一種用于蛋白質或者活性多肽生產和遞送的食品級重組乳酸菌及其制備方法
【專利摘要】本發明涉及一種用于蛋白質或者多肽生產和遞送的食品級重組乳酸菌及其制備方法。其特征在于，其由食品級的thyA基因(胸腺嘧啶合成酶基因)缺陷型乳酸菌菌株和整合到其染色體上的外源蛋白質或者活性多肽的表達框組成。其特征還在于外源蛋白質或者多肽的完整表達框由組成型啟動子序列、信號肽序列和錨定子序列組成(當用于分泌表達時，不包含錨定子序列)。本發明所公布的食品級重組乳酸菌不含有任何新引入的抗生素抗性基因。本發明屬于一個活載體技術平臺，具有良好的通用性，可用于開發活載體疫苗、活載體納米抗體、營養性蛋白質、活性多肽、蛋白類激素、細胞因子等，應用于醫藥、食品、飼料等諸多行業。
【專利說明】一種用于蛋白質或者活性多肽生產和遞送的食品級重組乳酸菌及其制備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種用于蛋白質或者活性多肽生產和遞送的食品級乳酸菌活載體及其制備方法。更具體地說，本發明涉及一種用于生產和遞送抗原蛋白質、抗體蛋白質、營養性蛋白質、活性多肽、蛋白類激素、細胞因子等蛋白質或者活性多肽的食品級重組乳酸菌，及其制備方法。
技術背景[0002]人或動物的胃腸道黏膜、呼吸道黏膜和生殖道黏膜存在著豐富多樣的藥物相關受體，是許多蛋白質或者多肽藥物的靶標。其中，胃腸道系統同時又是一個復雜的大型器官，行使著十分重要的生理功能，包括食物的攝入、免疫調節、能量平衡和新陳代謝等。在胃腸道、呼吸道和生殖道中，存在著大量的微生物，既包括有益菌，如乳酸菌，也包括病原微生物。
[0003]乳酸菌為革蘭氏陽性菌，屬于益生菌。近年來，隨著乳酸菌基因組學的不斷發展和遺傳操作工具的不斷豐富，乳酸菌逐漸發展為理想的生產蛋白質或者活性多肽的細胞工廠和遞送活載體。應用于食品、飲料及飼料產品中的乳酸菌的表達系統必須是食品級的。即所應用的宿主菌、誘導物及載體三者都必須是食品級的。首先，重組蛋白表達所使用的宿主菌必須是安全的、特征清楚且穩定的食品級微生物；其次，誘導物必須是食品級的、可被人食用或對人無害的物質，或溫度、酸誘導等對人體無害的條件；另外，載體也必須是食品級的，不能有非食品級的功能性DNA存在，與食品級表達系統有關DNA必須來源于食品級微生物，且不含抗生素抗性基因，沒有有害化合物產生。這樣的表達系統才適用于大規模工業生產。
[0004]使用乳酸菌作為蛋白質或者活性多肽生產和遞送載體，首先要將乳酸菌菌株改造為一個藥物蛋白質或者多肽的“細胞工廠”，包括:a)建立乳酸菌的營養缺陷型，即將一個乳酸菌生存所必須的基因從染色體敲除(通常為胸苷酸合成酶基因thyA)，這樣，當乳酸菌被人或動物排放到環境中時，乳酸菌細胞會迅速死亡，以避免基因在環境中的擴散；b)構建合適的表達框，以保證目標藥物蛋白質或者多肽能夠在適當的水平進行表達、有效地分泌到細胞外或者展示在乳酸菌細胞壁；c)要保證蛋白質的正確折疊，保持正確的三維結構和生物活性；d)將整個表達框插入到乳酸菌的染色體，并去掉基因操作過程中所引進的所有抗生素抗性基因，以保證產品的生物安全性。然后，重組乳酸菌可以通過常規發酵技術進行發酵生產，經過凍干處理，可以制備成膠囊、片劑或者沖劑，用于直接口服。
[0005]美國專利 “Lactobacilli harboring aggregation gene as a vaccinedelivery vehicle (US006100388A, 2000年)”公布了一種將外源抗原蛋白質與凝聚基因(aggregation gene)或者粘蛋白結合因子融合表達的方法，將羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri)開發為疫苗載體。美國專利 “Bacterial deliveryofbiologically active polypeptides (US8066987B2, 2011 年)”公布了一種使用革蘭氏陰性菌遞送生物活性多肽的方法。本發明所使用的乳酸菌為革蘭氏陽性菌，同時，所使用的遺傳調控元件均不在上述專利所保護范圍。
[0006]使用食品級乳酸菌作為細胞工廠和遞送活載體生產和遞送蛋白質或者活性多肽具有如下優勢:
[0007]I)由于具有良好的安全性，表達外源蛋白質或者活性多肽的食品級重組乳酸菌可以用于直接口服，相對于需要注射的蛋白質或者多肽藥物，口服給藥更易于被患者接受，治療成本更低。該產品也可以直接應用于飼料發酵、飼料添加等。
[0008]2)可以將蛋白質或者多肽隨著乳酸菌高效靶向于消化道黏膜、呼吸道黏膜，或者生殖道黏膜。由于乳酸菌活載體蛋白質或者多肽是由食品級重組乳酸菌在人體或者動物體內原位合成和釋放，這些蛋白質或者多肽可以僅在靶標位置積累起相對較高的濃度，而對于非靶標位置，積累的濃度極低，所以引起的副作用也極低。相比之下，傳統的蛋白質或者多肽需要注射或者靜脈進入人體或者動物體，然后通過遍布全身的循環系統而到達靶標，但同時也大量分布到非靶標組織和器官，既帶來一定的副作用，也是一種浪費。
