專利名稱：一種極耐熱木聚糖酶基因及其表達蛋白與應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于基因工程技術及生物質利用領域，具體涉及一種極耐熱木聚糖酶基因及其表達蛋白與應用。
背景技術：
木聚糖是植物細胞壁半纖維素的主要成分，是除纖維素之外自然界中最為豐富的可再生資源。木聚糖酶是木聚糖降解酶系中的最為關鍵的多糖水解酶，通過隨機切割木聚糖的β-1，4-糖苷鍵，將木聚糖水解為木寡糖、低聚木糖及少量的木糖和阿拉伯糖。由于木聚糖酶在造紙工業中紙漿的預漂白、作為添加劑動物提高飼料及烘焙食品的質量及以木聚糖為原料生產功能性低聚木糖等方面都體現出優良特性，因此可作為一種高效的工業酶制 劑。

發明內容
發明目的針對現有技術中存在的不足，本發明的目的是提供一種極耐熱木聚糖酶基因，以使其滿足使用要求。本發明的另一目的是提供一種上述極耐熱木聚糖酶基因的表達蛋白。本發明還有一目的是提供上述一種極耐熱木聚糖酶基因的應用。技術方案為了實現上述發明目的，本發明采用的技術方案如下
一種極耐熱木聚糖酶基因，其DNA序列如SEQ NO 1所示。上述的極耐熱木聚糖酶基因表達的極耐熱木聚糖酶，其氨基酸序列如SEQ NO 2所示。一種極耐熱木聚糖酶，氨基酸序列為權利要求2所述的SEQ NO :2序列中的氨基酸經過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失及添加形成的具有木聚糖酶活性的衍生蛋白質。一種重組體系，在所述的重組體系上克隆有如SEQ NO 1所示的DNA序列；所述的重組體系包括重組質粒和重組菌。一種用于擴增極耐熱木聚糖酶基因的引物，所使用的引物對為
Tth-I :5’ -GGAATTCCATATGGCAGTTGTGGCAAACTACGATTTTGAGAC-3’ ；
Tth-2 :5’ -CCGCTCGAGCTTAGTCAGGATCAGGTTG-3’ 。上述的極耐熱木聚糖酶在酶解木聚糖中的應用。酶解反應溫度為70-100°C，PH5. 5-8. 5。所述的木聚糖來源于纖維原料中的半纖維素，包括櫸木木聚糖、樺木木聚糖和燕麥木聚糖。上述的重組體系在酶解木聚糖中的應用。上述的極耐熱木聚糖酶在酶解玉米秸桿中的應用。有益效果與現有技術相比，本發明所提供的木聚糖酶具有極強的耐熱性能和中性pH條件下高活性的特性，在95°C、pH7. O的條件下酶活性最高，比酶活達到145. 8U/mg ；該蛋白酶在溫度為70°C -100°C、pH為5. 5-8. 5的范圍內，均具有較高的酶活。該木聚糖酶的耐熱性能極高，在85°C、添加終濃度為5mM Ca2+的反應體系中，保溫2h酶活性保持不變。上述特性使得本發明得到的木聚糖酶比現有木聚糖酶具有更大的優越性，適用于80°C以上高溫、中性PH條件下半纖維素的降解，具有潛在的工業應用價值。


圖I是木聚糖酶Tth xynlOA的SDS-PAGE蛋白電泳 圖2是Tth xynlOA的最適溫度結果 圖3是Tth xynlOA的最適pH結果 圖4是Tth xynlOA的熱穩定性結果 圖5是Tth xynlOA降解玉米秸桿半纖維素TLC圖。
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明做進一步的說明。以下實施例中所使用的材料、試劑等，若無特殊說明，均可從商業途徑獲得。實施例I木聚糖酶基因Tth xynlOA的制備
可采用如下人工合成的方式制備似基因，也可以以thermarum的總DNA為模版通過PCR的方式得到。本研究的木聚糖酶基因RA 似通過上海捷瑞生物工程有限公司合成，基因序列如SEQ NO 1所示
