP反應液中避光孵育4飛小時，在此過程中觀察切片呈色強度；(q)當呈色完成后，將切片用PBS清洗3次，室溫，每次10分鐘；
(r)將上述洗漆后切片表于載玻片上；(s)晾干切片，再經過二甲苯脫色，封片，以備觀察。本發明的有益效果是:本發明對活體動物建立模型后進行灌注、取材、切片，通過地高辛標記的cRNA探針與組織中KCC2基因的mRNA發生特異性的結合，從而方便、準確的觀察到組織中KCC2基因mRNA水平的變化。本發明使用的KCC2的探針序列，對KCC2基因的顯示有明確的特異性，實現了對KCC2基因mRNA水平的顯示作用。


圖1-A為腦部切片的40倍放大特異效果圖；圖1-B為腦部切片的400倍放大特異效果圖。
具體實施例方式下面對本發明做進一步詳細描述:KCC2基因cRNA原位雜交的探針的設計方法，按照如下步驟:(I)根據KCC 2的Gene bank序列我們設計了 KCC2特異的引物，并且此對引物擴增出518bp的KCC2片段作為KCC2特異的探針序列；(2)構建KCC2的cRNA原位雜交的探針質粒；將探針質粒轉化細菌后，細菌培養后進行測序；(3)制備KCC2的cRNA原位雜交探針；(4)檢測KCC2的cRNA探針的原位雜交。探針的設計:根據KCC2的Gene bank序列我們設計了 KCC2特異的引物，并且此對引物擴增出518bp的KCC2片段作為KCC2特異的探針序列。KCC2特異的引物如下:上游引物是5’CTA CTT CAC CCT GCT CGT TG 3’ ；下游引物是5’GCA CAA GCC AAG TTC ACA AA 3’。KCC2特異的探針序列:5' tt ccaggttatg agtgtggtgt caggcttcag tcctcttatc agtgctgggattttctctgccacactttcc tctgccctgg catctctcgt cagtgcccca aaagtgtttcaggctttatgcaaagacaat atctatcctg gaattgcaat ttttggaaag ggctatggcaagaacaacgagcccctgcga ggatattttc ttacctttgg cattgcgtta gcttttattc taattgcggagttgaacgtcattgccccaa tcatttccaa ctttttcctg gcatcatacg ctctcatcaa cttctcggtgtttcacgcttcgctggccaa ttcccctgga tggaggccaa gcttcaagta ctacaacatgtgggcgtctctggccggggc aatcctatgt tgtgttgtca tgtttatcat caattggtgggcagcgcttttgaccaacgt cattgtctta tccctttaca tctacgtcag ctacaaaaaaccagatgtgaattggggttc gtcaac 3’ 。KCC2的cRNA原位雜交的探針質粒的構建:1.將小鼠的cDNA用設計的引物進行PCR擴增。2.將PCR產物用TIANGEN膠回收試劑盒進行膠回收。
3.將回收后的產物于4°C與多克隆位點兩端具有T7，SP6啟動子的載體進行連接。4.將連接好的質粒轉化細菌后，搖菌培養送金斯瑞公司進行測序。KCC2的cRNA原位雜交探針的制備:1.測序正確后，經判斷確認KCC2探針序列插入載體的順序是反向的。2.需要使用Xba I限制性內切酶對質粒進行酶切，3.將酶切產物用TIANGEN膠回收試劑盒進行膠回收。4.用T7 RNA聚合酶對探針進行體外轉錄標記，體外轉錄的試劑盒(AmbionMEGAscript)是Ambion公司的產品。KCC2的cRNA探針的原位雜交檢測:將小鼠用0.4%戊巴比妥鈉深麻后，經左心室插管至升主動脈，用0.0lmol/L的DEPC-PBS的快速沖洗去除血液，再以4%多聚甲醛灌注固定。取材后進行腦組織的后固定:于4°C，用4%的多聚甲醛后固定24小時。將固定好的組織進行切片:將組織切成25 30 μ m組織切片，并將切好的切片保存與DEPC-PBS中，放于4°C冰箱備用。將切好的組織片用DEPC-PBS清洗I次，室溫，每次5分鐘。1.將上述清洗過的片子用5xSSC清洗2次，室溫，每次5分鐘。

