專利名稱：一種木聚糖酶基因及表達蛋白和應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于基因工程技術領域，具體涉及ー種木聚糖酶基因及其表達蛋白和應用。
背景技術：
半纖維素是植物細胞壁的主要成分，是除纖維素之外自然界中最為豐富的可再生資源。半纖維素一般由木聚糖即以P-D-1，4木糖苷鍵連接起來的一種多聚五碳糖為主鏈，并帶有多種取代基，如阿拉伯糖基，a-葡萄糖醛酸基等。木聚糖徹底降解則得到木糖、阿魏糖、阿拉伯糖等，其中以木糖為主。木聚糖酶是木聚糖降解酶系中的最為關鍵的多糖水解酶，通過隨機切割木聚糖的P -I, 4-糖苷鍵，將木聚糖水解為木寡糖、低聚木糖及少量的木糖和阿拉伯糖。木聚糖酶在造紙紙漿、釀造及飼料エ業等方面已體現顯著的應用價值，因此可作為ー種高效的エ業酶制劑應用于上述幾個方面。耐熱纖維水解酶包括木聚糖酶及葡聚糖酶的開發利用是當今纖維類生物質精煉技術領域的重要發展方向。

發明內容
發明目的針對現有技術中存在的不足，本發明的目的是提供ー種木聚糖酶基因。本發明的另一目的是提供ー種上述木聚糖酶基因表達的適合中溫下半纖維素水解的木聚糖酶。本發明還有一目的是提供上述一種木聚糖酶的應用。技術方案為了實現上述發明目的，本發明采用的技術方案如下
ー種木聚糖酶基因，其DNA序列如SEQ NO :1所示。ー種木聚糖酶基因的表達蛋白，為適合中溫下半纖維素水解的木聚糖酶，其氨基酸序列如SEQ NO 2所示。ー種木聚糖酶基因的表達蛋白，氨基酸序列為SEQ NO :2序列中的氨基酸經過ー個或多個氨基酸殘基的取代、缺失及添加形成的具有木聚糖酶活性的衍生蛋白質。ー種重組載體，在所述的重組載體上克隆有如SEQ NO I所示的DNA序列。ー種重組菌，在所述的重組菌內克隆有如SEQ NO 1所示的DNA序列。一種用于擴增木聚糖酶基因的引物，所使用的引物對為
Tth-I :5’ -GGAATTCCATATGGGACCACAGCCCATGTCGTC-3’ ；
Tth-2 :5’ -CCGCTCGAGCTTGGAAACTGATTCTATTACACTC-3’。上述的木聚糖酶在酶解木聚糖中的應用。酶解反應溫度為60-80°C，PH5. 5-6. 5。所述的木聚糖來源于纖維原料中的半纖維素，包括棒木木聚糖、樺木木聚糖和燕麥木聚糖。
上述的重組載體或重組菌在酶解木聚糖中的應用。有益效果與現有技術相比，本發明所提供的木聚糖酶具有較好的的耐熱性能和略偏酸性PH條件下高活性的特性。在80°C、pH為6. 0的條件下酶活性最高，比酶活達到35 U/mg;該蛋白酶在溫度為60°C-80°C、pH為5. 5-65的范圍內，均具有較高的酶活。該木聚糖酶的耐熱性能較高，在65°C，pH6.0的反應體系中，保溫2h酶活性基本保持不變。上述特性使得本發明得到的木聚糖酶比現有木聚糖酶具有更大的優越性，適用于65°C以上高溫、略偏酸性PH條件下半纖維素的降解，具有潛在的工業應用價值。


圖I 是 Tth xynlOB 蛋白的 SDS-PAGE 圖2是Tth xynlOB蛋白的最適溫度結果 圖3是Tth xynlOB蛋白的最適pH結果 圖4是Tth xynlOB蛋白的熱穩定性結果圖。
具體實施例方式
下面結合具體實施例對本發明做進一步的說明。以下實施例中所使用的材料、試劑等，若無特殊說明，均可從商業途徑獲得。實施例I嗜熱陸地熱泉高溫神袍菌基因組DNA的提取
采用嗜熱陸地熱泉高溫神袍菌Thermo toga thermarum DSM5069 (購自德國微生物菌種保藏中心)新鮮菌體10g，懸于5mL 50mM Tris緩沖溶液中(pH8. O),混勻后在37°C放置20min，然后加入2mL 10%SDS, 55°C放置5min，用等體積的酚-氯仿(24:1)抽提一次，取上清液加入2倍體積的無水乙醇，于_20°C放置30min，4°C 13000rpm離心20min，收集沉淀。沉淀溶于 0. 5mL TE 緩沖液(ρΗ8· O, IOmM Tris, ImM EDTA)，加入 10mg/mL RNase 3 μ L, 37°C保溫I h，用等體積的酚-氯仿(24:1)抽提一次，取上清加入2倍體積的無水乙醇，于-20°C放置30min，4°C 13000rpm離心20min，收集沉淀，真空冷凍干燥，用0. 5mL超純水溶解。實施例2木聚糖酶基因Tth xynlOB的制備