實施例2木聚糖酶基因Tth xynlOA的亞克隆 用下述引物對PCR擴增實施例I中的木聚糖酶基因
Tth-I :5’ -GGAATTCCATATGGCAGTTGTGGCAAACTACGATTTTGAGAC-3’ ；
Tth-2 :5’ -CCGCTCGAGCTTAGTCAGGATCAGGTTG-3’ ；
上述引物合成時，Tth-I引入Nde I酶切位點，Tth-2引入Xho I酶切位點。PCR 反應體系I μ L T. thermarum 基因組 DNA, 1μ L Tth-1, IuL Tth-2, 25 μ LPremix ExTaq, 22 μ L 超純水。PCR 反應條件94°C變性 5min ;94°C變性 30sec，52°C退火 30sec，72°C延伸 3min，30Cycles ;72°C延伸 IOmin ;4°C保溫。PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測產量和特異性，并用PCR產物回收試劑盒進行純化(BIOMIGA，上海)。實施例3重組克隆、表達載體pET-20b-7iA xynlOA的構建與驗證
將純化過的PCR產物(實施例2制備)、pET-20b (Novagen)用分別Nde I和Xho I雙酶切，瓊脂糖電泳回收酶切酶切PCR及載體大片段。割膠回收后的目的片段與載體，經濃縮加入8yL無菌水重懸，加入IyL IOXLigase Buffei^PlyL Ligase，于16°C連接過夜。用連接反應產物轉化大腸桿菌pET-20b，然后涂于含IOOy g/mL Amp (氨芐青霉素)的培養皿，37°C培養 10-12h。從轉化平板上挑取多個單菌落，采用BIOMIGA的質粒小量提取試劑盒提取質粒。對獲得的質粒雙酶切驗證并對獲得的重組質粒進行測序。測序結果顯示，pET-20b載體中插入了所克隆的目的片段(核苷酸長度為3474bp)，進而得到重組克隆、表達載體pET-20b-RAxynlOAAth xynlOA的DNA序列如SEQ NO :1所示,其表達的蛋白(極耐熱木聚糖酶)的氨基酸序列如SEQ NO 2所示，將該蛋白命名為Tth XynlOA0實施例4重組木聚糖酶Tth xynlOA的表達與純化
將重組克隆、表達載體pET-20b-RA xynlOA (實施例3制備)電轉至宿主菌疋coliBL21(DE3) (Novagen)，獲得含有重組質粒的重組菌。將單菌落的重組菌接種于5mL含有100 μ g/ml氨節青霉素的Luria-Bertani broth (LB)培養基,在37°C溫度下,200rpm震蕩培養8-12h。將上述4mL菌液接種于含400mL培養基的IOOOmL搖瓶中，37°C溫度下，200rpm震蕩培養，當吸光度達到O. 6-0. 8時，加人200 μ L的IM IPTG，并在30°C溫度下，120rpm誘導表達10-12h。用高速冷凍離心機將培養液在4°C下一下以13000rpm離心15min，收集菌體。用50mL超純水洗漆并在4°C下一下以13000rpm離心15min,回收菌體,接著用20mLIXBinding Buffer 重懸(0.5M NaCl, 20mM Tris_HCl，5mM imidazole，ρΗ7· 9)，在冰水浴中，用超聲波破碎機破碎細菌細胞，并在4°C下13000rpm離心15min，得到含木聚糖酶TthxynlOA的粗提液。粗提液先經70°C加熱處理30min的熱處理，除去不耐熱的雜蛋白，再用Ni-NTA親 和層析柱進行純化(方法見His-Bind Kits,Novagen)。純化酶純度的鑒定和分子量的測定采用SDS-PAGE方法進行，結果見圖1，SI表示pET_20b空質粒表達出的蛋白，S2表示經粗提液中的Tth xynlOA蛋白，S3表示純化過后的Tth xynlOA蛋白，分子量約為130kDa,與理論值相近。實施例5重組木聚糖酶Tth xynlOA的酶學性質分析