2.將5xSSC清洗后的組織片浸入預雜交液中，于55°C，在雜交爐孵育I小時。3.將預雜交孵育后的組織切片浸入雜交液中，于55°C，在雜交爐中孵育16-20小時。4.雜交后用IxSSC洗滌雜交的組織切片，37°C，2次，每次10分鐘。5.用2xSSC洗滌上述的組織切片，37°C，2次，每次10分鐘。6.用 10ug/ml 的 RNase A 處理，37°C，I 次，每次 30 分鐘。7.用2xSSC洗滌上述的組織切片，室溫，I次，每次10分鐘。8.用PBS洗滌上述的組織切片，室溫，I次，每次10分鐘。9.按1:2000的抗體效價,在PBS溶液中加入Ant1-Digoxigenin -AP抗體,對洗滌后的組織切片進行孵育，室溫，放置過夜。10.將經過上步抗體孵育的組織片進行PBS的洗滌，于室溫，清洗3次，每次10分鐘。11.用TS9.5洗滌上述PBS洗滌后的組織片，室溫，清洗2次，每次15分鐘。12.將上述切片放于NBT-BCIP反應液中避光孵育4飛小時，在此過程中觀察切片
呈色強度。13.當呈色完成后，將切片用PBS清洗3次，室溫，每次10分鐘。14.將上述洗滌后切片表于載玻片上。15.晾干切片，再經過二甲苯脫色，封片，以備觀察。參見圖1-A和圖1-B，圖中顯示本發明的特異性效果。圖中所示組織切片為對小鼠腦進行灌注、取材、切片后，通過地高辛標記的cRNA探針與組織中KCC2基因的mRNA發生特異性的結合，探針標記后的KCC2基因的mRNA顯示為藍色斑點。為了更好地觀察結果，切片中所有神經元(即神經系統細胞)均被襯染為棕色。圖1-A為腦部切片的40倍放大。可見，腦內(具體是黑質部分)所有神經元上均可見藍色顆粒，即可見探針標記的KCC2基因的mRNA。圖1-A中的黑框部位再繼續放大，顯示為圖1_B ;圖1-B是腦部切片的400倍放大。圖1-B可見，星號即為棕色襯染的神經元，黑色箭頭所指即為探針標記的KCC2基因的mRNA。由以上圖1-A和1-B的染色結果可以發現，本發明所采用的探針能夠實現方便、準確地觀察到組織中KCC2基因mRNA水平。本發明使用的KCC2的探針序列，對KCC2基因的顯示有明確的特異性，實現了對KCC2基因mRNA水平的顯示作用。以上所述，僅是本發明的較佳實施例而已，并非對本發明作任何形式上的限制，雖然本發明已以較佳實施例 揭露如上，然而并非用以限定本發明，任何熟悉本專業的技術人員，在不脫離本發明技術方案范圍內，當可利用上述揭示的方法及技術內容作出些許的更動或修飾為等同變化的等效實施例，但凡是未脫離本發明技術方案的內容，依據本發明的技術實質對以上實施例所作的任何簡單修改、等同變化與修飾，仍屬于本發明技術方案的范圍內。
權利要求
1.一種KCC2基因cRNA原位雜交的探針，該探針的序列為: 5’ 11 ccaggttatg agtgtggtgt caggcttcag tcctcttatc agtgctgggattttctctgccacactttcc tctgccctgg catctctcgt cagtgcccca aaagtgtttcaggctttatgcaaagacaat atctatcctg gaattgcaat ttttggaaag ggctatggcaagaacaacgagcccctgcga ggatattttc ttacctttgg cattgcgtta gcttttattc taattgcggagttgaacgtcattgccccaa tcatttccaa ctttttcctg gcatcatacg ctctcatcaa cttctcggtgtttcacgcttcgctggccaa ttcccctgga tggaggccaa gcttcaagta ctacaacatgtgggcgtctctggccggggc aatcctatgt tgtgttgtca tgtttatcat caattggtgggcagcgcttttgaccaacgt cattgtctta tccctttaca tctacgtcag ctacaaaaaaccagatgtgaattggggttc gtcaac 3’ 。
2.如權利要求1所述探針的設計方法，其特征在于: (1)根據KCC2的Genebank序列設計KCC2特異的引物，并且此對引物擴增出518bp的KCC2片段作為KCC2特異的探針序列； (2)構建KCC2的cRNA原位雜交的探針質粒；將探針質粒轉化細菌后，細菌培養后進行測序； (3)制備KCC2的cRNA原位雜交探針； (4)檢測KCC2的cRNA探針的原位雜交。
3.如權利要求2所述的設計方法，其特征在于，所述步驟(I)中KCC2特異的引物是:上游引物是 5’CTA CTT CAC CCT GCT CGT TG 3’ ； 下游引物是 5，GCA CAA GCC AAG TTC ACA AA 3’。
4.如權利要求2所述的設計方法，其特征在于，所述步驟(2)按照如下步驟進行: (a)將小鼠的cDNA用KCC2特異的引物進行PCR擴增； (b)將PCR產物用TIANGEN膠回收試劑盒進行膠回收； (c)將回收后的產物于4°C與多克隆位點兩端具有T7、SP6啟動子的載體進行連接； (d)將連接好的質粒轉化細菌后，細菌培養后進行測序。