[0009]3)良好的代謝動力學。在食品級重組乳酸菌定殖于消化道黏膜、呼吸道黏膜，或者生殖道黏膜期間，外源蛋白質或者多肽是隨著乳酸菌細胞的生長和分裂逐漸釋放的。這起到了藥物的緩釋作用，也模擬了動物體自身的細胞因子的合成和釋放過程，符合最理想的藥物代謝動力學要求。而傳統的蛋白質或者多肽藥物由于是一過性給藥，藥物在給藥后迅速達到峰值，而后迅速衰減。
[0010]4)生產十分方便。食品級乳酸菌活載體蛋白質或者活性多肽通過常規的細菌發酵和凍干技術即可生產。凍干的菌粉可以制作成片劑、膠囊或者沖劑。整個制造工藝十分簡單，成本低廉。

【發明內容】

[0011]本發明的目的是提供一種用于蛋白質或者多肽生產和遞送的食品級乳酸菌活載體及其制備方法。
[0012]本發明的特征在于，宿主乳酸菌為thyA基因(胸腺嘧啶合成酶基因)缺陷型；外源蛋白質或者多肽的完整表達框由組成型啟動子序列、信號肽序列和錨定子序列組成(當用于分泌表達時，不包含錨定子序列)。外源蛋白質或者活性多肽的表達框與乳酸菌染色體上的thyA基因通過位點特異性重組發生基因置換而整合到乳酸菌染色體上。基因操作所引入的抗生素抗性基因最終被敲除。
[0013]本發明是通過下述技術方案予以實現的:
[0014]本發明所述的乳酸菌出發菌株是指衛生部頒發的《可用于食品的菌種名單》(衛辦監督發〔2010〕65號)所包含的所有乳酸菌屬所有菌株，即:嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)、干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)、卷曲乳桿菌(Lactobacilluscrispatus)、保加利亞乳桿菌(Lactobacillus bulgaricus)、德氏乳桿菌(Lactobacillusdelbrueckii)、發酵乳桿菌(Lactobacillus fermentium)、格氏乳桿菌(Lactobacillusgasseri)、瑞士乳桿菌(Lactobacillus helveticus)、約氏乳桿菌(Lactobacillusjohnsonii)、副干酪乳桿菌(Lactobacillus paracasei)、植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)、羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri)、鼠李糖乳桿菌(Lactobacillusrhamnosus)、唾液乳桿菌(Lactobacillus salivarius)，以及乳酸乳球菌乳酸亞種(Lactococcus lactis subspecies lactis)等。
[0015]本發明所述的外源蛋白質或者多肽，包括抗原蛋白質、抗體蛋白質、營養性蛋白質、活性多肽、蛋白類激素、細胞因子等。其中細胞因子包括IL-1 β，IL-2，IL-3，IL_4，IL-5，IL-6, IL-7, IL-8, IL-9，IL-10，IL-11，IL-12，IL-13，IL-15，IL-16，IL-17，IL-18，IL-19，IL-20, IL-21, IL-23, IL-24，IL-25，IL-26，IL-32，cMGF, LT, GM-CSF, M-CSF, SCF, IFN- Y ,IFNA，EPO, G-CSF，LIF, OSM, CNTF，GH, PRL, IFNa，IFNP 等。
[0016]本發明所述的外源蛋白質或者多肽，其核苷酸序列都需要根據乳酸菌的密碼子使用偏好性進行優化，以利于在乳酸菌細胞表達。 [0017]本發明所述的啟動子指組成型啟動子。該組成型啟動子是乳桿菌rRNA啟動子的類似序列。本發明所述的基因替換，是通過Cre/lox位點特異性重組實現的。敲除thyA基因的同時，在原位置插入外源蛋白質或者多肽的完整表達框，同時去除抗生素抗性基因。
[0018]本發明所述的外源蛋白質或者多肽，最終被分泌表達到宿主乳酸菌細胞外，或者錨定展示在乳酸菌細胞壁上，是通過與不同的信號肽和錨定子融合表達實現的。
[0019]與現有技術相比，本發明具有以下有益效果:
[0020]I)由于所使用的表達調控元件都來自于乳酸菌細胞自身，外源蛋白質或者多肽的表達框整合到了乳酸菌染色體上，并且基因操作過程中所引入的抗生素抗性基因最后都被去除，所以最終的乳酸菌活載體蛋白質或者多肽是真正的食品級產品，符合生物安全要求。
[0021]2)本發明所述乳酸菌活載體蛋白質或者多肽，可以通過口服、滴鼻、生殖道使用，直接靶向消化道、呼吸道或者生殖道黏膜，并在原位合成和釋放蛋白質或者多肽，因而其生產和使用成本是十分低廉的。
[0022]3)由于外源蛋白質或者多肽的表達框存在于染色體而不是質粒上，重組乳酸菌在繼代培養時性狀更加穩定，不會產生由于質粒丟失而導致的菌種退化問題，又由于使用非誘導型啟動子，發酵時不需要使用誘導物，因而生產十分簡便。