可采用如下方法制備Tth 似基因，也可以采用人工合成的方式得到。認Thermotoga thermarum DSM5069的總DNA (實施例I制備)為模版，用下述引物對進行PCR擴增
Tth-I :5’ -GGAATTCCATATGGGACCACAGCCCATGTCGTC-3’ ；
Tth-2 :5’ -CCGCTCGAGCTTGGAAACTGATTCTATTACACTC-3’ ；
引物合成時，Tth-I引入Nde I酶切位點，Tth-2引入Xho I酶切位點。PCR反應體系如下1 μ L T. iAerfflara 基因組DNA, I μ L Tth-I, I μ L Tth-2, 25 μ LPremix ExTaq, 22 μ L 超純水。PCR 反應條件94°C變性 5min ;94°C變性 30sec，52°C退火 30sec，72°C延伸 3min，30個循環，72°C延伸10min，4°C保溫。PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測產量和特異，并用PCR產物回收試劑盒進行純化(BI0MIGA，上海)。實施例3重組克隆、表達載體pET-20b-7iA xynlOB的構建與驗證
將純化過的PCR產物(實施例2制備)、pET-20b (Novagen)用分別Nde I和Xho I雙酶切，瓊脂糖電泳回收酶切酶切PCR及載體大片段。割膠回收后的目的片段與載體，經濃縮加入8yL無菌水重懸，加入8yL IOXLigase Buffei^PlyL Ligase，于16°C連接過夜。用連接反應產物轉化大腸桿菌pET-20b，然后涂于含IOOy g/mL Amp (氨芐青霉素)的培養皿，37°C培養 10-12 ho
從轉化平板上挑取多個單菌落，采用BI0MIGA的質粒小量提取試劑盒提取質粒。對獲得的質粒雙酶切驗證并對獲得的重組質粒進行測序。測序結果顯示，pET-20b載體中插入了克隆的目的片段(表達木聚糖酶Tth xynlOB的目的片段，1032bp)，進而得到重組克隆、表達載體pET-20b-7從xynlOB, Tth xynlOB的核苷酸如SEQ NO 1所示，其編碼的氨基酸序列如SEQ NO 2所示，將該蛋白命名為Tth xynlOB。實施例4重組木聚糖酶Tth xynlOB的表達與純化
將重組克隆、表達載體pET-20b-7從xynlOB (實施例3制備)電轉至宿主菌^: coliBL21(DE3) (Novagen)，獲得含有重組質粒的重組菌。將單菌落的重組菌接種于5 mL含有100 ii g/ml氨節青霉素的Luria-Bertani broth (LB)培養基,在37°C溫度下,200 rpm震蕩培養8-12 h。將上述4mL菌液接種于含400mL培養基的IOOOmL搖瓶中，37°C溫度下，200rpm震蕩培養，當吸光度達到0. 6-0. 8時，加人200 ii L的IM IPTG，并在30°C溫度下，120rpm誘導表達10-12h。用高速冷凍離心機將培養液在4°C下以13000rpm離心15min，收集菌體。用50mL超純水洗漆并在4°C下以13000rpm離心15min,回收菌體,接著用20mL I XBindingBuffer 重懸(0.5M NaCl, 20mM Tris_HCl，5mM imidazole，pH7. 9)，在冰水浴中，用超聲波 破碎機破碎細菌細胞，并在4°C下13000rpm離心15min，得到含木聚糖酶Tth xynlOB的粗提液。粗提液先經60°C加熱處理30min的熱處理，除去不耐熱的雜蛋白，再用Ni-NTA親和層析柱進行純化(方法見His-Bind Kits,Novagen)。純化酶純度的鑒定和分子量的測定采用SDS-PAGE方法進行，結果見圖1，I即表示純化過后的Tth xynlOB蛋白，分子量約為40kDa,與理論值相近。實施例5重組木聚糖酶Tth xynlOB的酶學性質分析
酶活定義為lmin內催化櫸木木聚糖(sigma)產生Iiimol木糖所需的酶量。( I)最適溫度
