專利名稱：一種黃瓜雌性系育種的分子標(biāo)記輔助選擇方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種黃瓜雌性系育種的分子標(biāo)記輔助選擇方法，屬于蔬菜分子遺傳育種技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
黃瓜是我國主要蔬菜作物之一，具有極高的經(jīng)濟(jì)和社會價(jià)值。黃瓜植株性型多樣，有純雄株、兩性花株、雌雄同株、雄花兩性花株和全雌株等多種類型。限制黃瓜經(jīng)濟(jì)產(chǎn)量的首要因子是植株雌雄花比例，因?yàn)槌浦晖?，其它性型植株都表現(xiàn)為枝葉繁茂、源大庫少、經(jīng)濟(jì)系數(shù)低。雌性系黃瓜是指植株只長雌花而不長雄花或長極少量雄花的品系。此品系往往表現(xiàn)出早熟、瓜密、采瓜期集中、豐產(chǎn)性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。利用雌性系作母本配制的一代雜種也多表現(xiàn)出早熟、采瓜期集中和豐產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)。同時(shí)，利用雌性系制備雜種一代無需人工授粉，節(jié)約了勞動力，降低了制種成本，而且制成的一代雜種純度很高。因此，對黃瓜育種來說，雌性系在雜種優(yōu)勢利用以及雜交制種中極具利用價(jià)值，雌性系的選育與應(yīng)用是黃瓜育 種中一項(xiàng)重要的研究內(nèi)容。目前，黃瓜雌性系的選育主要依靠田間開花習(xí)性進(jìn)行表型鑒定，該方法不僅需時(shí)漫長，會消耗大量的人力、物力，而且黃瓜植株性型復(fù)雜，易受外界條件影響而發(fā)生變化，所以從表型上進(jìn)行全雌性基因的選擇效率不高，雌性系的選育難度大、成功率低，選育的黃瓜雌性系品種大都存在雌性不穩(wěn)定，易受栽培環(huán)境影響等弊端。分子標(biāo)記的出現(xiàn)，為雌性系的選育提供了新的途徑，利用分子標(biāo)記不僅可以定位目標(biāo)基因，也可以利用與目標(biāo)基因緊密連鎖的分子標(biāo)記追蹤目標(biāo)基因，實(shí)現(xiàn)對目標(biāo)性狀的間接選擇，這就是所謂的分子標(biāo)記輔助選擇(Molecular Marker Assisted Selection)。與傳統(tǒng)表型選擇相比,它具有以下優(yōu)點(diǎn)
(I)對目標(biāo)性狀的選擇不受基因表達(dá)和環(huán)境因素的影響；(2)可在早代和植株生長的任何階段進(jìn)行選擇，大大縮短了育種年限；(3)在分離世代能夠快速地鑒定植株的基因型，不受基因顯隱性的影響；(4)可以打破目標(biāo)基因與不利基因的連鎖。其中，SSR分子標(biāo)記是利用真核生物基因組中存在的大量微衛(wèi)星重復(fù)序列設(shè)計(jì)引物，通過PCR擴(kuò)增串聯(lián)的重復(fù)序列，依據(jù)微衛(wèi)星的重復(fù)次數(shù)在同一物種不同基因型間的差異，揭示長度多態(tài)性。由于SSR標(biāo)記在單個座位上檢測到的多態(tài)性遠(yuǎn)高于其它幾種分子標(biāo)記，且廣泛、隨機(jī)、均勻地分布于整個基因組，具共顯性遺傳，分布廣、穩(wěn)定性和多態(tài)率高，操作簡單、重復(fù)性好、對DNA質(zhì)量要求較低等特點(diǎn)，能準(zhǔn)確高效地鑒別大量等位基因，應(yīng)用與目的基因相連鎖的分子標(biāo)記進(jìn)行輔助育種能直接從基因型上對后代單株進(jìn)行選擇，實(shí)現(xiàn)苗期的性型鑒定，提高選擇效率及準(zhǔn)確性，從而加快黃瓜雌性系育種進(jìn)程，在黃瓜雌性系育種中具有極高的應(yīng)用價(jià)值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有黃瓜雌性系育種中常規(guī)采用的田間鑒定與植株表型相結(jié)合方法所存在的工作量大、周期長、易受環(huán)境條件的影響、育種效率低、成本高等缺陷，提供一種在黃瓜雌性系育種進(jìn)程中，用于早期分離世代與苗期雌性系鑒定，能準(zhǔn)確、快速、高效選擇出雌性系材料的分子標(biāo)記輔助選擇的方法。