專利名稱：重組陽離子抗菌肽g13大腸桿菌基因工程菌及其構建方法
技術領域：
本發明涉及重組陽離子抗菌肽G13大腸桿菌基因工程菌及其構建方法，屬于屬于基因工程和生物技術領域。
背景技術：
抗菌肽是在誘導條件下，生物體免疫防衛系統產生的小分子活性肽類，廣泛分布于植物，動物以及人類。抗菌肽是由基因編碼、由核糖體合成的。目前已經發現、鑒定的抗菌肽已超過千種，大多帶凈正電荷。從結構上看可以分為α -螺旋型、β -折疊型、富含二硫鍵的、富含脯氨酸的等多種類型。抗菌肽對革蘭氏陰性及陽性細菌均有很強的殺滅作用，有些抗菌肽還可以特異性地抑制某些腫瘤細胞的生長。抗菌肽可以用于醫藥衛生、食品工業 等方面。在醫藥衛生方面，抗菌肽與抗生素最大的不同之處在于抗菌肽的應用可以解決抗藥性的問題。具有與抗生素完全不同殺菌機理的抗菌肽的應用或許可以為這些問題的解決提供途徑。在食品工業上抗菌肽的應用主要是食品添加劑。抗菌肽的殺菌能力很強，并且對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌有廣泛的殺菌作用，因此可以代替傳統的食品防腐劑，起到保鮮作用。同時又由于它是一種肽，可以被消化道消化、吸收對人體無害。此外，抗菌肽在、畜牧業、農業等各個方都有十分廣泛的應用。研究其大規模生產具有十分積極的意義。目前，生產抗菌肽的方法主要有三種1.直接從生物體中提取天然抗菌肽抗菌肽廣泛存在于低等到高等動物的特定組織中，但是含量非常少，且提取工藝復雜，成本昂貴，難以滿足大規模生產的要求；2.化學方法合成抗菌肽化學合成法成本高，同時難以保證合成肽類的天然結構和生物活性，嚴重影響其廣泛應用；3基因工程方法采用該方法是如今研究的熱點，也是獲得抗菌肽的有效途徑之一。

發明內容
本發明要解決的技術問題之一是提供一種重組陽離子抗菌肽G13大腸桿菌基因工程菌，對于陽離子抗菌肽而言，融合蛋白所帶的負電荷可以有效避免抗菌肽對宿主菌的毒性，有利于其產量的提高。本發明是通過以下技術方案來實現的。一種重組陽離子抗菌肽G13大腸桿菌基因工程菌，其含有核苷酸序列為SEQ ID N0 I CAGCGTTCTGTGTCTAACGCAGCAACTCGTGTGTGCCGTACTGGTCGTTCTCGTTGG ；SEQ ID N02 CACCATCATCATCATCATATGGCAGAACAAAGCGACAAGGATGTGAAGTACTACACTCTGGAGGAGATTCAGAAGCACAAAGACAGCAAGAGCACCTGGGTGATCCTACATCATAAGGTGTACGATCTGACCAAGTTTCTCGAAGAGCATCCTGGTGGGGAAGAAGTCCTGGGCGAGCAAGCTGGGGGTGATGCTACTGAGAACTTTGAGGACGTCGGGCACTCTACGGATGCACGAGAACTGTCCAAAACATACATCATCGGGGAGCTCCATCCAGATGACAGATCAAAGATAGCCAAGCCTTCGGAAACCCTT ；
編碼的氨基酸序列為SEQ ID N03 QRSVSNAATRVCRTGRSRff ；SEQ ID N04 HHHHHHMAEQ SDKDVKYYTLEEIQKHKD SKSTffVILHHKVYDLTKFLEEHPGGEEVLGEQAGGDATENFEDVGHSTDARELSKTYIIGELHPDDRSKIAKPSETL。本發明要解決的技術問題之二是提供一種構建上述工程菌的方法。一種構建上述重組陽離子抗菌肽G13大腸桿菌基因工程菌的方法，其步驟為