用PH值為6. 0的0. IM咪唑-鄰笨ニ甲酸氫鉀緩沖液稀釋實施4中的純酶液，用稀釋后的酶液進行酶活測定。酶活測定反應體系為200 ii L，由1%櫸木木聚糖100 uL,90uL 0. IM咪唑-鄰笨ニ甲酸氫鉀緩沖液和10 y L稀釋酶液組成；反應體系的pH為6. O。將反應體系在60-95°C溫育IOmin后，加入300 u L DNS試劑終止反應，沸水浴5min后測定550nm的吸光值。實驗設3次重復，取平均值作圖，結果如圖2所示，研究結果表明在80°C時，木聚糖具有最高的酶活性，為35U/mg ;將此溫度下的酶活反應體系的吸光值最為相對活性100%，其它溫度下酶活反應體系的吸光值與此最高酶活性體系的吸光值作為相對活性。其中，在溫度60-80°C的反應體系中酶活性較高。(2)最適 pH
酶活性測定體系為200 ii L，由1%櫸木木聚糖IOOii L，pH4. 0-8. 5的90 y L 0. IM咪唑-鄰笨ニ甲酸氫鉀緩沖液和IOyL稀釋酶液組成。將反應體系在95°C溫育IOmin后，カロA 300 u L DNS試劑終止反應，沸水浴5min后測定550nm的吸光值.實驗設3次重復實驗，取平均值，結果如圖3所示，研究結果表明，在pH為6. 0時，木聚糖酶具有最高的酶活性，為35U/mg ;將此pH值下的酶活反應體系的作為相對活性100%，其它pH值下酶活反應體系的吸光值與此最高酶活性體系的吸光值的比值作為相對活性。在PH5. 5-6. 5的條件下，酶活較聞。
(3)重組酶熱穩定性
用PH值為6. O的O. IM咪唑-鄰笨二甲酸氫鉀緩沖液稀釋實施例4中的純酶液，用稀釋后的酶液進行酶活測定。將稀釋酶液在60°C、65°C、7(TC、75°C和80°C和85°C水浴30 min、60 min,90 min和120 min，測定酶的殘存酶活。酶活測定反應體系中pH為6. 0，測定溫度為80°C。實驗設3次重復，取平均值。結果如圖4所示，研究結果顯示， 65°C處理2 h，酶活保持80%以上，可見該木聚糖酶在65°C條件下熱穩定非常好，適宜中溫降解木聚糖。
權利要求
1.一種木聚糖酶基因，其DNA序列如SEQ NO :1所示。
2.—種權利要求I所述木聚糖酶基因的表達蛋白，為適合中溫下半纖維素水解的木聚糖酶，其氨基酸序列如SEQ NO 2所示。
3.—種權利要求I所述木聚糖酶基因的表達蛋白，其特征在于氨基酸序列為權利要求2所述的SEQ NO :2序列中的氨基酸經過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失及添加形成的具有木聚糖酶活性的衍生蛋白質。
4.一種重組載體，其特征在于在所述的重組載體上克隆有如SEQ NO :1所示的DNA序列。
5.一種重組菌，其特征在于在所述的重組菌內克隆有如SEQ NO 1所示的DNA序列。
6.一種用于擴增權利要求I所述的木聚糖酶基因的引物，其特征在于所使用的引物對為Tth-I :5’ -GGAATTCCATATGGGACCACAGCCCATGTCGTC-3’ ；Tth-2 :5’ -CCGCTCGAGCTTGGAAACTGATTCTATTACACTC-3’。
7.權利要求2所述的木聚糖酶在酶解木聚糖中的應用。
8.根據權利要求7所述的應用，其特征在于酶解反應溫度為60-80°C，pH5.5-6. 5。
9.根據權利要求7所述的應用，其特征在于所述的木聚糖來源于纖維原料中的半纖維素，包括櫸木木聚糖、樺木木聚糖和燕麥木聚糖。
10.權利要求4所述的重組載體在酶解木聚糖中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種木聚糖酶基因及其表達蛋白和應用，木聚糖酶基因的氨基酸序列如SEQNO1所示，所表達的適合中溫下半纖維素水解的木聚糖酶，氨基酸序列如SEQNO2所示。該木聚糖酶具有較好的耐熱性能和略偏酸性pH條件下高活性的特性。在80℃、pH為6.0的條件下酶活性最高，比酶活達到35U/mg；該蛋白酶在溫度為60-80℃、pH為5.5-65的范圍內，均具有較高的酶活。該木聚糖酶的耐熱性能較高，在65℃，pH6.0的反應體系中，保溫2h酶活性基本保持不變。上述特性使得本發明得到的木聚糖酶比現有木聚糖酶具有更大的優越性，適用于65℃以上高溫、略偏酸性pH條件下半纖維素的降解，具有潛在的工業應用價值。
文檔編號C12N15/11GK102864160SQ20121033374
公開日2013年1月9日 申請日期2012年9月11日 優先權日2012年9月11日
發明者王飛, 時號, 李迅, 仲惠 申請人:南京林業大學