本發(fā)明目的通過以下技術(shù)方案得以實(shí)現(xiàn)所述的黃瓜雌性系育種的分子標(biāo)記輔助選擇方法，其特征在于所述的方法按以下步驟進(jìn)行(I)待檢測黃瓜葉片樣品的采集將待檢測黃瓜材料播種,待1-2片真葉期時(shí)，取植株頂部較為幼嫩的葉片，每份O. 5g，采集后現(xiàn)用或在-20°c下冷凍保存；(2)黃瓜對照樣品葉片的采集將黃瓜全雌品種240-1-2-2-3-1自交系、弱雌品種3-5-1-3-2-1-1-1-1-2自交系材料播種，待1_2片真葉期時(shí)，取植株頂部較為幼嫩的葉片，每份O. 5g，采集后現(xiàn)用或在-20°C下冷凍保存；(3)樣品基因組DNA提取用CTAB法提取每株葉片DNA ;稱取150mg新鮮的葉片，連同適配器、研磨球在液氮中預(yù)冷，使用麗301細(xì)胞破碎儀研磨成粉末狀；研磨程序設(shè)定 為研磨時(shí)間I. 5min，研磨頻率20Hz。研磨后加入2XCTAB提取緩沖液700 μ I (事先預(yù)熱至65°C)浸透粉末并倒轉(zhuǎn)離心管，使粉末充分散開，于65°C水浴保溫30min，其間輕柔混合2-3次；取出離心管，冷至室溫，加入等體積的氯仿/異戊醇，輕緩顛倒混勻，靜置lOmin，12000rpm離心15min ;轉(zhuǎn)移上清于另一離心管中，加入2/3體積的預(yù)冷異丙醇，輕緩顛倒混勻，室溫放置15min, 12000rpm離心IOmin,去上清,將離心管倒置于吸水紙上,控干上清；用700 μ I 70%的乙醇洗滌沉淀2次，室溫下微干，加入300 μ I去離子水溶解沉淀，加入等體積的氯仿/異戊醇抽提2次，吸取上清，加入1/5體積的NaAc，2. 5倍體積的預(yù)冷無水乙醇沉淀DNA，放置Ih左右，12000rpm離心lOmin，去上清；用70(^ I 70%的乙醇洗滌沉淀2次，通風(fēng)干燥或者自然干燥；加入30 μ I去離子水溶解DNA，保存于-80°C超低溫冰箱備用；制1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行檢測；用SMA3000微量紫外分光光度計(jì)測定提取DNA的濃度和純度，將DNA稀釋到所需濃度，分裝，置于-20°C保存?zhèn)溆茫?4)獲得與黃瓜全雌性相關(guān)基因的分子標(biāo)記對黃瓜全雌品種240-1-2-2-3-1自交系和弱雌品種3-5-1-3-2-1-1-1-1-2自交系及其F2代DNA樣本進(jìn)行SSR分子標(biāo)記分析；選用699對SSR引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增反應(yīng)總體系為20 μ 1，擴(kuò)增反應(yīng)體系成分為黃瓜基因組 DNA20ng，lOpmol/μ I 引物各 O. 4 μ 1,2. 5mM Mg2+2 μ l,2mM dNTPl μ l,5U/y I TaqDNA聚合酶O. I μ I，10 X buffer 2 μ I，加無菌重蒸水補(bǔ)齊至20 μ I ;(5)樣品鑒定利用獲得的標(biāo)記引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳分離分析，獲得多態(tài)性片段，根據(jù)凝膠上譜帶的相對位置，選擇電泳帶型與供體親本相同的單株，結(jié)合田間鑒定和其他育種目標(biāo)性狀的選擇；選擇出具有全雌性特征的優(yōu)良單株。步驟(3)中，研磨程序設(shè)定為研磨時(shí)間I. 5min，研磨頻率20Hz ;研磨后加入事先預(yù)熱至65°C的2XCTAB提取緩沖液700 μ I浸透粉末；利用正交試驗(yàn)，建立黃瓜全雌性基因連鎖特異片段的最佳擴(kuò)增體系。