酶活定義為lmin內催化櫸木木聚糖(sigma)產生Iymol木糖所需的酶量。( I)最適溫度
用PH值為7. O的0. IM咪唑-鄰笨二甲酸氫鉀緩沖液稀釋實施4得到的純酶液，用稀釋后的酶液進行酶活測定。酶活測定反應體系為200 μ L，由1%櫸木木聚糖100 μ L，90 μ L
0.IM咪唑-鄰笨二甲酸氫鉀緩沖液和10 μ L稀釋酶液組成；反應體系的pH為7. O。將反應體系在60-100°C溫育IOmin后，加入300 μ L DNS試劑終止反應，沸水浴5min后測定550nm的吸光值。實驗設3次重復，取平均值作圖，結果如圖2所示，研究結果表明在95°C時，木聚糖具有最高的酶活性，為145. 8U/mg ;將此溫度下的酶活反應體系的吸光值最為相對活性100%，其它溫度下酶活反應體系的吸光值與此最高酶活性體系的吸光值作為相對活性。其中，在溫度80-100°C的反應體系中酶活性較高。(2)最適 pH
酶活性測定體系為200 μ L，由1%櫸木木聚糖100 μ L，ρΗ4. 0-8. O的90 μ L 0. IM咪唑-鄰笨二甲酸氫鉀緩沖液和IOyL稀釋酶液組成。將反應體系在95°C溫育IOmin后，力口Λ 300 μ L DNS試劑終止反應，沸水浴5min后測定550nm的吸光值，實驗設3次重復實驗，取平均值。結果如圖3所示，研究結果表明，在pH為7.0時，木聚糖酶具有最高的酶活性，為145. 8U/mg ;將此pH值下的酶活反應體系的作為相對活性100%，其它pH值下酶活反應體系的吸光值與此最高酶活性體系的吸光值的比值作為相對活性。在PH5. 5-8. 5的條件下，酶活較高。(3)重組酶熱穩定性
用PH值為7. O的0. IM咪唑-鄰笨二甲酸氫鉀緩沖液稀釋實施例4得到的純酶液，用稀釋后的酶液進行酶活測定。通過對此酶的結構分析，該酶需要Ca2+維持其熱穩定性，所以酶熱穩定的反應體系為200 μ L，由1%櫸木木聚糖100 μ L，88 μ L O. IM咪唑-鄰笨二甲酸氫鉀緩沖液，2yL IOOmM CaCl2和10 μ L稀釋酶液組成。將稀釋酶液在85°C、90°C和95°C水浴30min、60min、90min和120min，測定酶的殘存酶活。酶活測定反應體系中pH為7.0，測定溫度為95°C。實驗設3次重復，取平均值。結果如圖4所示，研究結果顯示，85°C處理2h未見酶活下降，可見該木聚糖在85 °C條件下熱穩定非常好。實施例6重組木聚糖酶Tth xynlOA降解木聚糖的應用研究
將重組木聚糖酶Tth xynlOA再分別作用于櫸木木聚糖、樺木木聚糖和燕麥木聚糖。分別在含有20g/L的上述3種木聚糖溶液中，加入5mg的純化酶(實施例4制備所得)，在85°C的溫度條件下水解lh，經離子色譜檢測，木聚糖轉化生成木糖至木六糖的比率分別為98. 3%，85. 6%及42. 2%，如表I所示。以上研究結果表明該木聚糖酶對樺木木聚糖和櫸木木聚糖的降解性能要明顯強于燕麥木聚糖，因此，該酶特別適用于與樺木木聚糖、櫸木木聚糖結構組成相似的半纖維素原料的降解。 表I重組木聚糖酶Tth xynlOA對櫸木、樺木和燕麥木聚糖的降解
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實施例7重組木聚糖酶Tth xynlOA降解玉米秸桿半纖維素的應用研究 重組木聚糖酶Tth xynlOA對玉米稻桿半纖維的降解研究,具體步驟如下所述