[0023]4)食品級乳酸菌活載體屬于一個技術平臺，具有良好的通用性，可用于開發抗原蛋白質、抗體蛋白質、營養性蛋白質、活性多肽、蛋白類激素、細胞因子等，應用于醫藥、食品、飼料等諸多行業。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0024]附圖1:外源蛋白質或者活性多肽的分泌表達框。
[0025]附圖2:外源蛋白質或者活性多肽的細胞壁展示表達框。
【具體實施方式】
[0026]下面結合具體實例，對本發明做進一步說明。本發明的保護范圍并不限定于下列實例。
[0027]實施例1:外源蛋白質或者多肽的編碼基因核苷酸序列優化。
[0028]為了使外源蛋白質或者多肽能夠在乳酸菌順利和高效表達，需要對其編碼基因的核苷酸序列根據乳酸菌對密碼子的使用偏好性進行優化，以去除稀有密碼子。
[0029]優化的原則為:TTC— TTT ；GTA — GTT ；TCC — TCT ；GAG — GAA ；TGC — TGT ；AGA — CGT ；AGG — CGT[0030]實施例2:蛋白質表達框的構建
【權利要求】
1.經過基因工程改造的食品級乳酸菌活載體，用于蛋白質或者活性多肽生產和遞送。其特征在于，其包括表達和生產外源蛋白質或者活性多肽的thyA基因缺失的乳酸菌菌株，插入到乳酸菌染色體的外源蛋白質或者活性多肽的表達框。
2.按照權利要求1的乳酸菌菌株，包括嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)、干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)、卷曲乳桿菌(Lactobacillus crispatus)、保加利亞乳桿菌(Lactobacillus bulgaricus)、德氏乳桿菌(Lactobacillus delbrueckii)、發酵乳桿菌(Lactobacillus fermentium)、格氏乳桿菌(Lactobacillus gasseri)、瑞士乳桿菌(Lactobacillus helveticus)、約氏乳桿菌(Lactobacillusjohnsonii)、副干酪乳桿菌(Lactobacillusparacasei)、植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)、羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri)、鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus)、唾液乳桿菌(Lactoba cillus salivarius),以及乳酸乳球菌乳酸亞種(Lactococcus lactissubspecies lactis)等。
3.按照權利要求1的重組乳酸菌菌株，外源蛋白質或者活性多肽的表達框通過與thyA基因的置換而整合到乳酸菌染色體上，并敲除了抗生素抗性基因。
4.按照權利要求1的外源蛋白質或者活性多肽，是指抗原蛋白質、抗體蛋白質、營養性蛋白質、活性多肽、蛋白類激素、細胞因子等。其中細胞因子包括IL-1 β，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5, IL-6, IL-7, IL-8， IL-9， IL-10， IL-11， IL-12， IL-13， IL-15， IL-16， IL-17， IL-18，IL-19, IL-20, IL-21, IL-23，IL-24，IL-25，IL-26，IL-32，cMGF, LT, GM-CSF, M-CSF, SCF，IFN- Y , IFNA，EPO, G-CSF, LIF, OSM, CNTF，GH, PRL, IFNa，IFNP 等。
5.按照權利要求1的外源蛋白質或者活性多肽，其特征在于，其編碼基因的核苷酸序列已經根據乳酸菌對密碼子的使用偏好性進行了優化。其優化原則為:
TTC — TTT ；GTA — GTT ；TCC — TCT ；GAG — GAA ；TGC — TGT ；AGA — CGT ；AGG — CGT
6.按照權利要求1的納米抗體或者親和多肽表達框，其特征在于，其包括組成型啟動子序列、信號肽序列和錨定子序列(當用于分泌表達時，不包含錨定子序列)。
7.按照權利要求6的組成型啟動子序列，其特征在于，是下列序列中的一種，或者與下列序列的相似性超過85 %的序列中的一種:
1)GTCGGT CGA GTT GTT GAC AGG ATA AAG GTC GCC TGG TAT GGT CTC AATATA GCG
2)GTCGTG GCA GTT GTT GAC AAC CTG TGG GCG GTT TGA TTT GTT CTT GCTATA GCG
3)ACCGAG CCA GTT GTA GAC AGG GCT GTG CTG ACC TGG TAA GGT ATA TTATAG CG