(I)以含有G13基因序列的質粒為模板，在G13上游設置NcoI酶切位點進行PCR擴增，引物為G13F:5’ -CATGCCATGGATCAGCGTTCTGTGTCTAAC-3’，G13R: 5，-ACTGGTCGTTCTCGTTGG-3，；(2)以含有融合蛋白基因的質粒為模板，在序列下游設置EcoRI酶切位點進行PCR擴增，引物為CF :5，-CACCATCATCATCATCAT-3，，CR: :5，-GGAATTCTTAAGGGTTTCCGAAGGCTT-3，；(3)將G13基因PCR產物和融合蛋白基因PCR產物等量混合，磷酸化后進行連接，再引入(I)中的引物G13F和(2)中的引物CR進行PCR擴增；(4)將(3)的PCR產物通過DNA重組克隆至載體質粒pET-22b_G13C，轉化大腸桿菌BL21感受態細胞，氨芐青霉素篩選陽性重組子；(5)將(4)的產物振蕩培養至對數期，通過誘導劑誘導后收集菌體。進一步地，上述PCR擴增反應條件均為94°C 45s，50°C 45s，72°C 30s, 30個循環，72°C lOmin，并且，反應產物均用1. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。進一步地，上述步驟(3)中，混合物是由T4PNK進行磷酸化后用T4DNA連接酶連接。進一步地，上述步驟(4)中，PCR產物用EcoRI和NcoI酶切，經純化后用T4DNA連接酶連接得到載體質粒pET-22b-G13C。進一步地，上述步驟(5)，將步驟(4)產物接種至含有50ug/ml氨芐青霉素的LB培養基中37°C過夜振蕩培養，按1%量接入新鮮的LB培養基，37°C振蕩培養至0D600 ^ O. 5時,加入終濃度lmmol/L的IPTG,30°C誘導6h,9000r/min離心Imin,收集菌體。采用融合表達的辦法有效得解決了本發明要解決的技術問題。在誘導表達后，可以除去融合蛋白，恢復其活性。這樣可以大量獲得抗菌肽。融合蛋白的大小、氨基酸類型、與抗菌肽的位置關系，影響著融合表達的效率。對于陽離子抗菌肽而言，融合蛋白所帶的負電荷可以有效避免抗菌肽對宿主菌的毒性，有利于其產量的提高，根據不同抗菌肽的結構特點，融合頭可能位于抗菌肽N端或C端而起到效果。本發明在陽離子抗菌肽G13的C端添加融合頭序列。本發明的科學原理為陽離子抗菌肽的正電荷有利于其與細胞膜的結合，融合蛋白的所帶的負電荷則有利于中和這些正電荷，降低其對宿主菌的毒性。融合蛋白設計在其尾端，也可以對抗菌肽的毒性起到一定的抑制作用，從而提高其產量。本發明的有益效果在于高效穩定表達，表達的融合蛋白為可溶狀態，避免了尿素溶解包涵體這一步驟。可以在G13與融合頭之間添加化學切割位點，使得切割與純化成本低廉。


圖1為誘導表達效果對比圖；圖2為質粒構建示意圖。
具體實施例方式下面根據附圖和實施例對本發明 作進一步詳細說明。重組陽離子抗菌肽G13大腸桿菌基因工程菌，其含有核苷酸序列為SEQ ID N0 I CAGCGTTCTGTGTCTAACGCAGCAACTCGTGTGTGCCGTACTGGTCGTTCTCGTTGG ；SEQ ID N02 CACCATCATCATCATCATATGGCAGAACAAAGCGACAAGGATGTGAAGTACTACACTCTGGAGGAGATTCAGAAGCACAAAGACAGCAAGAGCACCTGGGTGATCCTACATCATAAGGTGTACGATCTGACCAAGTTTCTCGAAGAGCATCCTGGTGGGGAAGAAGTCCTGGGCGAGCAAGCTGGGGGTGATGCTACTGAGAACTTTGAGGACGTCGGGCACTCTACGGATGCACGAGAACTGTCCAAAACATACATCATCGGGGAGCTCCATCCAGATGACAGATCAAAGATAGCCAAGCCTTCGGAAACCCTT ；編碼的氨基酸序列為SEQ ID N03 QRSVSNAATRVCRTGRSRff ；SEQ ID N04 HHHHHHMAEQSDKDVKYYTLEEIQKHKDSKSTWVILHHKVYDLTKFLEEHPGGEEVLGEQAGGDATENFEDVGHSTDARELSKTYIIGELHPDDRSKIAKPSETL。