步驟(4)中，PCR反應(yīng)擴(kuò)增程序?yàn)?4°C預(yù)變性5min，94°C變性30sec，按特定引物特定溫度退火lmin，72°C延伸lmin，35個循環(huán)，72°C延伸IOmin ;在2(^ I的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中加入8 μ I Loading Buffer 94°C變性5min,迅速置于冰上冷卻；每樣品各取6 μ I上樣于6%變性聚丙烯酰胺凝膠上，在恒定100W功率下電泳至溴酚藍(lán)到達(dá)凝膠另一端；銀染后，在膠片觀察燈上照相、觀察，對在親本間表現(xiàn)出共顯性分離的引物利用F2代強(qiáng)雌和弱雌混合基因池進(jìn)行再次篩選，從而獲得與黃瓜全雌性緊密連鎖的一個SSR多態(tài)性片段，其標(biāo)記引物為 CSWCT25。本發(fā)明的有益效果是(I)本發(fā)明采用了對目標(biāo)材料DNA進(jìn)行PCR及SSR分子標(biāo)記技術(shù)，該技術(shù)具有高效和低成本的特點(diǎn)，適合對大量樣本材料進(jìn)行分析與鑒定，大大提高了選擇效率；(2)本發(fā)明可在任何時(shí)期對黃瓜育種材料進(jìn)行準(zhǔn)確、快速的檢測，周年均可在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行，不受環(huán)境條件的影響，且不影響植株的正常生長；本發(fā)明分子標(biāo)記輔助選擇黃瓜雌性系育種方法，與常規(guī)育種、鑒定方法相比，具有周期短、成本低、操作簡便等優(yōu)點(diǎn)。


圖I為CSWCT25標(biāo)記引物在親本及F2群體中部分單株P(guān)CR擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明，但以下描述不對本發(fā)明的保護(hù)范圍構(gòu)成任何意義上的限定。本發(fā)明用于黃瓜雌性系分子標(biāo)記輔助選擇的PCR擴(kuò)增及SSR標(biāo)記引物(CSWCT25 )，其中正向引物序列5 ' -AAAGAAATTAAGTCAATCAAACCG-3 '，反向引物序列5' -CCCACCAATAGTAAAATTATACAT-3'。本發(fā)明所述的黃瓜雌性系育種的分子標(biāo)記輔助選擇方法，它按以下步驟進(jìn)行( I)待檢測黃瓜葉片樣品的采集將待檢測黃瓜材料播種,待1-2片真葉期時(shí)，取植株頂部較為幼嫩的葉片，每份O. 5g，采集后現(xiàn)用或在-20°c下冷凍保存；(2)黃瓜對照樣品葉片的采集將黃瓜全雌品種240-1-2-2-3-1自交系、弱雌品種3-5-1-3-2-1-1-1-1-2自交系材料播種，待1_2片真葉期時(shí)，取植株頂部較為幼嫩的葉片，每份O. 5g，采集后現(xiàn)用或在-20°C下冷凍保存；(3)樣品基因組DNA提取用CTAB法提取每株葉片DNA ;稱取150mg新鮮的葉片，連同適配器、研磨球在液氮中預(yù)冷，使用麗301細(xì)胞破碎儀研磨成粉末狀；研磨程序設(shè)定為研磨時(shí)間I. 5min，研磨頻率20Hz。研磨后加入2X CTAB提取緩沖液700 μ I (事先預(yù)熱至65°C)浸透粉末并倒轉(zhuǎn)離心管，使粉末充分散開，于65°C水浴保溫30min，其間輕柔混合2-3次；取出離心管，冷至室溫，加入等體積的氯仿/異戊醇，輕緩顛倒混勻，靜置lOmin，12000rpm離心15min ;轉(zhuǎn)移上清于另一離心管中，加入2/3體積的預(yù)冷異丙醇，輕緩顛倒混勻，室溫放置15min, 12000rpm離心lOmin,去上清,將離心管倒置于吸水紙上,控干上清；用700 μ I 70%的乙醇洗滌沉淀2次，室溫下微干，加入300 μ I去離子水溶解沉淀，加入等體積的氯仿/異戊醇抽提2次，吸取上清，加入1/5體積的NaAc，2. 5倍體積的預(yù)冷無水乙醇沉淀DNA，放置Ih左右，12000rpm離心lOmin，去上清；用70(^ I 70%的乙醇洗滌沉淀2次，通風(fēng)干燥或者自然干燥；加入30 μ I去離子水溶解DNA，保存于-80°C超低溫冰箱備用；制1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行檢測；用SMA3000微量紫外分光光度計(jì)測定提取DNA的濃度和純度，將DNA稀釋到所需濃度，分裝，置于-20°C保存?zhèn)溆茫?4)獲得與黃瓜全雌性相關(guān)基因的分子標(biāo)記對黃瓜全雌品種240-1-2-2-3-1自交系和弱雌品種3-5-1-3-2-1-1-1-1-2自交系及其F2代DNA樣本進(jìn)行SSR分子標(biāo)記分析；選用699對SSR引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增反應(yīng)總體系為20 μ 1，擴(kuò)增反應(yīng)體系成分為黃瓜基因組 DNA20ng，lOpmol/μ I 引物各 O. 4 μ 1,2. 