4)GAGCTG CGA GTT GTT GAC ATT GTT AAT GGC CCC TGA TAT ATT TGG CGTATA GCG
5)GGGGTA GTT GTT GAC AGC GTG GGT TGG TGC TGG TAA TTT TGC GCT ATAGCG
6)GAGTCT TGC GCT ATA GTT GTT GTC AGA ATG GAG ATA CTA TGA TAT AATGTT GCTATA GCG
7)AGGGAG TGA GTT GTG ACA GGG CTG TGA TGG TGT GGT ATT GTT TTG GTATAG CG
8)ACGAGT TGT TGG TAT TGT GGC GGT ATA GCG
9)AGGGGT TGA GTT TGA CAC TGA TCC CGG CTG GTG GTA AAT TTT CGT TATAGC G
8.按照權利要求6的信號肽序列，其特征在于，是下列序列中的一種，或者與下列序列的相似性超過85 %的序列中的一種:
DATT AAT GAT TCA ACC ACG GTT GAA CCA GTG CTG GAT GGC CCG TAT CAGCCA ACTACA TTT MA CCG CCA AAC GAT TAT TGG TTG CTG ATT AGT AGCAAT ACC GAT GGT GTT GTGTAC
2)AAACCG CCA AAC GAT TAT TGG TTG CTG ATT AGT AGC AAT ACC GAT GGTGTT GTGTAC GAA AGC ACT AAC AAC TCA GAT TTC TGG ACA GCG GTT ATTGCC GTG GAACCG CGT GTTTCA
3)TAAACG GAT AAC CAA AAT ACG GGC TAA CAT CAT CGT CAT GGT TTG CCATTA CTGCCA GTT TGG CCG CTC GTC GTC ATC TCT TTC GGG GGT GTG TCAATC TGG GTG GTT GAT GCTTGA TCT
4)TTTAGC AAT CGT CGC ACC TTA ACG AGT AAC AAC CGT TTA GTT GGT ATGTTG AAGTAT GGT GGC CGC GTG TGG ACC TTT CAT GGC GAA ACG CCA CGTGCG ACC ACG GAT AGT AGCAAC
5)ATTTAT CGT CAG CTG TTA ACC AAT TCA TAT TCT GTT GAT CTG CAC GATGAA ATCGAA CAA ATC GGT AGC GAA AAG ACC CAG AAC GTG ACG ATT AATCCG GGC CCATTT GCG CAAACC CGT
6)AAATTG ATG ATC TTA GGC ATG CTC GTT TTT AAA ATT AAT AAG GGG GTAACG GGGGCA ACA ATG GCG CAT GCT AGC ATC AAT CCT GAA ATG ACG ACCGCA GCC
7)TTAACG AGT AAC AAC CGT TTA GTT GGT ATG TTG AAG TAT GGT GGC CGCGTG TGGACC TTT CAT GGC GAA ACG CCA CGT GCG ACC ACG GAT AGT AGCAAC ACT GCC GAT CTG AATAAC ATT
8)GCCGTG GAA CCG CGT GTT TCA CAA ACG AAT CGC CAG TAT ATT CTG TTTGGT GAAMC AAG CAA TTC AAC ATC GAA MC AAC AGT GAT AAA TGG AAGTTT TTC GAA ATG TTC AAG
9.按照權利要求6的錨定子序列，其特征在于，是來自于以下蛋白質的LPXT-模序細胞壁錨定結構域(LPXTG-motifcell wall anchor domain)之一，這些蛋白質在GenBank的編碼如下:
YP_005872271、YP_005873461、CCC77736、CCC77890、CCC78260、CCC78361、
CCC78381、CCC78520、CCC78612、CCC78778、CCC79729、ΥΡ_005873877、
ΥΡ_005873931、ΥΡ_005873973、ΥΡ_005874035、ΥΡ_005861438 等。
10.按照權利要求1的重組乳酸菌菌株，可以用于生產并將蛋白質或者活性多肽遞送到消化道、呼吸道或者生殖道。
【文檔編號】C12R1/46GK103667164SQ201210334194
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2012年9月10日 優先權日:2012年9月10日
【發明者】劉占良, 劉戰征, 劉占術 申請人:劉占良, 劉戰征, 劉占術