本發明要解決的技術問題之二是提供一種構建上述工程菌的方法。一種構建上述重組陽離子抗菌肽G13大腸桿菌基因工程菌的方法，其步驟為(I)以含有G13基因序列的質粒為模板，在G13上游設置NcoI酶切位點進行PCR擴增，PCR擴增反應條件均為94°C 45s, 50°C 45s, 72°C 30s，30個循環，72°C lOmin，反應產物用1. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，引物為G13F : 5 ’ -CATGCCATGGATCAGCGTTCTGTGTCTAAC-3，，G13R:5，-ACTGGTCGTTCTCGTTGG-3’ ；(2)以含有融合蛋白基因的質粒為模板，在序列下游設置EcoRI酶切位點進行PCR擴增，PCR擴增反應條件均為94V 45s, 50°C 45s, 72°C 30s, 30個循環，72°C lOmin，反應產物用1. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，引物為CF :5，-CACCATCATCATCATCAT-3，，CR: :5，-GGAATTCTTAAAGGGTTTCCGAAGGCTT-3，；(3)將G13基因PCR產物和融合蛋白基因PCR產物等量混合，混合物是由T4PNK進行磷酸化后用T4DNA連接酶連接，磷酸化后進行連接，再引入(I)中的引物Gl3F和(2 )中的引物CR進行PCR擴增；(4)將(3)的PCR產物用EcoRI和NcoI酶切，經純化后用T4DNA連接酶連接得到載體質粒pET-22b-G13C，轉化大腸桿菌BL21感受態細胞，氨芐青霉素篩選陽性重組子；其中，圖2為質粒構建示意圖，參照圖2，G13基因的3’端連接上CHERRY基因，插入到載體質粒pET22b (+)。(5)將步驟(4)產物接種至含有50ug/ml氨芐青霉素的LB培養基中37°C過夜振蕩培養，按1%量接入新鮮的LB培養基，37°C振蕩培養至0D600 ^ O. 5時，加入終濃度Immol/L 的 IPTG,30°C誘導 6h,9000r/min 離心 Imin,收集菌體。工程菌經IPTG誘導表達，破碎，取樣做SDS-PAGE檢測，圖1為誘導表達效果對比圖，參照圖1，標記I為未誘導對照，標記2為誘導的基因工程菌，標記3為分子量標準。 上述實施例只為說明本發明的技術構思及特點，其目的在于讓熟悉此領域技術的人士能夠了解本發明內容并加以實施，并不能以此限制本發明的保護范圍。凡根據本發明精神實質所作的等效變化或修飾，都應涵蓋在本發明的保護范圍內。
權利要求
1.一種重組陽離子抗菌肽G13大腸桿菌基因工程菌，其特征在于，其含有核苷酸序列為SEQ ID N0 I CAGCGTTCTGTGTCTAACGCAGCAACTCGTGTGTGCCGTACTGGTCGTTCTCGTTGG ；SEQ ID N02 CACCATCATCATCATCATATGGCAGAACAAAGCGACAAGGATGTGAAGTACTACACTCTGGAGGAGATTCA GAAGCACAAAGACAGCAAGAGCACCTGGGTGATCCTACATCATAAGGTGTACGATCTGACCAAGTTTCTCGAAGAG CATCCTGGTGGGGAAGAAGTCCTGGGCGAGCAAGCTGGGGGTGATGCTACTGAGAACTTTGAGGACGTCGGGCACT