5mM Mg2+2 μ l,2mM dNTPl μ l,5U/y I TaqDNA聚合酶O. I μ I，10 X buffer 2 μ I，加無菌重蒸水補(bǔ)齊至20 μ I ;(5)樣品鑒定利用獲得的標(biāo)記引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳分離分析，獲得多態(tài)性片段，根據(jù)凝膠上譜帶的相對位置，選擇電泳帶型與供體親本相同的單株，結(jié)合田間鑒定和其他育種目標(biāo)性狀的選擇；選擇出具有全雌性特征的優(yōu)良單株。步驟(3)中，研磨程序設(shè)定為研磨時(shí)間I. 5min，研磨頻率20Hz ;研磨后加入事先預(yù)熱至65°C的2XCTAB提取緩沖液700 μ I浸透粉末；利用正交試驗(yàn)，建立黃瓜全雌性基因連鎖特異片段的最佳擴(kuò)增體系。步驟(4)中，PCR反應(yīng)擴(kuò)增程序?yàn)?4°C預(yù)變性5min，94°C變性30sec，按特定引物·特定溫度退火lmin，72°C延伸lmin，35個循環(huán)，72°C延伸IOmin ;在2(^ I的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中加入8 μ I Loading Buffer 94°C變性5min,迅速置于冰上冷卻；每樣品各取6 μ I上樣于6%變性聚丙烯酰胺凝膠上，在恒定100W功率下電泳至溴酚藍(lán)到達(dá)凝膠另一端；銀染后，在膠片觀察燈上照相、觀察，對在親本間表現(xiàn)出共顯性分離的引物利用F2代強(qiáng)雌和弱雌混合基因池進(jìn)行再次篩選，從而獲得與黃瓜全雌性緊密連鎖的一個SSR多態(tài)性片段，其標(biāo)記引物為 CSWCT25。實(shí)施例I :(利用分子標(biāo)記輔助選擇方法對雜交后代材料的抗性檢測I)(I)待檢測黃瓜葉片樣品的采集將待檢測黃瓜材料Η174-1-2播種，待1_2片真葉期時(shí)，取植株頂部較為幼嫩的葉片，每份O. 5g，采集后現(xiàn)用或在-20°C下冷凍保存；(2)黃瓜對照樣品葉片的采集將黃瓜全雌品種240-1-2-2-3-1自交系、弱雌品種3-5-1-3-2-1-1-1-1-2自交系材料播種，待1_2片真葉期時(shí)，取植株頂部較為幼嫩的葉片，每份O. 5，采集后現(xiàn)用或在-20°C下冷凍保存；(3)樣品基因組DNA提取用CTAB法提取每株葉片DNA。稱取150mg新鮮的葉片，連同適配器、研磨球在液氮中預(yù)冷，使用麗301細(xì)胞破碎儀研磨成粉末狀。研磨程序設(shè)定為研磨時(shí)間I. 5min，研磨頻率20Hz。研磨后加入2 X CTAB提取緩沖液700 μ I (事先預(yù)熱至65°C)浸透粉末并倒轉(zhuǎn)離心管，使粉末充分散開，于65°C水浴保溫30min，其間輕柔混合
2-3次。取出離心管，冷至室溫，加入等體積的氯仿/異戊醇，輕緩顛倒混勻，靜置lOmin。12000rpm離心15min。轉(zhuǎn)移上清于另一離心管中，加入2/3體積的預(yù)冷異丙醇，輕緩顛倒混勻，室溫放置15min。12000rpm離心lOmin,去上清,將離心管倒置于吸水紙上,控干上清。用700 μ I 70%的乙醇洗滌沉淀2次，室溫下微干。加入300 μ I去離子水溶解沉淀。加入等體積的氯仿/異戊醇抽提2次。吸取上清，加入1/5體積的NaAc，2. 5倍體積的預(yù)冷無水乙醇沉淀DNA，放置Ih左右，12000rpm離心lOmin，去上清。用700 μ I 70%的乙醇洗滌沉淀2次，通風(fēng)干燥或者自然干燥。加入30 μ I去離子水溶解DNA，保存于-80°C超低溫冰箱備用。