5.如權利要求2所述的設計方法，其特征在于，所述步驟(3)按照如下步驟進行: (a)步驟(2)得到的細菌測序正確后，經判斷確認KCC2探針序列插入載體的順序是反向的； (b)需要使用XbaI限制性內切酶對質粒進行酶切； (c)將酶切產物用TIANGEN膠回收試劑盒進行膠回收； (d)用T7RNA聚合酶對探針進行體外轉錄標記。
6.如權利要求2所述的設計方法，其特征在于，所述步驟(4)按照如下步驟進行: (a)將小鼠用0.4%戍巴比妥鈉深麻后，經左心室插管至升主動脈,用0.0lmol/L的DEPC-PBS的快速沖洗去除血液，再以4%多聚甲醛灌注固定；所述的0.0lmol/L DEPC-PBS是2.9克磷酸氫二鈉,0.29克磷酸二氫鈉,9.0克氯化鈉用超純水定容至IL后，再加入體積百分比為0.1%的DEPClml過夜放 置后，高壓滅菌制成的磷酸鹽緩沖液；所述4%的多聚甲醛是40.0克多聚甲醛加入500.0ml蒸餾水加熱使之解聚溶解后，再加入500.0ml的0.2mol/L PB緩沖液定容至IOOOml ;所述0.2mol/L PB緩沖液是用29.01克磷酸氫二鈉，2.96克磷酸二氫鈉加超純水定容至500ml ；(b)取材后進行腦組織的后固定:于4°C，用4%的多聚甲醛后固定24小時； (c)將固定好的組織進行切片:將組織切成25 30μπι組織切片，并將切好的切片保存與0.0lmol/L的DEPC-PBS中，放于4°C冰箱備用； (d)將切好的組織片用0.0lmol/L的DEPC-PBS清洗I次，室溫，每次5_10分鐘； (e)將上述清洗過的片子用5xSSC清洗2次，室溫，每次5-10分鐘；所述5x SSC是由.20x SSC用超純水稀釋的，20x SSC為一種緩沖液； (f)將5xSSC清洗后的組織片浸入預雜交液中，于55°C，在雜交爐孵育1-2小時；所述預雜交液是由5ml的去離子甲酰胺,2.5ml的20x SSC溶液,200 μ I的50x DenhardtJ s溶液，50 μ I的濃度為200mg/ml的Heperine溶液，100 μ I的濃度為10mg/ml的tRNA溶液，.100 μ I的濃度為10%的CHAPS溶液，100 μ I的濃度為10%的Tween-20溶液，100 μ I的濃度為0.5mol/L的EDTA溶液和1.85ml的DEPC-H2O混合配置而成； (g)將預雜交孵育后的組織切片浸入雜交液中，于55°C，在雜交爐中孵育16-20小時；所述雜交液是上述預雜交液中加入終濃度為1.0ug/ml的cRNA探針配置成的； (h)雜交后用IxSSC洗滌雜交的組織切片，37°C，2次，每次10分鐘； (i)用2xSSC洗滌上述的組織切片，37°C，2次，每次10-15分鐘；(j)用 10ug/ml 的 RNase A 處理，37°C，I 次，每次 30-40 分鐘； (k)用2x SSC洗滌上述的組織切片，室溫，I次，每次10分鐘； (I)用0.01mol/L PBS洗滌上述的組織切片，室溫，I次，每次10分鐘；所述0.01mol/LPBS是2.9克磷酸氫二鈉，0.29克磷酸二氫鈉，9.0克氯化鈉用超純水定容至IL配置的磷酸緩沖液； (m)按1:2000的抗體效價,在PBS溶液中加入Ant1-Digoxigenin - AP抗體,對洗漆后的組織切片進行孵育，室溫，放置過夜； (η)將經過上步抗體孵育的組織片進行PBS的洗滌，于室溫，清洗3次，每次10-15分鐘； (ο)用TS9.5洗滌上述PBS洗滌后的組織片，室溫，清洗2次，每次15-20分鐘；所述TS9.5為是由終濃度為摩爾濃度為0.lmol/LTris-HCl、PH9.5，摩爾濃度為0.lmol/L NaCl溶液和摩爾濃度為50mmol/L MgCL2用超純水配制而成； (P)將上述切片放于NBT-BCIP反應液中避光孵育4飛小時，在此過程中觀察切片呈色強度；所述NBT-BCIP是一種Roche公司生產的呈色反應液； (q)當呈色完成后，將切片用PBS清洗3次，室溫，每次10-15分鐘； (r)將上述洗滌后切片表于載玻片上； (s)晾干切片，再經過二甲苯脫色，封片，以備觀察。
全文摘要
本發明公開了一種KCC2基因cRNA原位雜交的探針及其設計方法，本發明通過對動物建立模型后進行灌注、取材、切片，通過地高辛標記的cRNA探針與組織中KCC2基因的mRNA發生特異性的結合，從而方便、準確的觀察到組織中KCC2基因mRNA水平的變化。本發明使用的KCC2的探針序列，對KCC2基因的顯示有明確的特異性，實現了對KCC2基因mRNA水平的顯示作用。
文檔編號C12N15/11GK103074331SQ20121033266
公開日2013年5月1日 申請日期2012年9月10日 優先權日2012年9月10日
發明者楊雁靈, 王亞云, 魏燕燕, 郭保霖, 隋秉東, 鄭晨曦, 李云慶 申請人:中國人民解放軍第四軍醫大學