(I)將玉米秸桿用粉碎機粉碎，殘渣干燥后，取IOg加入IOOmL的l%NaOH于85°C水浴震蕩lh。用水將處理后的纖維原料洗至中性，再放置干燥箱中干燥。(2)稱取O. 5g的干燥的纖維原料，加入上述的緩沖溶液20mL與Img的純化酶于20mL的反應體系中，85 °C水浴震蕩lh、2h、3h和4h。(3)分別收集上述lh、2h、3h和4h水解液50yL，13000rpm，20°C條件下離心IOmin,收集上清并于_20°C的冰箱中保存。(4)配置上述水解液適宜的TLC的展層劑和顯色劑，展層劑中正丁醇乙酸水=2 I :1，顯色劑為將Ig的3，5-二羥基甲苯加入到IOOmL的硫酸/甲醇溶液(2 8)中配制而成。(5)用毛細吸管蘸取少量的1%的木I-木4糖的混合液及上述樣品，分別點至寬度為10cm、長度為20cm的玻璃娃膠板上，點完樣后用吹分機吹干并將娃膠板放置于上述展層劑的層析缸中。(6) 3h后取出玻璃板先風干，再放置于100°C的干燥箱中烘干，在通風櫥中用噴壺將硅膠板均勻噴灑，接著在再放置于100°c的干燥箱中烘干。結果如圖5所示，M為木I-木4的標準樣品，1、2、3和4分別為lh、2h、3h和4h的
水解液。研究結果表明，重組木聚糖酶Tth xynlOA可以快速有效地將玉米秸桿降解為低聚木糖，其中木二糖的含量超過50%。
權利要求
1.一種極耐熱木聚糖酶基因，其DNA序列如SEQ NO 1所示。
2.權利要求I所述的極耐熱木聚糖酶基因表達的極耐熱木聚糖酶，其氨基酸序列如SEQ NO 2 所示。
3.一種極耐熱木聚糖酶，其特征在于氨基酸序列為權利要求2所述的SEQ N0:2序列中的氨基酸經過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失及添加形成的具有木聚糖酶活性的衍生蛋白質。
4.一種重組體系，其特征在于在所述的重組體系上克隆有如SEQ NO :1所示的DNA序列；所述的重組體系包括重組質粒和重組菌。
5.一種用于擴增權利要求I所述的極耐熱木聚糖酶基因的引物，其特征在于所使用的引物對為Tth-I :5’ -GGAATTCCATATGGCAGTTGTGGCAAACTACGATTTTGAGAC-3’ ；Tth-2 :5’ -CCGCTCGAGCTTAGTCAGGATCAGGTTG-3’ 。
6.權利要求2所述的極耐熱木聚糖酶在酶解木聚糖中的應用。
7.根據權利要求6所述的應用，其特征在于酶解反應溫度為70-100°C，pH5.5-8. 5。
8.根據權利要求6所述的應用，其特征在于所述的木聚糖來源于纖維原料中的半纖維素，包括櫸木木聚糖、樺木木聚糖和燕麥木聚糖。
9.權利要求4所述的重組體系在酶解木聚糖中的應用。
10.權利要求2所述的極耐熱木聚糖酶在酶解玉米秸桿中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種極耐熱木聚糖酶基因及其表達蛋白與應用，該極耐熱木聚糖酶基因的DNA序列如SEQ NO1所示。極耐熱木聚糖酶基因表達的極耐熱木聚糖酶的氨基酸序列如SEQ NO2所示。該極耐熱木聚糖酶具有極強的耐熱性能和中性pH條件下高活性的特性，在95℃、pH7.0的條件下酶活性最高，比酶活達到145.8U/mg；該蛋白酶在溫度為70-100℃、pH為5.5-8.5的范圍內，均具有較高的酶活。該木聚糖酶的耐熱性能極高，在85℃、添加終濃度為5mMCa2+的反應體系中，保溫2h酶活性保持不變。上述特性使得本發明得到的木聚糖酶比現有木聚糖酶具有更大的優越性，適用于80℃以上高溫、中性pH條件下半纖維素的降解，具有潛在的工業應用價值。
文檔編號C12N1/15GK102864161SQ201210333819
公開日2013年1月9日 申請日期2012年9月11日 優先權日2012年9月11日
發明者王飛, 時號, 李迅 申請人:南京林業大學