制1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行檢測。用SMA3000微量紫外分光光度計(jì)測定提取DNA的濃度和純度，將DNA稀釋到所需濃度，分裝，置于_20°C保存?zhèn)溆茫?4) PCR擴(kuò)增及擴(kuò)增產(chǎn)物檢測對黃瓜全雌品種240-1-2-2-3-1自交系和弱雌品種3-5-1-3-2-1-1-1-1-2自交系及H174-1-2的DNA樣本進(jìn)行SSR分子標(biāo)記分析，標(biāo)記引物為CSWCT25。PCR擴(kuò)增反應(yīng)總體系為20 μ 1，擴(kuò)增反應(yīng)體系成分為黃瓜基因組DNA20ng，lOpmol/μ I 引物各 O. 4 μ 1,2. 5mM Mg2+2 μ l,2mM dNTPl μ l,5U/y I Taq DNA 聚合酶 O. I μ 1，IOXbuffer 2 μ I,加無菌重蒸水補(bǔ)齊至20 μ I。PCR反應(yīng)擴(kuò)增程序?yàn)?4°C預(yù)變性5min，94°C變性30seC，按特定引物特定溫度退火lmin，72°C延伸lmin, 35個循環(huán)，72°C延伸IOmin ;在20μ I的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中加入8 μ ILoading Buffer 94°C變性5min，迅速置于冰上冷卻。每樣品各取6 μ I上樣于6%變性聚丙烯酰胺凝膠上，在恒定100W功率下電泳至溴酚藍(lán)到達(dá)凝膠另一端。銀染后，在膠片觀察燈上照相、觀察并記錄結(jié)果；(5)樣品鑒定利用獲得的標(biāo)記引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳分離分析，獲得多態(tài)性片段，Η174-1-2凝膠上譜帶的相對位置，與240-1-2-2-3-1自交系擴(kuò)增出的片段相同，說明該品種是全雌性品種，結(jié)合田間鑒定和其他育種目標(biāo)性狀的選擇，與田間接種鑒定結(jié)果完全符合，說明本發(fā)明所建立的檢測方法能準(zhǔn)確、快速的鑒定出 黃瓜全雌性優(yōu)良單株。實(shí)施例2 (利用分子標(biāo)記輔助選擇方法對雜交后代材料的抗性檢測2)(I)待檢測黃瓜葉片樣品的采集將待檢測黃瓜材料Η158-1-1-2-2播種，待1_2片真葉期時(shí)，取植株頂部較為幼嫩的葉片，每份O. 5g，采集后現(xiàn)用或在-20°C下冷凍保存；(2)黃瓜對照樣品葉片的采集將黃瓜全雌品種240-1-2-2-3-1自交系、弱雌品種
3-5-1-3-2-1-1-1-1-2自交系材料播種，待1_2片真葉期時(shí)，取植株頂部較為幼嫩的葉片，每份O. 5g，采集后現(xiàn)用或在-20°C下冷凍保存；(3)樣品基因組DNA提取用CTAB法提取每株葉片DNA。稱取150mg新鮮的葉片，連同適配器、研磨球在液氮中預(yù)冷，使用麗301細(xì)胞破碎儀研磨成粉末狀。研磨程序設(shè)定為研磨時(shí)間I. 5min，研磨頻率20Hz。研磨后加入2 X CTAB提取緩沖液700 μ I (事先預(yù)熱至65°C)浸透粉末并倒轉(zhuǎn)離心管，使粉末充分散開，于65°C水浴保溫30min，其間輕柔混合
2-3次。取出離心管，冷至室溫，加入等體積的氯仿/異戊醇，輕緩顛倒混勻，靜置lOmin。12000rpm離心15min。轉(zhuǎn)移上清于另一離心管中，加入2/3體積的預(yù)冷異丙醇，輕緩顛倒混勻，室溫放置15min。12000rpm離心lOmin,去上清,將離心管倒置于吸水紙上,控干上清。用700 μ I 70%的乙醇洗滌沉淀2次，室溫下微干。加入300 μ I去離子水溶解沉淀。加入等體積的氯仿/異戊醇抽提2次。吸取上清，加入1/5體積的NaAc，2. 5倍體積的預(yù)冷無水乙醇沉淀DNA，放置Ih左右，12000rpm離心lOmin，去上清。用700 μ I 70%的乙醇洗滌沉淀2次，通風(fēng)干燥或者自然干燥。加入30 μ I去離子水溶解DNA，保存于-80°C超低溫冰箱備用。制1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行檢測。用SMA3000微量紫外分光光度計(jì)測定提取DNA的濃度和純度，將DNA稀釋到所需濃度，分裝，置于_20°C保存?zhèn)溆茫?4)PCR擴(kuò)增及擴(kuò)增產(chǎn)物檢測對黃瓜全雌品種240-1-2-2-3-1自交系和弱雌品種