CTACGGATGCACGAGAACTGTCCAAAACATACATCATCGGGGAGCTCCATCCAGATGACAGATCAAAGATAGCCAA GCCTTCGGAAACCCTT ；編碼的氨基酸序列為SEQ ID N03 QRSVSNAATRVCRTGRSRff ；SEQ ID N04 HHHHHHMAEQSDKDVKYYTLEEIQKHKDSKSTWVILHHKVYDLTKFLEEHPGGEEVLGEQAGGDATENFEDVGHSTDARELSKTYIIGELHPDDRSKIAKPSETL。
2.—種構建如權利要求1所述的重組陽離子抗菌肽G13大腸桿菌基因工程菌的方法， 其特征在于，步驟為(1)以含有G13基因序列的質粒為模板，在G13上游設置NcoI酶切位點進行PCR擴增， 引物為G13F :5’ -CATGCCATGGATCAGCGTTCTGTGTCTAAC-3’，G13R:5’ -ACTGGTCGTTCTCGTTGG-3’ ；(2)以含有融合蛋白基因的質粒為模板，在序列下游設置EcoRI酶切位點進行PCR擴增，引物為CF :5，-CACCATCATCATCATCAT-3，，CR: :5’-GGAATTCTTAAAGGGTTTCCGAAGGCTT-3，；(3)將G13基因PCR產物和融合蛋白基因PCR產物等量混合，磷酸化后進行連接，再引 A(I)中的引物G13F和(2)中的引物CR進行PCR擴增；(4)將(3)的PCR產物通過DNA重組克隆至載體質粒pET_22b_G13C，轉化大腸桿菌BL21 感受態細胞，氨芐青霉素篩選陽性重組子；(5)將(4)的產物振蕩培養至對數期，通過誘導劑誘導后收集菌體。
3.根據權利要求2所述的構建重組陽離子抗菌肽G13大腸桿菌基因工程菌的方法， 其特征在于，所述PCR擴增反應條件均為94°C 45s, 50°C 45s, 72°C 30s，30個循環，72°C IOmin,并且，反應產物均用1. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。
4.根據權利要求2所述的構建重組陽離子抗菌肽G13大腸桿菌基因工程菌的方法，其特征在于，所述步驟(3)中，混合物是由T4PNK進行磷酸化后用T4DNA連接酶連接。
5.根據權利要求2所述的構建重組陽離子抗菌肽G13大腸桿菌基因工程菌的方法，其特征在于，所述步驟(4)中，PCR產物用EcoRI和NcoI酶切，經純化后用T4DNA連接酶連接得到載體質粒pET-22b-G13C。
6.根據權利要求2所述的構建重組陽離子抗菌肽G13大腸桿菌基因工程菌的方法，其特征在于，所述步驟(5)，將步驟(4)產物接種至含有50ug/ml氨芐青霉素的LB培養基中 37°C過夜振蕩培養，按1%量接入新鮮的LB培養基，37°C振蕩培養至0D600 ^ O. 5時，加入終濃度Immol /I,的IPTG,30°C誘導6h,9000r/min離心Imin,收集菌體。
全文摘要
本發明公開了重組陽離子抗菌肽G13大腸桿菌基因工程菌及其構建方法，本發明的原理為，陽離子抗菌肽的正電荷有利于其與細胞膜的結合，融合蛋白的所帶的負電荷則有利于中和這些正電荷，降低其對宿主菌的毒性。融合蛋白設計在其尾端，也可以對抗菌肽的毒性起到一定的抑制作用，從而提高其產量。本發明的有益效果在于高效穩定表達，表達的融合蛋白為可溶狀態，避免了尿素溶解包涵體這一步驟。可以在G13與融合頭之間添加化學切割位點，使得切割與純化成本低廉。
文檔編號C12N1/21GK102994434SQ20121033841
公開日2013年3月27日 申請日期2012年9月13日 優先權日2012年9月13日
發明者查向東, 惲輝, 余忠麗, 程林春, 趙大偉 申請人:安徽希普生物科技有限公司