3-5-1-3-2-1-1-1-1-2自交系及H158-1-1-2-2的DNA樣本進(jìn)行SSR分子標(biāo)記分析，標(biāo)記引物為CSWCT25。PCR擴(kuò)增反應(yīng)總體系為20 μ 1，擴(kuò)增反應(yīng)體系成分為黃瓜基因組DNA20ng，IOpmol/μ I 引物各O. 4 μ 1,2. 5mM Mg2+2 μ l,2mM dNTPl μ l,5U/y I Taq DNA聚合酶0. I μ 1，IOXbuffer 2 μ I,加無菌重蒸水補(bǔ)齊至20 μ I。PCR反應(yīng)擴(kuò)增程序?yàn)?4°C預(yù)變性5min，94°C變性30sec，按特定引物特定溫度退火lmin，72°C延伸lmin, 35個循環(huán)，72°C延伸IOmin ;在20μ I的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中加入8 μ ILoading Buffer 94°C變性5min，迅速置于冰上冷卻。每樣品各取6 μ I上樣于6%變性聚丙烯酰胺凝膠上，在恒定IOOW功率下電泳至溴酚藍(lán)到達(dá)凝膠另一端。銀染后，在膠片觀察燈上照相、觀察并記錄結(jié)果； (5)樣品鑒定利用獲得的標(biāo)記引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳分離分析，獲得多態(tài)性片段，Η158-1-1-2-2凝膠上譜帶的相對位置，與
3-5-1-3-2-1-1-1-1-2自交系擴(kuò)增出的片段相同，說明該品種不是全雌性品種，結(jié)合田間鑒定和其他育種目標(biāo)性狀的選擇，與田間接種鑒定結(jié)果完全符合。
權(quán)利要求
1.ー種黃瓜雌性系育種的分子標(biāo)記輔助選擇方法，其特征在于所述的方法按以下步驟進(jìn)行 (1)待檢測黃瓜葉片樣品的采集將待檢測黃瓜材料播種，待1-2片真葉期時(shí)，取植株頂部較為幼嫩的葉片，每份0. 5g，采集后現(xiàn)用或在-20°C下冷凍保存； (2)黃瓜對照樣品葉片的采集將黃瓜全雌品種240-1-2-2-3-1自交系、弱雌品種.3-5-1-3-2-1-1-1-1-2自交系材料播種，待1-2片真葉期時(shí)，取植株頂部較為幼嫩的葉片，每份0. 5g，采集后現(xiàn)用或在-20°C下冷凍保存； (3)樣品基因組DNA提取用CTAB法提取每株葉片DNA;稱取150mg新鮮的葉片，連同適配器、研磨球在液氮中預(yù)冷，使用MM301細(xì)胞破碎儀研磨成粉末狀；研磨程序設(shè)定為研磨時(shí)間I. 5min，研磨頻率20Hz。研磨后加入2 X CTAB提取緩沖液700 (事先預(yù)熱至65°C)浸透粉末并倒轉(zhuǎn)離心管，使粉末充分散開，于65°C水浴保溫30min，其間輕柔混合2-3次；取出離心管，冷至室溫，加入等體積的氯仿/異戊醇，輕緩顛倒混勻，靜置lOmin，12000rpm離心15min ;轉(zhuǎn)移上清于另ー離心管中，加入2/3體積的預(yù)冷異丙醇，輕緩顛倒混勻，室溫放置15min，12000rpm離心lOmin，去上清，將離心管倒置于吸水紙上，控干上清；用700 U I 70%的こ醇洗滌沉淀2次，室溫下微干，加入300 u I去離子水溶解沉淀，加入等體積的氯仿/異戊醇抽提2次，吸取上清，加入1/5體積的NaAc，2. 5倍體積的預(yù)冷無水こ醇沉淀DNA，放置Ih左右，12000rpm離心lOmin，去上清；用700 70%的こ醇洗滌沉淀2次，通風(fēng)干燥或者自然干燥；加入30 Ul去離子水溶解DNA，保存于-80°C超低溫冰箱備用；制1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行檢測；用SMA3000微量紫外分光光度計(jì)測定提取DNA的濃度和純度，將DNA稀釋到所需濃度，分裝，置于_20°C保存?zhèn)溆茫? (4)獲得與黃瓜全雌性相關(guān)基因的分子標(biāo)記對黃瓜全雌品種240-1-2-2-3-1自交系和弱雌品種3-5-1-3-2-1-1-1-1-2自交系及其F2代DNA樣本進(jìn)行SSR分子標(biāo)記分析；選用699對SSR引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增反應(yīng)總體系為20 yl，擴(kuò)增反應(yīng)體系成分為黃瓜基因組DNA20ng，10pmol/ii I 引物各0.4ii l，2.5mM Mg2+2 u l,2mM dNTP I u l,5U/u I Taq DNA聚合酶0. I u I, IOXbuffer 2 u I,加無菌重蒸水補(bǔ)齊至20 U I ； (5)樣品鑒定利用獲得的標(biāo)記引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳分離分析，獲得多態(tài)性片段，根據(jù)凝膠上譜帶的相對位置，選擇電泳帶型與供體親本相同的單株，結(jié)合田間鑒定和其他育種目標(biāo)性狀的選擇；選擇出具有全雌性特征的優(yōu)良單株。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的黃瓜雌性系育種的分子標(biāo)記輔助選擇方法，其特征在于步驟(3)中,研磨程序設(shè)定為研磨時(shí)間I. 5min,研磨頻率20Hz ;研磨后加入事先預(yù)熱至65°C的2 X CTAB提取緩沖液700 ill浸透粉末；利用正交試驗(yàn)，建立黃瓜全雌性基因連鎖特異片段的最佳擴(kuò)增體系。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的黃瓜雌性系育種的分子標(biāo)記輔助選擇方法，其特征在于步驟(4)中，PCR反應(yīng)擴(kuò)增程序?yàn)?4°C預(yù)變性5min，94°C變性30sec，按特定引物特定溫度退火lmin，72°C延伸lmin，35個循環(huán)，72°C延伸IOmin;在20yl的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中加入8 y ILoading Buffer 94°C變性5min,迅速置于冰上冷卻；姆樣品各取I上樣于6%變性聚丙烯酰胺凝膠上，在恒定100W功率下電泳至溴酚藍(lán)到達(dá)凝膠另一端；銀染后，在膠片觀察燈上照相、觀察，對在親本間表現(xiàn)出共顯性分離的引物利用F2代強(qiáng)雌和弱雌混合基因池進(jìn)行再次篩選，從而獲得與黃瓜全雌性緊密連鎖的ー個SSR多態(tài)性片段，其標(biāo)記引物為CSWCT25。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種黃瓜雌性系育種的分子標(biāo)記輔助選擇方法，該方法是利用黃瓜全雌品種240-1-2-2-3-1自交系、弱雌品種3-5-1-3-2-1-1-1-1-2自交系及其F2代分離群體篩選出與黃瓜全雌性基因緊密連鎖的SSR標(biāo)記引物；通過提取對照品種和待測種子幼苗基因組DNA，利用篩選出的SSR標(biāo)記引物，經(jīng)變性聚丙烯酰胺凝膠電泳、銀染，得到對照與待測樣的凝膠圖譜，根據(jù)凝膠上條帶的相對位置，快速而準(zhǔn)確地檢測黃瓜全雌性基因的存在。本發(fā)明對黃瓜全雌品種240-1-2-2-3-1自交系和弱雌品種3-5-1-3-2-1-1-1-1-2自交系進(jìn)行SSR分子標(biāo)記的篩選可有效開展黃瓜雌性系的分子標(biāo)記輔助選育，提高選擇效率和標(biāo)準(zhǔn)化程度，從而加快育種進(jìn)程。
文檔編號C12Q1/68GK102816860SQ20121033217
公開日2012年12月12日 申請日期2012年9月10日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月10日
發(fā)明者張鵬 申請人:浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院